參桂保心濃煎劑對心衰大鼠NT-pro BNP 及Caspase-3的影響*

馬曉慶，鐘　栩，黨嬋娟甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅　蘭州730000；2甘肅省第三人民醫(yī)院；3甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院

參桂保心濃煎劑對心衰大鼠NT-pro BNP 及Caspase-3的影響*

馬曉慶1，2，鐘栩3△，黨嬋娟1
1甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅蘭州730000；2甘肅省第三人民醫(yī)院；3甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院

目的：探討參桂保心濃煎劑對異丙腎上腺素（Isoproterenol，ISO）誘導左心室功能不全大鼠血清N-端腦鈉肽前體（NT-pro BNP）和心肌半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的影響。方法：將50只雄性Wistar大鼠隨機分模型組，低、中、高劑量組和空白組，每組10只。模型組予致心力衰竭劑量（85mg/kg）ISO后給予等容量的生理鹽水，空白組不予任何干預，余各組ISO給藥后予低、中、高劑量的參桂保心濃煎劑治療，8周后采用ELISA法測NT-pro BNP含量，HE染色觀察心肌組織形態(tài)學，免疫組化檢測Caspase-3蛋白表達。結(jié)果：1）與模型組相比，各藥物組均可降低NT-pro BNP水平（P＜0.01），但仍高于空白組（P＜0.01），與中劑量相比，低劑量組無明顯差別（P＞0.05），高劑量組顯著下降（P＜0.01）。2）與模型組相比，各藥物組均能抑制Caspase-3表達（P＜0.01），但仍高于空白組（P＜0.01），其抑制作用高劑量組強于中劑量組（P＜0.01），中劑量組強于低劑量組（P＜0.05）。結(jié)論：參桂保心濃煎劑能降低ISO誘導的左心室功能不全大鼠NT-pro BNP水平，改善心功能，可能機制是抑制Caspase-3過度表達，阻斷細胞凋亡。

心力衰竭；NT-pro BNP；Caspase-3；參桂保心濃煎劑

心力衰竭（簡稱心衰）是心臟病患者死亡的主要原因。1996年Sharov等［1］在心衰狗模型中發(fā)現(xiàn)了凋亡細胞，首次證實了心肌細胞凋亡與心力衰竭的關(guān)系。近10年研究認為心肌細胞凋亡是心力衰竭重要的病理生理機制之一，抑制細胞凋亡可減輕心臟重塑，改善心衰［2］。Caspase-3是凋亡途徑最重要的執(zhí)行性Caspase酶原，Caspase-3的激活，細胞將不可避免地發(fā)生凋亡［3］。心衰時，心肌分泌的BNP及NT-Pro BNP是國際公認的心衰血漿標志物，研究指出NT-pro BNP在心功能受損時具有更高的敏感性，是心衰早期診斷、評價療效和預后更有優(yōu)勢的指標［4］。本實驗通過觀察參桂保心濃煎劑對早期心衰大鼠血清NT-pro BNP水平及心肌細胞Caspase-3表達的影響，評價早期應用該藥對心衰的防治作用及其機制。

1　材料與方法

1.1動物與分組SPF級Wi s t a r雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，8～10周齡，購自甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心，隨機分為空白組，模型組，參桂保心濃煎劑低、中、高劑量組，每組10只。實驗動物許可證號：SYXK(甘)2015-0005，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK(甘)2015-0002。

1.2藥物與試劑鹽酸異丙腎上腺素(I SO，美國Sigma公司，上海伊卡公司分裝)；水合氯醛(大連美侖生物有限公司，批號20120324)；參桂保心濃煎劑藥物組成：西洋參、麥冬、五味子、桂枝、白術(shù)、茯苓、豬苓、澤瀉、車前子、丹參、葶藶子、大棗，由甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑科制備。大鼠NT-Pro BNP ELISA檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；大鼠Caspase-3檢測試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；SP即用型檢測試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3儀器Be n c hma r k P l s連續(xù)波長酶標儀(美國BioTek公司提供)；ASP200S自動組織脫水機(德國Leica公司提供)；FINESSE 325石蠟切片機(美國Thermo公司提供)；3K15臺式高速冷凍離心機(美國SIGMA公司提供)；KD-BL石蠟組織包埋機(科迪儀器設備公司提供)；RHY-3病理組織漂烘儀(中威電子儀器有限公司提供)；BH-50光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司提供)；DW-86L386低溫冰箱(日本SANYO有限公司提供)。

1.4給藥方法空白組不予任何干預，余4組采用皮下注射ISO 85mg/kg，1次/d，共2次造模。ISO給藥結(jié)束后間隔24小時低、中、高劑量組分別予參桂保心濃煎劑6.5、13、26 g/(kg·d)(根據(jù)人鼠體表面積等效量換算比率計算，每kg體質(zhì)量大鼠給藥劑量是6倍人每kg劑量)，每日1次灌胃；模型組予等容量生理鹽水1次/d灌胃。

1.5指標檢測各組大鼠在相同條件下飼養(yǎng)，8周后對所有存活大鼠進行血清NT-pro BNP測定，各組隨機選5只進行HE染色，免疫組化染色，進行Caspase-3表達免疫組化評分。

1.5.1血清NT-P r o BNP檢測1 0%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，采用摘眼球取血方法取血3mL，高速低溫(3 000 rpm，4℃)離心10分鐘，取血清標記，隨后將標本置于-20℃冰箱保存，備檢。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定大鼠血清NT-Pro BNP的水平，嚴格按照說明書步驟操作。

1.5.2 HE染色采血后，立即摘除大鼠心臟并放置于4℃生理鹽水中沖洗心腔內(nèi)殘余血液，濾紙吸干水分，沿大鼠心臟縱軸切取左心室中段心肌，浸入10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，漂片，攤片，烘片，標記備用。隨后切片脫蠟，水化，蘇木精染色，分色，返藍，伊紅液色，沖洗，脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)學。

1.5.3心肌Ca s p a s e-3表達檢測切片脫蠟，水化，高壓高溫抗原修復，采用SABC免疫組化方法，一抗用1∶200的大鼠Caspase抗體，并以PBS代替一抗作陰性對照片，顯微鏡下觀察，切片中以細胞胞漿呈淡黃色，棕黃色，棕褐色為陽性細胞判斷標準，分別取5個高倍視野(×400)，參考許良中［5］免疫組織化學反應結(jié)果的判斷標準，采用染色強度及染色面積的乘積計算該切片的免疫組化評分(IHS)，最后取5個視野的平均值。

1.6統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用SPSS 1 7.0統(tǒng)計軟件包處理，計量資料以(±s)表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1血清NT-P r o BNP結(jié)果與空白組比較，模型組NT-Pro BNP含量顯著升高(P＜0.05)。與模型組比較，各藥物組能夠降低NT-Pro BNP，但仍與空白組有差異，各藥物組組間比較，低、中劑量組NT-Pro BNP下降無明顯差異，高劑量顯著優(yōu)于中劑量(P＜0.05)，見表1。

表1　各組大鼠NT-ProBNP結(jié)果比較?χ±s)

2.2HE染色空白組心肌細胞排列整齊，心肌纖維走形清晰，細胞核無深染，胞漿均勻著色，細胞間質(zhì)無水腫及炎性細胞浸潤。模型組心肌纖維走形紊亂，細胞水腫，胞漿著色變淺，胞核出現(xiàn)空泡樣及深染改變，可見少量炎細胞；參桂保心濃煎劑高劑量組心肌纖維走形基本正常，心肌細胞有輕度水腫，無炎性細胞浸潤，中低劑量組介于高劑量與模型組之間。

3　c a s p a s e-3免疫組化檢測

3.1鏡下觀察空白組大鼠左室心肌細胞僅有極少量標記，散在分布，胞漿呈淡黃色。心衰模型組陽性心肌細胞胞漿染色程度強，呈棕褐色，表達面積廣泛，融合。各中藥治療組陽性細胞染色強度及面積均低于模型組，高于空白組，Caspase-3染色強度由強到弱依次為低劑量組(棕褐色，棕黃色)，中劑量組(棕黃色)，高劑量組(黃色)，見圖1—3。

圖1　免疫組化Ca s p a s e-3空白組（400×）

圖3　免疫組化Ca s p a s e-3高劑量組（400×）

3.2免疫組化評分與空白組比較，模型組表達升高(P＜0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組均能夠降低Caspase-3表達(P＜0.05)，但組間比較，其下降程度高劑量組優(yōu)于中劑量組(P＜0.05)，中劑量組優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)，見表2。

表2　各組大鼠免疫組化評分結(jié)果比較?±s)　分

4　討論

研究表明ISO誘導心衰模型，85mg/kg及以上劑量多誘導不可逆性心肌缺血壞死，纖維化及心肌重塑損傷，故在探討心室重構(gòu)、炎性介質(zhì)，細胞凋亡等相關(guān)指標時有顯著優(yōu)勢［6］。B-型利鈉肽(BNP)在心衰的診斷與鑒別診斷、程度分級、評估療效、指導用藥及預測預后有重要意義，2001年已被歐洲心臟病協(xié)會列入心衰指南。NT-pro BNP半衰期為BNP的3～6倍，其個體變異小，且與BNP檢測方法一致，是更具優(yōu)勢的評價心衰發(fā)生、發(fā)展的血漿檢測指標。Emdin M等［7］研究提示NT-pro BNP對早期輕度心力衰竭的診斷價值高于BNP。Maisel AS等［8］研究表明血漿NT-pro BNP水平與心衰程度密切相關(guān)。故該指標可作為檢測心衰發(fā)生、發(fā)展的敏感指標。本實驗早期給予參桂保心濃煎劑干預，可降低NT-Pro BNP水平，減輕心肌組織病理形態(tài)學變化，改善心功能，尤其高劑量組作用顯著。

越來越多研究支持細胞凋亡導致心肌細胞持續(xù)低水平的丟失與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展存在因果關(guān)系。在細胞凋亡機制的研究中發(fā)現(xiàn)Caspase-3是內(nèi)源性凋亡通路和外源性凋亡通路最終執(zhí)行凋亡的主要效應因子，是多種凋亡信號調(diào)節(jié)的交叉點。研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞發(fā)生凋亡時，caspase-3的表達增加［9］，故抑制Caspase-3的活性可減少凋亡發(fā)生［10］。本實驗結(jié)果表明，在正常健康大鼠心肌內(nèi)Caspase-3表達較低，當心衰發(fā)生時可誘發(fā)Caspase-3過度表達，不同劑量的參桂保心濃煎劑均能夠抑制Caspase-3表達，其抑制作用高劑量組優(yōu)于中劑量組，中劑量組優(yōu)于低劑量組，推測參桂保心濃煎劑的作用機制可能是通過下調(diào)Caspase-3表達，阻斷細胞凋亡，改善心衰，起到治療作用。

總之，無論是NT-pro BNP還是Caspase-3，各劑量組雖然能降低其水平或表達，但與空白組之間仍有差距，說明心衰過程體液因子調(diào)節(jié)機制是錯綜復雜的，參桂保心濃煎劑治療心衰的作用靶點研究有待進一步深入。

［1］Sharov VG，Sabbah HN，Shimoyama H，et al.Evidence of cardiocyte apoptosis in my ocardium of dogs with chronic heart failure［J］.Am J Pathol，1996，148（1）：141-149.

［2］Sukumaran V，Watanabe K，Voeroveedu PT，et al.Olmesar tan，an AT1 antagonist，at tenuates oxidative stress，endoplasmic reticulum stress and cardiac inf lammatory mediators in rats with heart fai lure induced by experimental autoimmune myocarditis［J］.International Journal of Biological Science Ter til r l fi li Clciece，2011，7（2）：154-167.

［3］Cryns V，Yuan J.Protease to die for［J］.Genes Dev，1998，12（11）：1551-1570.

［4］Clerico A，F(xiàn)ontana M，Zyw L，et al.Comparison of the diagnostic accuracy of brain natriuretic peptide（BNP）and the N-Terminal part of the propeptide of BNP immunoassays in chronic and acute hear t fai lure：a systematic reviewQWW［J］.Cl in Chem，2007，53（5）：813-822.

［5］許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結(jié)果的判斷標準［J］.中國癌癥雜志，1996，6（4）：229-231.

［6］張云.異丙腎上腺素誘導心肌缺血損傷模型的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2010，16（23）：3527-3531.

［7］Emdin M，Passino C，Clerico A.Natriuretic peptide assays revisited：do we need pro-B-type nat riuretic peptide？［J］.J Am Col l Cardiol，2011，57（12）：1396-1398.

［8］Maisel AS，Krishnaswamy P，Nowak RM，et al.Rapid measurement of B-type nat riuretic peptide in the emergency diagnosis of heart fai lure［J］.N Eng J Med，2002，347（3）：161-167.

［9］Saitoh T，Nakaj ima T，Kawahara K.Possible involvement of apoptotic death of myocytes in lef t vent ricular remodel ing af ter myocardial infarction［J］.Jpn J Physiol，2003，53（3）：247-252.

［10］Nunez G，Benedict MA，Hu Y，et a1.Caspases：the proteases of the apoptotic pathway［J］.Oncogene，1998，17（25）：3237-3245.

Effectsof ShenGui BaoXin Concentrated Decoction
on NT-pro BNP and Caspase-3 of the Ratsw ith Heart Failure

MA Xiaoqing1,2，ZHONG Xu3△，DANG Chanjuan1
1 Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2 Gansu Province the Third People′s Hospital；3 University Hospital of Gansu Traditional Chinese Medicine

Objective：To explore the effects of ShenGui BaoXin concentrated decoction on NT-pro BNP and Caspase-3 of isoproterenol（ISO）-induced ratmodelw ith leftventricular insufficiency.Methods：Fifty ratswere randomized into themodel group，low，moderate and high doses groupsand the blank group，ten rats each group.The rats in themodelgroup were given the same amountof physiological saline after administered them ISO in the dose inducing heart failure（85mg/kg），the rats of the blank group were unhandled，the other groupswere treated w ith ShenGui BaoXin concentrated decoction in low，moderate and high doses after giving ISO，the contents of NT-pro BNPwere detected by ELISAmethod in eightweeks，myocardialhistomorphologywasobserved by HE staining，the expressions of caspase-3 were detected by immunohistochemicalmethod.Results：1）Compared w ith the model group，the levelof NT-pro BNP decreased in differentmedication groups（P＜0.01），but itwas higher than thatof the blank group obviously（P＜0.01），compared w ith themoderate dose group，therewasno obvious difference in the low dose group（P＞0.05），it lowered in the high dose group significantly（P＜0.01）.2）Compared w ith themodelgroup，the expressionsof Caspase-3 were inhibited in differentmedication groups（P＜0.01），but they were higher than theseof theblank group obviously（P＜0.01），the high dose groupwasstronger than themoderate dose group in the inhibiting effects（P＜0.01），themoderate dose group was stronger than the low dose group（P＜0.05）.Conclusion：ShenGui BaoXin concentrated decoction could decrease the level of NT-pro BNP of ISO-induced ratmodel w ith heart failure and improve heart function，itsmechanism m ight be inhibiting overexpression of Caspase-3 and blocking cellularapoptosis.

heart failure；NT-pro BNP；Caspase-3；ShenGui BaoXin concentrated decoction

R542.22

A

1004-6852（2016）07-0008-04

2016-01-25

吳階平醫(yī)學基金會臨床科研專項資助基金（編號320.6750.11053）。

馬曉慶（1981—），女，碩士學位，主治醫(yī)師。研究方向：心血管疾病的診治。

鐘栩（1963—），女，教授，主任醫(yī)師。研究方向：心血管疾病的診治。