烏司他丁通過(guò)干預(yù)p38MAPK/ERK信號(hào)通路減輕膿毒癥性肺損傷

張利鵬，趙　焱，劉國(guó)娟，楊大剛，周麗華

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特　010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特　010051)

?

烏司他丁通過(guò)干預(yù)p38MAPK/ERK信號(hào)通路減輕膿毒癥性肺損傷

張利鵬1，趙焱2，劉國(guó)娟1，楊大剛1，周麗華1

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010051)

目的探討烏司他丁(ulinastatin，UTI)對(duì)膿毒癥性急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)大鼠的肺保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法56只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型(LPS 6、12、24 h)組、烏司他丁(UTI 6、12、24 h)組，每組8只。采用腹腔注射細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，10 mg·kg-1)的方法制備大鼠ARDS模型，烏司他丁組在左側(cè)腹腔注射LPS后1 h后，在右側(cè)腹腔注射烏司他丁20 000 U·kg-1，對(duì)照組、注射同等劑量的生理鹽水，各組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)留取肺組織及血漿標(biāo)本。計(jì)算肺組織濕/干質(zhì)量(W/D)比值；光鏡下觀察肺組織病理改變；用ELISA法檢測(cè)各組血漿中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-18(interleukin-18, IL-18)、肺表面活性物質(zhì)A((surfactant protein A,SPA)含量，檢測(cè)各組肺勻漿中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase，SOD)和一氧化氮(nitric oxide, NO)含量；免疫組化法檢測(cè)p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, p38MAPK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinase,ERK)蛋白表達(dá)情況；Western blot法檢測(cè)肺組織中磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)及磷酸化ERK(p-ERK)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果光鏡下觀察對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰；LPS組肺泡壁增厚，滲出明顯，肺組織出現(xiàn)損傷性變化，以12h組變化最明顯；UTI組各組病理改變較LPS組明顯減輕。與對(duì)照組比較，LPS組W/D比值、血漿TNF-α、IL-18含量，肺勻漿MDA、NO含量均明顯升高(P<0.05)，而肺勻漿SOD含量明顯降低；與LPS組比較，UTI各組肺組織W/D比值、血漿TNF-α、IL-18含量，肺勻漿MDA含量均明顯降低，而肺勻漿SOD含量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，LPS組p38MAPK、ERK蛋白在胞質(zhì)和胞核表達(dá)均明顯增加，而UTI組較LPS組表達(dá)均明顯減少；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，LPS組肺組織p-p38MAPK/ERK蛋白表達(dá)均明顯增高，而UTI干預(yù)組蛋白表達(dá)均明顯受抑制。結(jié)論烏司他丁通過(guò)干預(yù)p38MAPK/ERK信號(hào)通路、抗氧化作用而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)LPS致膿毒性大鼠ARDS的保護(hù)作用。

烏司他?。患?xì)菌脂多糖；急性呼吸窘迫綜合征；p38絲裂原活化蛋白激酶；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶；減輕

膿毒癥是臨床危重患者的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，可出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征，其中肺組織是最常且較早出現(xiàn)的損傷靶器官，急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是多種炎癥細(xì)胞介導(dǎo)的肺部局部炎癥反應(yīng)和炎癥細(xì)胞失控所致的肺毛細(xì)血管損傷而引起的臨床綜合征，雖經(jīng)長(zhǎng)期研究，仍無(wú)有效治療方法，其高發(fā)病率、高病死率仍是目前困擾臨床治療的難點(diǎn)與熱點(diǎn)[1]。烏司他丁(ulinastatin，UTI)是從健康男性尿液中提取出的一種物質(zhì)，具有強(qiáng)效拮抗內(nèi)毒素和抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用，可有效降低膿毒癥患者的病死率[2]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases， MAPKs)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控炎癥產(chǎn)生的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與LPS誘發(fā)的ARDS有密切關(guān)系[3]。本研究旨在通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)大鼠ARDS模型，探討UTI在膿毒癥肺損傷中的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備健康♂ Wistar大鼠56只，體質(zhì)量(180±20) g，由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(蒙)2002-0001，實(shí)驗(yàn)前大鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)1周。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為：正常對(duì)照組、模型(LPS 6、12、24 h)組、烏司他丁(UTI 6、12、24 h)組，每組8只。采用腹腔注射LPS 10 mg·kg-1的方法制備大鼠ARDS模型，對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水，UTI組在左側(cè)腹腔注射LPS后1h后在右側(cè)腹腔注射UTI 20 000 U·kg-1，所有動(dòng)物在給LPS后規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死并留取血及肺組織標(biāo)本進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.2主要試劑主要試劑：LPS購(gòu)于Sigma公司；大鼠TNF-α、IL-18、SPA購(gòu)于武漢基因美生物科技有限公司；MDA、SOD、NO試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；UTI購(gòu)于廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，免疫組化和Western blot檢測(cè)試劑均購(gòu)于Sigma公司。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1肺濕/干重比采用濕干重法，分別取右上肺，放入無(wú)菌無(wú)酶管，稱濕重后，連續(xù)60°烘箱烘干72 h，稱干重，記錄濕/干重(W/D)值。

1.3.2因子測(cè)定用ELISA法嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)血漿TNF-α、IL-18、SPA含量；肺組織 MDA、NO活性檢測(cè)：采用硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)肺組織 MDA 含量；采用硝基還原酶法測(cè)定肺組織NO2-和 NO3-濃度，以代表NO含量；采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定肺組織SOD含量。

1.3.3肺組織病理學(xué)觀察取右下肺組織，冰凍鹽水沖洗后，濾紙吸干，以4%甲醛固定24 h后，常規(guī)修塊，脫水，透明，包埋，蘇木精-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.3.4免疫組化檢測(cè)肺組織p-p38MAPK、pERK表達(dá)所用的載玻片需預(yù)先用0.1%的多聚賴氨酸處理，切片厚度為5 μm，肺組織石蠟標(biāo)本常規(guī)脫蠟水化，抗原熱修復(fù)12 min，PBS沖洗，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶室溫30 min，PBS沖洗，羊血清工作液封閉30 min，各組分別滴加1 ∶100兔抗大鼠p-p38MAPK、ERK蛋白激酶單克隆抗體一抗4℃過(guò)夜，分別加入生物素標(biāo)記的相應(yīng)的二抗，DAB顯色，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，光鏡下觀察肺組織中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。

1.3.5Western blot檢測(cè)肺組織p-p38MAPK、p-ERK的表達(dá)肺組織稱重、剪碎，加入組織裂解液于4 ℃下勻漿，4 ℃ 12 000×g離心10 min，吸取上清。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，各組取80 μg樣品蛋白行12% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳后，轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜。應(yīng)用 2%脫脂奶粉室溫封閉硝酸纖維素膜，加入以0.1% PBS溶液按1 ∶500稀釋的p-p38 MAPK、ERK抗體，4 ℃密封過(guò)夜。TPBS振蕩洗膜后，應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗及DAB顯色試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，免疫印跡化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的吸光度(A)值。

2　結(jié)果

2.1肺濕干重比LPS各組肺組織濕/干重比均較對(duì)照組減少(P<0.05)，且以12 h組改變最明顯，UTI 6 h及12 h組肺濕/干重比值較LPS組減輕(P<0.05),24 h組變化不明顯；提示LPS 12 h組肺水腫最明顯，UTI具有減輕肺水腫作用，但作用時(shí)間<24 h(Tab 1)。

2.2血漿中 TNF-α、IL-18、SPA水平對(duì)照組血漿中TNF-α、IL-18和SPA含量較低，LPS組大鼠血漿中TNF-α和IL-18水平均較對(duì)照組明顯增加(均P<0.05),且以6 h組最明顯，隨后呈下降趨勢(shì)，24 h最弱，而血漿中SPA增高在LPS 12 h組最明顯(P<0.05)，與肺濕/干重比值變化一致；而UTI可抑制LPS所致 TNF-α、IL-18和SPA增加(均P<0.05)，分別以UTI 6、12、12 h組改變較明顯(Tab 1)。

2.3肺組織MDA、SOD和NO含量與對(duì)照組比較，LPS 12、24 h組肺組織 MDA、NO含量均明顯增加,LPS各組SOD含量明顯減少(均P<0.05)；UTI組肺組織MDA含量較LPS組明顯下降，SOD含量明顯上升(均P<0.05)，但NO無(wú)明顯改變(P>0.05)，見(jiàn)Tab 2。

GroupW/DPlasmaSPATNF-α/μg·L-1IL-18/μg·L-1Control3.69±1.1216.01±1.3338.02±8.3540.22±3.71LPS6h5.55±0.73*18.13±2.53106.26±30.37*49.21±6.35*LPS12h5.74±0.95*22.30±2.79*105.72±30.54*49.16±14.49*LPS24h5.63±0.47*20.63±3.67*93.04±21.66*42.34±14.01UTI6h4.08±0.63#16.87±1.8166.94±23.21#44.79±8.81#UTI12h4.59±1.06#18.77±2.53#79.44±19.73#42.37±9.45#UTI24h4.80±1.48#18.45±1.03#78.91±21.26#34.51±7.42#

W/D: lung wet/dry ratio，UTI: ulinastatin，TNF-α:Tumor necrosis factor-α；*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS

Tab 2　Comparision of levels of SOD, MDA and NO among seven ±s,n=8)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsLPS

Fig 1Pathological changes in rat lung tissue was observed in the optical microscope

A:Control; B:LPS 6 h;C:LPS 12 h; D:LPS 24 h; E:UTI 6 h; F:UTI 12 h; G:UTI 24 h. ( original magnification ×400).

2.4肺組織病理學(xué)改變

2.4.1HE染色結(jié)果光鏡下觀察對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)完整、肺泡腔清晰且肺泡壁無(wú)充血，肺間質(zhì)較少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；LPS組肺泡壁彌漫性增厚合并部分肺泡壁破壞，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、部分肺泡出血和結(jié)構(gòu)破壞，以12 h病理改變最明顯；UTI各組病理改變較LPS組明顯減輕，證實(shí)UTI可改善LPS致大鼠肺損傷(Fig 1)。

2.4.2p-p38MAPK/p-ERK的免疫組化結(jié)果對(duì)照組肺組織磷酸化p38MAPK/ERK陽(yáng)性信號(hào)極弱，偶見(jiàn)分布于氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)。LPS組大鼠磷酸化p38MAPK/ERK陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要分布于氣道上皮細(xì)胞、浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，且胞質(zhì)與胞核均呈陽(yáng)性表達(dá)；UTI組肺組織磷酸化p38MAPK/ERK陽(yáng)性細(xì)胞分布部位與LPS組相似，但胞核陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少，信號(hào)明顯較LPS組減弱(Fig 2)。

2.4.3p-p38MAPK/p-ERK的Western blot結(jié)果LPS組肺內(nèi)p-p38MAPK的表達(dá)明顯增加，UTI各組均能抑制LPS誘導(dǎo)的p38MAPK的磷酸化，而各組間p38MAPK的表達(dá)無(wú)明顯差異。LPS組ERK1/2及p-ERK1/2表達(dá)均增強(qiáng)，UTI各組均能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的ERK1/2及其磷酸化(Fig 3)。

Fig 2　The expression of p-p38MAPK, ERK and pERK in the lung tissues by immunohistochemistry

p-p38MAPK: A:Control; B: LPS; C: UTI; pERK: D: Control; E: LPS; F:UTI. (original magnification ×400)

Fig 3　The expression of p-p38MAPK and pERK1/2 in different groups

The expression of p-p38MAPK,*P<0.05 LPS groupvscontrol group;#P<0.05 UTI group vs LPS group. The expression of ERK1/2 and pERK1/2,*P<0.05 LPS group vs control group;#P<0.05 UTI group vs LPS group.

3　討論

近年來(lái)大量的臨床及動(dòng)物試驗(yàn)顯示烏司他丁作為一種尿胰蛋白酶抑制劑通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)釋放,預(yù)防細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng),抑制白細(xì)胞過(guò)度激活, 阻斷三者間的惡性循環(huán)，對(duì)全身炎性反應(yīng)疾病的肺損傷具有保護(hù)作用[4-8]。 本研究結(jié)果提示：UTI可減輕LPS所致大鼠肺損傷程度，表現(xiàn)為與LPS組比較UTI組肺組織病理改變減輕，肺W/D比值減小，同時(shí)測(cè)得血漿中促炎介質(zhì)TNF-α、IL-18含量減少，因此本研究結(jié)果與既往研究一致，UTI可通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)而達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)，從而緩解LPS導(dǎo)致的肺損傷。

在眾多參與膿毒癥性急性肺損傷的炎癥介質(zhì)中，TNF-α和IL-18具有重要作用。TNF-α可誘導(dǎo)白細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞脫顆粒、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，進(jìn)而使肺毛細(xì)血管滲漏、肺上皮細(xì)胞水腫，導(dǎo)致肺通氣和換氣功能障礙，影響肺功能[9]。血漿中IL-18是膿毒癥和其他炎癥性疾病中重要的炎癥介質(zhì)因子，它可以刺激T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性，參與細(xì)胞因子的生成等作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-18在LPS 6h組升高，并持續(xù)維持在較高水平，其結(jié)果顯示兩者濃度升高有一定相關(guān)性。UTI各組血漿中TNF-α和IL-18的含量較LPS組明顯減少，且以6h組改變最明顯，因此證實(shí)烏司他丁可通過(guò)抑制TNF-α和IL-18升高，減輕過(guò)度炎性反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷，從而減輕肺損傷，且抑制炎癥介質(zhì)作用時(shí)間較持久。

肺表面活性物質(zhì)是由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌的一種復(fù)雜的脂蛋白，其中SP-A具有促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞的活性，抵抗?jié)B出到肺泡的蛋白質(zhì)等對(duì)肺表面活性物質(zhì)的抑制作用[11]，因此其在肺組織中缺乏及活性下降是膿毒癥性急性肺損傷的主要發(fā)病機(jī)制之一。SP-A亦具有調(diào)理巨噬細(xì)胞功能，促進(jìn)其趨化活性，增強(qiáng)其吞噬作用，并刺激其產(chǎn)生氧自由基，因而導(dǎo)致血中氧自由基生成增加，加重膿毒癥形成惡性循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組比較，LPS 12 h及24 h組血漿SPA含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而6 h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。UTI組血漿SPA含量各時(shí)間段含量均較LPS組降低。結(jié)合本研究肺濕/干比值結(jié)果，可推測(cè)UTI可能具有抑制肺表面活性物質(zhì)的降解及增加SPA活性作用，并能降低肺毛細(xì)血管的通透性，減輕肺水腫及炎癥因子的聚集，從而達(dá)到對(duì)膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用。

多項(xiàng)研究表明阻斷p38MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)能減輕炎癥反應(yīng)[2,12]，因此不少學(xué)者提出將p38MAPK作為抗炎治療的一個(gè)有效靶位,在信號(hào)通路水平阻斷和調(diào)控p38MAPK的表達(dá)成為治療ALI的一條新途徑[13]。ERK是p38MAPK通路關(guān)鍵的信號(hào)物質(zhì)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均提示，接受機(jī)械牽拉后，肺部細(xì)胞ERK 磷酸化明顯在增加，而特異性阻斷ERK 后可明顯降低各種原因?qū)е碌姆尾繐p傷和炎癥反應(yīng)[14]。本研究結(jié)果顯示：免疫組化及Western blot結(jié)果均證實(shí)烏司他丁能減輕LPS所致肺組織中p38MAPK及ERK的磷酸化，而p38MAPK及ERK信號(hào)通路是我們所熟知的與炎癥反應(yīng)及肺損傷密切相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)通路，因此本研究證實(shí)UTI通過(guò)抑制p38MAPK及ERK信號(hào)通路而抑制炎癥介質(zhì)的形成及釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮減輕LPS誘發(fā)的肺損傷。

過(guò)氧化作用亦是急性肺損傷發(fā)病原因之一，MDA、NO含量可預(yù)示過(guò)氧化作用水平；SOD是生物體內(nèi)氧自由基的天然清除劑，具有抗氧化作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS各組中MDA的含量明顯升高并長(zhǎng)時(shí)間維持在高水平，說(shuō)明LPS可通過(guò)過(guò)氧化作用導(dǎo)致急性肺損傷。而UTI各組中MDA含量明顯低于LPS組，但6 h組變化最明顯，隨后逐漸增高，提示UTI的抗氧化作用起效快，但持續(xù)時(shí)間較短。與對(duì)照組比較，LPS組在早期6 h即可出現(xiàn)SOD的含量下降，且持續(xù)保持較低水平，UTI組各時(shí)間段SOD含量增加，與LPS組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此本研究提示LPS通過(guò)氧化應(yīng)激參與了膿毒癥性急性肺損傷，而UTI可能通過(guò)抑制過(guò)氧化損傷并清除氧自由基等作用保護(hù)肺組織，且起效較快。

肺勻漿中NO含量各組變化不明顯，可能與SP-A 抑制正常肺中分離出的肺泡巨噬細(xì)胞中脂多糖刺激后NO 的產(chǎn)量，但又能增加免疫反應(yīng)性纖維結(jié)合素激活的巨噬細(xì)胞中NO 的產(chǎn)量[15-16]，兩者共同作用導(dǎo)致NO含量的相對(duì)穩(wěn)定，亦可能是由于藥物劑量等因素所致，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，UTI對(duì)LPS所致的大鼠ARDS具有保護(hù)作用，可能與以下機(jī)制有關(guān)：① UTI能干預(yù)p38MAPK及ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，從而抑制炎癥反應(yīng)而發(fā)揮保護(hù)作用。② UTI可通過(guò)對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制從而減少毛細(xì)血管滲漏，減少肺血漿中SPA含量及活性，增加其肺組織中的含量及活性而發(fā)揮肺保護(hù)作用。③ UTI可通過(guò)減少血漿中SPA含量，減輕其對(duì)巨噬細(xì)胞刺激產(chǎn)生的氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用，清除氧自由基而減輕肺組織損傷。而UTI的最佳治療劑量、作用持續(xù)時(shí)間以及其抗氧化、抗炎作用機(jī)制仍有待深入研究。

(感謝內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室肖瑞老師和內(nèi)蒙古大學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室娜仁格日勒的悉心指導(dǎo)！)

[1]喬良,劉志.按柏林新標(biāo)準(zhǔn)分析急診膿毒癥患者發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征的危險(xiǎn)因素[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué),2015,27(7):558-62.

[1]Qiao L,Liu Z.Analysis of the risk factors of acute respiratory distress syndrome of Berlin new definition in patients with sepsis in emergency department[J].ChineseCriticalCareMedicine,2015;27:558-62.

[2]Jonsson-Berling B M,Ohlsson K,Rosengren M.Radio immunological quantitation of the urinary trypsin inhibitor in normal blood and urine[J].BiolChemHoPPeSeyler,1989,370(11):1157-61.

[3]孟瑩,余常輝,李婷,等.Toll樣受體4在煙熏和脂多糖聯(lián)合煙熏所致肺損傷大鼠中的表達(dá)及意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2013,93(28):2230-4.

[3]Meng Y,Yu C H,Li T, et al.Expression and significance of Toll-like receptor-4 in rats lung established by passive smoking or associated with intratracheal instillation of lipopolysaccharide[J].ChinMedJ,2013,93:2230-4.

[4]Inoue K,Takano H,Smada A,et al.Urinary trypsin inhibitor protects against systemic inflammation induecd by lipopolysae charide[J].MolPharmacol,2005,67(3):673-80.

[5]Inoue K, Takano H.Urinary trypsin inhibitor as a therapeutic option for endotoxin-related inflammatory disorders[J].ExpertOpinInvestigDrugs,2010,19(4):513-20.

[6]Yu J B，Yao S L.Protective effects of hemin pretreatment combined with ulinastent on septic shock in rats[J].ChinMedJ(Engl),2008,121(1):49-55.

[7]陳懌,童華生,張興欽,等.烏司他丁減輕重癥中暑大鼠肺的炎癥和氧化損傷[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2014,23(8):866-70.

[7]Chen Y,Tong H S,Zhang X Q,et al. The study of ulinastatin to reduce pulmonary inflammation and oxidative injury in rats with severe heatstroke[J] .ChineseJournalofEmergencyMedicine,2014,23(8):866-70.

[8]Wang S Y, Li Z J, Wang X L,et al. Effect of ulinastatin on HMGB1 expression in rats with acute lung injury induced by sepsis[J].GenetMolRes,2015,14(2):4344-53.

[9]朱桂軍,孟志強(qiáng),劉麗霞,等.DATS通過(guò)p38MAPK通路抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠MH-S細(xì)胞TNF-α及IL-1β表達(dá)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2012,28(9):1303-7.

[9]Zhu G J,Meng Z Q,Liu L X,et al. Inhibition of LPS-induced TNF-α and IL-1β expression by DATS through p38 MAPK pathway in MH-S cell[J].ChinPharmacolBull, 2012,28(9):1303-7.

[10]Eidt M V, Nunes F B, Pedrazza L, et al.Biochemical and inflammatory aspects in patients with severe sepsis and septic shock: The predictive role of IL-18 in mortality[J].ClinChimActa,2016,453:100-6

[11]Linder A, Russell J A. An exciting candidate therapy for sepsis:ulinastatin, a urinary protease inhibitor[J].IntensiveCareMed,2014,40(8):1164-7.

[12]Rice T W,Bemard G R.Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome:challenges in clinieal trial design[J].ClinChestMed,2006,27(4):733-54.

[13]倪志宇,叢斌,董玫,等.八肽膽囊收縮素通過(guò)p38MAPK通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞IL-1β表達(dá)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2011,27(7):971-5.

[13]Ni Z Y,Cong B,Dong M，et al. CCK-8 inhibits LPS-induced IL-1β production in RAW264.7 cells by p38 MAPK pathway[J].ChinPharmacolBull,2011,27(7):971-5.

[15]Di Paola Rl, Crisafulli C, Mazzon E, et al. Effect of PD98059,a selective MAPK3/MAPK1 inhibitor,on acute lung injury in mice[J].IntJImmunopatholPharmacol,2009,22(4):937-50.

[16]Sawada K, Ariki S, Kojima T, et al. Pulmonary collectins protect macrophages against poreforming activity of Legionella pneumophila and suppress its intracellular growth[J].JBiolChem,2010,285(11):8434-8.

Ulinastatin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury by intervening p38MAPK/ERK signaling pathway

ZHANG Li-peng，ZHAO Yan，LIU Guo-juan，YANG Da-gang，ZHOU Li-hua

(1.ICU，theAffiliatedHospitalofInnnerMongoliaMedicalUniversity，Huhhot010050，China;2.DeptofNeurology，thePeople’sHospitalofInnnerMongolia，Huhhot010051，China)

AimTo investigate whether ulinastatin has a beneficial effect on lipopolysaccharide(LPS) induced acute respiratory distress syndrome(ARDS) in rats，and to explore the possible underlying mechanisms.MethodsFifty-six Wistar rats were randomly assigned into control group, model group(LPS 6，12，24 h groups), ulinastatin group(UTI 6，12，24 h groups), with 8 in each group. ARDS rat model was reproduced by intraperitoneal injection of LPS(10 mg·kg-1), The rats in UTI groups were injected ulinastatin(20 000 u·kg-1), The rats in the control group received an equal volume of normal saline at the same time, rats in each group were sacrificed at 6,12,24 hours after LPS challenge. Plasma and lung tissue samples were collected, Histopathological evaluation, lung wet/dry (W/D) ratio, Tumor necrosis factor-a(TNF-α), Interleukin-18(IL-18)，surfactant protein A(SPA), malondialdehyde(MDA),nitric oxide(NO) and superoxide dismutase(SOD)were analyzed. Immunohistochemical method was performed to detect the protein expression of p38MAPK and ERK. Western blot method was used to detect lung phosphorylated p38MAPK(p-p38MAPK) and pERK protein expression changes.ResultIn the control groups, lung tissue showed a normal structure and clear pulmonary alveoli under a light microscope. In the model group, ARDS characters such as extensive thickening of the alveolar wall, significant infiltration of inflammatory cells，demolished structure of pulmonary alveoli，and hemorrhage were found. In the all UTI treatment groups，these pathological changes in lung were markedly alleviated compared with those of LPS-induced ARDS group. Compared with control groups, lung W/D ratio,tumor necrosis factor-a(TNF-α),interleukin-18(IL-18)and surfactant protein A(SPA)in plasma ,and lung MDA，NO levels in lung homogenates in the LPS group were increased significantly, while the lung SOD levels in the LPS group were decreased. Compared with the LPS group，lung W/D ratio,TNF-aIL-18 and(SPAin plasma ,and lung MDA levels in lung homogenates in the UTI groups were decreased significantly, while the lung SOD levels in the UTI groups were increased. Immunohistochemistry showed that positive expressions of p38MAPK and ERK in cytoplasm and nucleus in the ulinastatin treatment groups were significantly lower than those in the model group. Western blot showed that compared with the control group, the p-p38MAPK and pERK protein expression in LPS group were significantly increased, and the ulinastatin could inhibit the protein expressions compared with model group.ConclusionUlinastatin can significantly ameliorate the lung injury induced by LPS in rats via the intervention of p38MAPK and ERK signaling pathway and reducing inflammation and antioxidant effect.

ulinastatin; lipopolysaccharide; acute respiratory distress syndrome; p38MAPK; ERK;attenuate

2016-05-08,

2016-06-25

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然基金項(xiàng)目(No 2013MS1128)；內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)基金(No 201302077)

張利鵬 (1980-)，男，博士生，研究方向：膿毒癥及ARDS的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：zlp_boy2008@163.com

周麗華(1970-)，女，博士，研究方向：膿毒癥心肌損傷的信號(hào)通路研究，通訊作者,E-mail：rocboy2008@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.024

A

1001-1978(2016)09-1311-06

R-332；R332.35；R329.25；R345.57；R563.8；R631；R977.3

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.048.html