黔北麻羊小反芻獸疫免疫血清的制備方法

何啟剛+黃開(kāi)榮

摘要：免疫血清是緊急預(yù)防和早期治療相應(yīng)傳染病的有效制劑。對(duì)黔北麻羊小反芻獸疫免疫血清的制備方法進(jìn)行了介紹。

關(guān)鍵詞：黔北麻羊；小反芻獸疫；免疫血清；制備方法

中圖分類號(hào)：S858.26 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2016）06-0032-01

免疫血清是用純制的抗原多次接種于適當(dāng)?shù)某赡杲】祫?dòng)物，刺激其產(chǎn)生免疫應(yīng)答，血清中含有大量特異性抗體，又稱抗血清?？梢灾苯尤∮茫部蓪⒀蹇贵w提純?yōu)榫旅庖咔虻鞍?。小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR），又名小反芻獸偽牛瘟，是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性病毒性傳染病。主要感染小反芻動(dòng)物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征。OIE將其列為A類疫病。我國(guó)規(guī)定為一類動(dòng)物疫病。免疫血清是緊急預(yù)防和早期治療相應(yīng)傳染病的有效制劑。本文對(duì)黔北麻羊小反芻獸疫免疫血清的制備方法進(jìn)行了介紹，供參考。

1 免疫用動(dòng)物

以黔北麻羊?yàn)槊庖哂脛?dòng)物，要求反應(yīng)良好，1～3歲，雄性，健壯，無(wú)感染性疾患，能夠提供足夠數(shù)量的血清。此外還需十分注意羊的飼養(yǎng)，以消除羊的個(gè)體差異以及在免疫過(guò)程中死亡的影響。

2 免疫方法

采用肌肉分點(diǎn)注射；每點(diǎn)注射1頭份，每次注射4～6個(gè)點(diǎn)。首免后8 d免疫第二次。免疫時(shí)用不完全佐劑。在第2次加強(qiáng)免疫后2周，取靜脈血2～3 mL，制備血清，檢測(cè)抗體效價(jià)。如未達(dá)到預(yù)期效價(jià)，需再次進(jìn)行加強(qiáng)免疫，直到滿意時(shí)為止。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)，即可放血制備抗血清。

3 佐劑

由于不同個(gè)體對(duì)同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此常常在注射抗原的同時(shí)，加入能增強(qiáng)抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。佐劑除了延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，增加抗原刺激作用外，更主要的是它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞增多，促進(jìn)T細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用，從而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的細(xì)胞免疫和抗體的產(chǎn)生。常用的佐劑是弗氏佐劑，其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例視需要可調(diào)整為1∶2～9（V/V），這是不完全弗氏佐劑，在每毫升不完全弗氏佐劑中加入1～20 mg卡介苗就成為完全佐劑。配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4 ℃下保存?zhèn)溆?。免疫前取等體積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等體積抗原液（其中加卡介苗3～4 mg/mL或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，至滴于冰水上5～10 min內(nèi)完全不擴(kuò)散為止。為避免抗原損失，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來(lái)回反復(fù)抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

4 抗血清的采集與保存

采羊頸靜脈血。采血前停止喂料8 h（只給水），每只羊每次可收集160～200 mL。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。2周后，可再次放血。此法可反復(fù)多次放血。放血過(guò)程中要嚴(yán)格按無(wú)菌要求進(jìn)行。收集的血液置于室溫下1 h左右，凝固后，置4 ℃下過(guò)夜（切勿冰凍）析出血清，4 000 r/min離心10 min。在無(wú)菌條件下吸出血清，加適量青、鏈霉素，分裝，貯于-40 ℃以下冰箱，或凍干后貯存于4 ℃冰箱保存。

5 抗血清質(zhì)量的評(píng)價(jià)

在免疫期間，同一動(dòng)物在不同的時(shí)間內(nèi)抗血清效價(jià)、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常采血測(cè)試。只有在對(duì)抗血清的效價(jià)、特異性、親合力等方面作徹底的評(píng)價(jià)后，才可使用所取得的抗血清。

5.1 效價(jià)

用小后芻獸疫阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗血清效價(jià)，效價(jià)就是指血清中所含抗體的濃度或含量，即免疫羊中PPRV抗體水平。此法測(cè)定的效價(jià)極為精確。如抗血清陽(yáng)性對(duì)照阻斷率（PB）大于70就可以用來(lái)做抗血清。

5.2 特異性測(cè)定

血清的特異性或稱專一性是指抗血清對(duì)相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識(shí)別能力。特異性好就是抗血清的識(shí)別能力強(qiáng)。通常特異性是以交叉反應(yīng)率來(lái)表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線來(lái)判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時(shí)的濃度，按下列公式計(jì)算交叉反應(yīng)率。S=y/Z×100%，式中，S為交叉反應(yīng)率，y為IC50時(shí)抗原濃度，Z為IC50時(shí)近似抗原物質(zhì)的濃度。如某抗原的IC50濃度為90 Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無(wú)限大，可以說(shuō)這一抗血清與其他抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無(wú)交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。

5.3 親合力

在免疫學(xué)中，親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會(huì)迅速解離，稱為親合力低，反之親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小、抗體分子的結(jié)合位點(diǎn)與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達(dá)到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在108～1012 L/mol之間，也有高達(dá)1014 L/mol的。計(jì)算親合常數(shù)的方法有20余種，計(jì)算出的K都不能真實(shí)反映試驗(yàn)情況，只能作為參考。

6 免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

有時(shí)不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進(jìn)之。一是抗原質(zhì)量是否良好，可改用其他廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其他批號(hào)，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進(jìn)提取方法。二是所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其他佐劑，或加強(qiáng)乳化。三是免疫的方法、劑量，加強(qiáng)免疫的間隔時(shí)間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。四是動(dòng)物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營(yíng)養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動(dòng)物的健康情況是否良好等。