歐芹根對非酒精性脂肪肝大鼠的有效成分及機制研究*

新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科(烏魯木齊830063)

陳　妍　繆　娟　高　宏△

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歐芹根對非酒精性脂肪肝大鼠的有效成分及機制研究*

新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科(烏魯木齊830063)

陳妍繆娟高宏△

目的：探討歐芹根治療脂肪肝的有效成分及其作用機制。方法：高脂乳劑，高脂飼料誘導大鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型，選出其有效成分，并用ELISA法測腫瘤壞死因子(TNF-α)和脂聯(lián)素水平。結(jié)果：經(jīng)成分預試，5種有效成分為黃酮類物質(zhì)，且動物實驗提示該藥總黃酮能促進脂聯(lián)素水平的表達。結(jié)論：歐芹根總黃酮是該藥治療脂肪肝的有效成分，其作用機制可能與該藥能提高脂聯(lián)素表達水平相關。

主題詞脂肪肝/藥物療法總黃酮類/代謝模型，動物大鼠@歐芹根@脂聯(lián)素

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)指病變主要在肝小葉，以肝細胞脂肪變性和脂肪沉積為病理特征，但無過量飲酒史的臨床病癥[1]。近幾年來，隨著人民生活水平的提高，其患病率逐年上升。其對機體的危害，除了增加肝病相關的發(fā)病率和死亡率，更重要的是引起代謝異常等相關疾病[2]。新疆維藥歐芹根在維醫(yī)臨床應用已久，該藥對治療肝炎、脂肪肝、關節(jié)炎等疾病具有良好療效。我們結(jié)合臨床用藥特性對該藥進行了護肝和降脂作用的藥理學實驗，發(fā)現(xiàn)該藥有較好的療效[3～5]。腫瘤壞死因子(TNF-α)作為一個炎癥標志物，是與NAFLD發(fā)病的密切相關的致病因子，而脂聯(lián)素是體內(nèi)保護性細胞因子。本研究從TNF-α和脂聯(lián)素水平調(diào)節(jié)程度去與探討其有效成分及可能作用機制。

材料與方法

1 動物與材料SD大鼠330只，由新疆醫(yī)科大學動物中心提供，體重為180±20g，自由飲食，飼養(yǎng)條件為22±2℃。歐芹根購自新疆參茸中維藥飲片公司，粉碎后備用。水飛薊賓膠囊(批號：550704068)由天津天士力圣特制藥有限公司生產(chǎn)；大鼠脂聯(lián)素ELISA放射免疫檢劑盒：美國ADL公司。大鼠TNF-α放射免疫檢劑盒：美國ADL公司。CHO、TG、ALT、AST均在新醫(yī)大二附院檢驗科檢測。

2有效部位篩選采用我們前期提取方法[5]，用相應的試劑萃取后得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4個干膏備用。

3脂肪肝動物模型的建立與分組

3.1分組：將105只大鼠隨機分為7組,分別為空白對照組、陽性對照組、模型組、石油醚組、氯仿組、乙酸乙酯組、正丁醇組。所有大鼠喂養(yǎng)1周開始實驗。

3.2模型建立：除空白對照給與生理鹽水外，其余各組采用高脂乳劑(50g花生油加熱，加入15g膽固醇融化，攪勻后加入3.5ml的吐溫80，制成油相，使用50ml水、10g全脂奶粉、1g食鹽、20g蔗糖和3.5ml丙二醇加熱后介入1g脫氧膽酸鈉，制成水箱，隨后將油相和水相進行充分混合成高脂乳劑)，根據(jù)大鼠體重每周兩次喂食，平時以高脂飼料維持，連續(xù)喂食12周。12周后每組隨機處死3只，測定血脂CHO、TG值，制作病理切片，觀察模型是否成功。

3.3給藥：模型成功后，除了空白對照組與模型組外，其余各組加灌胃各組相應的藥物(陽性組按4.5mg/kg灌胃水飛薊賓膠囊，石油醚組、氯仿組、乙酸乙酯組、正丁醇組均按3g/kg灌胃)，空白組與模型組依舊按1ml/100g灌胃生理鹽水。再連續(xù)灌胃8周。

3.4指標檢測及結(jié)果：處死大鼠，取肝右葉同一部位肝組織，制作病理切片。腹主動脈取血，分離血清，測定膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)，篩選出有效部位為乙酸乙酯和正丁醇。

4有效成分的篩選

4.1藥品的分離：采用我們前期提取分離方法[6]，將乙酸乙酯和正丁醇兩個部位進行梯度洗脫，合并相同流分，共得到8個流分。

4.2動物模型的建立與給藥：大鼠165只分為11組，分別為空白對照組、陽性對照組、模型組、流分1～8組。除空白對照給與生理鹽水外，其余各組采用高脂乳劑,灌胃方法及檢測指標同3.2。模型成功后，除了空白對照組與模型組灌胃生理鹽水外，其余各組加灌胃各組相應的藥物(陽性組按4.5mg/kg灌胃水飛薊賓膠囊，1～8組均按50mg/kg灌胃)，再連續(xù)灌胃8周。

4.3指標檢測及結(jié)果：處死大鼠，取肝右葉同一部位肝組織，制作病理切片。腹主動脈取血，分離血清，測定膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)，篩選出有效成分為5個流分，確定為歐芹根總黃酮。

5有效成分機制研究

5.1歐芹根總黃酮的提取分離：用70%乙醇回流提取歐芹根粗粉，濃縮干燥后得干浸膏，70%醇溶解后，用D-101型大孔樹脂純化，干燥后得歐芹根總黃酮粉末備用。

5.2總黃酮機制研究：對60只大鼠進行分組實驗，隨機分為正常組、模型組、水飛薊素組和歐芹根總黃酮高、低劑量組，除了正常組，其他組均按3.2項下造模。模型成功后，除了正常組與模型組灌胃生理鹽水外，其余各組加灌胃各組相應的藥物(水飛薊素組按4.5mg/kg灌胃水飛薊賓膠囊，歐芹根總黃酮組高、低劑量按80mg/kg、40mg/kg灌胃)，再連續(xù)灌胃8周后處死大鼠，腹主動脈取血，分離血清，全自動生化儀測量ALT、AST，CHO、TG，ELISA法測腫瘤壞死因子(TNF-α)和脂聯(lián)素水平。

結(jié)　果

1有效部位篩選結(jié)果見表1。四個部位中正丁醇和乙酸乙酯部位效果比較明顯，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。病理切片也顯示正丁醇和乙酸乙酯部位及陽性組在組織形態(tài)學上均有一定程度的改善，肝細胞腫脹程度減輕，細胞未見明顯的組織壞死。

2有效成分篩選結(jié)果8個流分中有5個流分效果比較明顯(P<0.05)。病理切片也顯示這5個流分在組織形態(tài)學上均有一定程度的改善，提示其有效成分可能為此5種流分共同作用。對此5個流分進行化學成分預測，發(fā)現(xiàn)1%三氯化鋁試劑及氨熏檢查呈陽性，說明此5種流分為黃酮類化合物。據(jù)此，我們推測該藥材護肝作用的有效成分為歐芹根總黃酮。

表1　歐芹根治療脂肪肝有效部位篩選±s)

注：模型組與空白對照組比較，#P<0.05, ##P<0.01；給藥組與模型組比較，*P<0.05,**P<0.01

3歐芹根總黃酮作用機制研究我們對歐芹根總黃酮治療脂肪肝機制進行研究探討，發(fā)現(xiàn)該藥能促進非酒精性脂肪肝大鼠脂聯(lián)素水平的表達，但是對TNF-α的作用并不明顯，可能是和在給藥過程中繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料有關。

討　論

TNF-α是由巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞等細胞合成、分泌的一種非糖基化蛋白。主要通過激活其他細胞因子和調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖、壞死或凋亡，對脂肪代謝起一定作用。目前很多研究表明，TNF-α和非酒精性脂肪肝的發(fā)病密切相關。脂聯(lián)素是由白色分泌組織分泌的一種蛋白，具有調(diào)節(jié)胰島素敏感性、葡萄糖內(nèi)環(huán)境平衡、抗動脈粥樣硬化、促進脂肪酸氧化等作用，是機體調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和血糖穩(wěn)定的重要因子。目前研究顯示脂聯(lián)素能減少肝中脂肪堆積及炎癥介質(zhì)作用，與非酒精性脂肪肝的發(fā)病有關[6]。本研究從TNF-α和脂聯(lián)素水平這兩個角度去探索歐芹根有效成分的作用機制，發(fā)現(xiàn)歐芹根總黃酮能促進脂聯(lián)素水平的提高，但是對TNF-α的表達作用不明顯。

新疆維藥歐芹根主要分布在新疆的和田、阿克蘇一帶，臨床及民間主要用于治療脂肪肝等肝臟疾病。但由于缺乏實驗基礎，限制了該藥的應用和推廣。本研究對該藥進行脂肪肝藥效學實驗及有效成分的篩選，并對其有效成分可能作用的機制進行了探討，結(jié)果表明該藥中的黃酮類成分對脂肪肝有較好的治療效果。

[1]王成建,朱麗群,張 瑋.非酒精性脂肪性肝病糖代謝異常與血清脂聯(lián)素關系研究[J].臨床醫(yī)學工程.2012,9(19):1509-1510.

[2]鄔月琴,白 琳,薛曄霞,等.非酒精性脂肪肝病與糖脂代謝相關分析[J].中國健康文摘,2013,10(6) :216-217.

[3]陳 妍, 烏莉婭·沙依提,馬亮英.新疆維藥歐芹根總黃酮的乙醇提取工藝優(yōu)選及其大孔樹脂篩選[J].中國實驗方劑學雜志,2014,20(15):19-21.

[4]陳妍,劉軍,林伊梅，等.芹菜根提取物對D-氨基半乳糖所致急性肝損傷的保護作用研究[J].中國藥房,2011,22(35):3272-3274.

[5]陳 妍,趙先彬,馬亮英，等.維藥芹菜根不同部位對四氯化碳誘導大鼠急性肝損傷的保護作用[J].醫(yī)學信息,2011,24(9):5658-5659.

[6]林長青，高彥彬，劉桂芳，等.糖脂平膠囊島素抵抗大鼠脂聯(lián)素表達的影響[J].陜西中醫(yī)，2009，30(5)：617-619.

(收稿：2016-03-11)

R575.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.003

*烏魯木齊市科學技術計劃項目(Y141310046)

△烏魯木齊市友誼醫(yī)院