固相萃取結(jié)合氣相色譜-火焰離子化檢測器分析面包中飽和烴類礦物油

安紅梅，柯潤輝*，劉秀，田菲菲，王麗娟，黃新望，尹建軍

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(島津(中國)有限公司，北京，100020)

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固相萃取結(jié)合氣相色譜-火焰離子化檢測器分析面包中飽和烴類礦物油

安紅梅1，柯潤輝1*，劉秀1，田菲菲2，王麗娟1，黃新望1，尹建軍1

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(島津(中國)有限公司，北京，100020)

為分析面包中飽和烴類礦物油(mineral oil saturated hydrocarbons,MOSH)，建立了一種硝酸銀硅膠固相萃取GC-FID方法。在優(yōu)化的前處理及色譜條件下，面包中的MOSH最低檢出限為1.0 mg/kg，定量限為3.0 mg/kg，一定范圍內(nèi)線性良好(R2=0.999 1)，回收率(90.4%～105.1%)和相對標準偏差(3.29%～5.77%)(n=6)均滿足方法性能要求。實際樣品的分析表明,面包中的MOSH的含量較高，其中MOSH(n-C16-C24)最高為101.4mg/kg，MOSH(n-C24-C35)最高為71.3mg/kg。

飽和烴類礦物油(MOSH)；面包；氣相色譜-火焰離子化檢測器(GC-FID)；硝酸銀硅膠固相萃取

食品中烴類礦物油污染由來已久[1]，自2008年烏克蘭葵花籽油受礦物油污染事件以來備受關(guān)注[2]。烴類礦物油(mineral oil hydrocarbons，簡稱MOH)指石油原油經(jīng)精餾純化等步驟形成的石油產(chǎn)品或從有機廢物中合成的復(fù)雜烴類混合物，包括由直鏈、支鏈烷烴(此二者統(tǒng)稱為石蠟)以及環(huán)烷烴組成的飽和烴類礦物油(mineral oil saturated hydrocarbons，簡稱MOSH)和芳香烴類礦物油(mineral oil aromatic hydrocarbons，簡稱MOAH)[3]。不同于傳統(tǒng)認識上的食品污染物，MOH組分的復(fù)雜性使其在GC-FID上以駝峰(復(fù)雜性不溶物峰)的形式存在[4]。歐洲食品安全局(EFSA)的研究顯示：經(jīng)食物攝入的n-C16-C35之間的MOSH可能會在體內(nèi)累積，從而導(dǎo)致淋巴結(jié)、脾臟和肝臟的微肉芽腫；而MOAH具有極大的潛在致癌性[3]。食品中MOSH的污染占MOH污染量的大部分，是食品受MOH污染的標志[5]，故MOSH的污染研究一直是該領(lǐng)域的研究熱點[6-7]。研究表明，MOSH是累積在人體內(nèi)量最大的污染物[8]。自20世紀90年代起不同食品中MOSH污染的研究相繼報道出來[9-10]，其中谷物制品、大米及植物油等食品中MOSH含量相對較高。

面包作為西方人的主食，在其日常膳食中占有重要地位[11]。近年來，我國面包人均年消費量也逐年遞增，面包年產(chǎn)量已超160萬t[12]。2012年，EFSA在歐洲國家征集面包、大米等食品中MOSH污染數(shù)據(jù)以便進行進一步的風險評估。瑞士蘇黎世州食品監(jiān)管局(KLZH)所檢測的101個面包樣品中，MOSH的平均含量為261 mg/kg，最高達2 800 mg/kg，碳鏈數(shù)在n-C17-C30之間[3]。目前各國尚未制定食品中MOSH的限量，其障礙之一是缺少有效的標準檢測方法。當前，MOSH檢測中使用較多的方法是GROB等人建立的在線高效液相色譜-氣相色譜-火焰離子化檢測器方法(on line-HPLC-GC-FID)[13]。該方法靈敏度和自動化程度均較高，但價格昂貴、對人員要求高、方法普及難度大。與自動在線技術(shù)相比，離線固相萃取-氣相色譜火焰離子化檢測器方法(SPE-GC-FID)具有節(jié)省溶劑、簡單易操作及可批量處理等優(yōu)點，經(jīng)過濃縮步驟后靈敏度也能滿足檢測需求[9]。目前，國內(nèi)僅有少量文獻報道食品中石蠟的定性檢測方法[14-15]，尚未見MOSH定量檢測方法的報道。本文以面包為研究對象，通過對樣品前處理方法和色譜分離條件進行系統(tǒng)優(yōu)化，建立了一種簡便、準確測定面包中MOSH含量的SPE-GC-FID的方法，能有效去除樣品基質(zhì)中的干擾組分，方法學指標均滿足實際檢測要求。本方法已應(yīng)用于市售面包中MOSH的定量檢測。

1　材料與方法

1.1樣品

面包樣品10個，購自當?shù)爻小?/p>

1.2試劑與儀器

二氯甲烷、甲醇、正己烷和丙酮均為色譜純(美國Dikma公司)；硅膠(Lichrospher Si 60，粒徑0.063～0.200 mm，德國Merck公司)，使用前于600℃烘烤4 h；硝酸銀為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

食品級白礦物油標準品(由支鏈烷烴和環(huán)烷烴組成)，純度99.9%(VG15潤滑油公司)；n-C8-C40正構(gòu)烷烴混和標樣(100 mg/kg)(上海安譜公司)。

氣相色譜儀(GC-2010，配有FID檢測器，日本島津公司)；氮氣吹干儀(DC-12，上海安譜公司)； Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司)。

醫(yī)用玻璃注射器(5 mL，金壇市第二注射器廠)；固相萃取小柱篩板(天津博納艾杰爾公司)。(注：關(guān)鍵玻璃器皿需依次用超純水、甲醇、丙酮和正己烷沖洗，以防止背景污染。)

1.3標準溶液的配制

稱取0.100 g食品級白礦物油，用正己烷溶解并定容至100 mL，配制成1 g/L的單一標準儲備液，于4℃冰箱保存。使用前根據(jù)需要將食品級白礦物油和n-C8-C40正構(gòu)烷烴混和標樣的標準儲備液用正己烷配制成適當濃度的混合標準工作液(即MOSH工作液)。

1.4樣品制備

1.4.1提取

稱取研磨均勻的面包試樣5.0g(標示脂肪含量一般為10%～35%)于25 mL具塞比色管中，加入20 mL正己烷，渦旋 10 min，超聲1 h。取1 mL正己烷相于5 mL玻璃比色管中，待凈化。(注：實驗人員操作過程中應(yīng)避免戴乳膠手套和擦拭護手霜，以免干擾實驗結(jié)果。)

1.4.2凈化

1.4.2.1固相萃取小柱的制備

質(zhì)量分數(shù)為1%的硝酸銀硅膠的制備：將0.5 g硝酸銀溶解到盛有50 mL超純水的圓底燒瓶(事先用鋁箔紙包裹以防止硝酸銀硅膠見光失效)中，再加入49.5g硅膠，于70℃水浴、12 kPa真空度下減壓干燥混勻3 h，然后放入氣相色譜儀柱溫箱中125℃保持15 h，置于干燥器皿內(nèi)，備用。質(zhì)量分數(shù)為10%和0.3%的硝酸銀硅膠制備過程類似。

準確稱取1.0 g 質(zhì)量分數(shù)為1%的硝酸銀硅膠填料于裝有篩板的5 mL玻璃固相萃取柱體中(事先用鋁箔紙包裹)，輕輕敲實，用6 mL正己烷預(yù)淋洗SPE柱。

1.4.2.2固相萃取柱凈化

取1 mL樣品提取液上樣后，用1 mL正己烷洗脫死體積，棄去。再用2.0 mL正己烷洗脫于KD濃縮管中，控制流速1 mL/min。為了達到一定的靈敏度，柔和氮氣吹至0.1 mL，上GC-FID檢測。

1.5氣相色譜條件

色譜柱：DB-1石英毛細管柱(15 m×0.25 mm×0.1 μm)；柱溫為50℃保持4 min，以40℃/min的速率升至330℃，保持10 min；載氣為高純度氮，柱流速為2.00 mL/min；氫氣流量為30 mL/min；空氣流量為400 mL/min；采用無分流進樣，進樣量1 μL；進樣口溫度300℃；FID檢測器溫度345℃。

2　結(jié)果與討論

2.1提取體積的優(yōu)化

實驗過程中通過向空白面包中添加一定量的MOSH標準工作液，考察提取劑體積對回收率的影響。由圖1可以看出，一定范圍內(nèi)MOSH的回收率隨著提取劑體積的增大而增大，當提取劑用量增至10 mL以上其回收率沒有顯著增加(如圖1所示)。故最終確定提取體積為10 mL。

圖1　提取劑體積對提取效果的影響Fig.1　Effect of solvent volume on extraction efficiency

2.2固相萃取條件的選擇

由于食品基質(zhì)中含有大量的脂肪、色素以及萜烯類等物質(zhì)，會嚴重干擾MOSH組分的定性和定量，因此溶劑提取之后的凈化步驟必不可少。

2.2.1固相萃取填料的選擇

雖然硅膠填料能保留脂肪等干擾物，從而在一定程度上將MOSH與雜質(zhì)分離開來，但其分離效率不夠理想[4]。硝酸銀硅膠是在硅膠的基礎(chǔ)上絡(luò)合AgNO3所形成，它基于AgNO3與含有雙鍵(或不飽和鍵)的物質(zhì)結(jié)合形成配合物，且不同物質(zhì)形成的配合物的穩(wěn)定系數(shù)不同，通過不同極性的洗脫溶劑洗脫從而達到分離的目的，其較硅膠而言保留含不飽和鍵的極性干擾物的能力更強[16]。由于MOSH是由正構(gòu)烷烴、支鏈烷烴和環(huán)烷烴組成的復(fù)雜化合物體系，本文通過添加1.2中正構(gòu)烷烴n-C8-C40混標和食品級白礦物油(由支鏈烷烴和環(huán)烷烴組成，碳鏈數(shù)在n-C13-C38之間)混標溶液，考察質(zhì)量分數(shù)為0.3%、1%和10%的3種不同配比的硝酸銀硅膠填料對MOSH的回收率的影響。由圖2可以看出3種配比的硝酸銀硅膠對MOSH的回收率影響不顯著，均可用于面包中MOSH的分離。雖然硝酸銀比例的增加可進一步確保MOSH與干擾物的分離度，但硝酸銀含量越大操作過程中對避光的要求越高，因此實驗最終選擇1%的硝酸銀硅膠作為萃取填料。

圖2　三種硝酸銀硅膠SPE柱分離MOSH的GC-FID譜圖Fig. 2　GC-FID chromatograms of MOSH separation by three silver-silica gel SPE columns

2.2.2硝酸銀硅膠柱洗脫體積的測試

通過添加1.2中正構(gòu)烷烴n-C8-C40混標和食品級白礦物油混標工作溶液于空白面包樣品中，考察了質(zhì)量分數(shù)為1%的硝酸銀硅膠填料上正己烷洗脫體積對MOSH回收率的影響(圖3)。

圖3　洗脫體積對MOSH的影響Fig. 3　Effects of elution volume on MOSH separation

由圖3可以看出，當用1 mL正己烷洗脫時，n-C8-C40正構(gòu)烷烴以及食品級白礦物油的回收率相對較低，為14%～80%；當用2 mL正己烷洗脫時，n-C8-C40正構(gòu)烷烴以及食品級白礦物油的回收率有所增加，為37%～101%；當用3 mL正己烷洗脫時，其回收率與2 mL正己烷洗脫時并無顯著差異，但隨著洗脫量的增大，基質(zhì)中存在的弱極性的干擾物會隨之流出，因此在保證回收率的前提下選擇2 mL正己烷洗脫液。值得一提的是，由于碳鏈較短的正構(gòu)烷烴的沸點較低，前處理過程較易揮發(fā)，故采用正己烷洗脫時n-C8-C12正構(gòu)烷烴的回收率較低(37%～50%)，而恰巧此部分MOSH并不是關(guān)注的重點，重點在于碳鏈數(shù)在n-C16-C35之間的烷烴[3]。因此采用1%硝酸銀硅膠柱用2 mL正己烷洗脫即可將MOSH從面包基質(zhì)中分離開來，同時碳鏈數(shù)在n-C16-C35之間的MOSH的回收率可達89%～98%。

2.3色譜分析條件及定量方法的確定

2.3.1色譜分析條件的確定

要想獲得較高的儀器靈敏度(即基線上方的駝峰的高度最高)，必須使用較高的升溫速率，但亦不可過高以免造成較大的柱流失[13]。實驗過程中比較了20℃/min和40℃/min的升溫速率(如圖4所示)，在非極性DB-1色譜柱上，采用40℃/min的速率時的信噪比較20℃/min時高一倍左右，一定程度上可提高儀器的檢測靈敏度。

圖4　不同柱升溫速率對飽和烴類礦物油出峰的影響Fig.4　Effect of different column temperature program

2.3.2MOSH定量方法的確定

烴類礦物油包括很多物質(zhì)，且每種樣品中的礦物油種類相差較大。大多情況下礦物油中每種物質(zhì)的校正因子較難獲得，因此尋找一種對所有礦物油具有相似響應(yīng)的檢測器尤為重要。在這方面，MS不及FID，其對不同烴類物質(zhì)的響應(yīng)不同，而FID對所有的飽和烴類的響應(yīng)基本一樣，可以在不需要校正因子的情況下使用單個的烴類作為內(nèi)標或烴類混合物作為外標進行定量[17]。

目前對于MOSH的定量可采用食品級白礦物油作為標準品，外標法進行定量[10]。在對色譜圖中的駝峰進行積分時應(yīng)注意以下幾點：

(1)每次進樣之前需多次進空白溶劑以確?；€足夠平穩(wěn)且無雜質(zhì)干擾[13]。

(2)根據(jù)分子質(zhì)量分布對駝峰進行分割：一般認為低于n-C24的MOSH較易發(fā)生遷移，高于n-C35的MOSH難以從食品接觸材料向食品遷移且不易在人體內(nèi)累積[3]，因此普遍以對應(yīng)的正構(gòu)烷烴為界限將其分為兩段，即n-C16-C24之間的MOSH為高揮發(fā)性的烴類礦物油物質(zhì)、n-C24-C35之間的為低揮發(fā)性烴類礦物油物質(zhì)。

(3)根據(jù)分子質(zhì)量分布對MOSH駝峰積分：參照BIEDERMANN等人的積分方法，先將整個駝峰的峰面積積分，再減去食品中內(nèi)源性奇數(shù)碳正構(gòu)烷烴的峰面積即可[10]。

2.4方法的基本性能

2.4.1線性范圍及測定低限

將食品級白礦物油標準儲備液逐級稀釋為3.0、10.0、50.0、100.0、200.0 mg/kg的系列混合標準工作溶液，在1.5條件下進樣測定，以被測物峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，得出線性方程和相關(guān)系數(shù)，食品級白礦物油在3.0～200.0 mg/kg內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(Y=19 880x+49 929，R2=0.999 1)。將一定質(zhì)量濃度標準品添加到陰性樣品中，以3倍信噪比作為分析方法的測定低限，實際測定低限為1.0 mg/kg；以10倍信噪比時作為分析方法的定量低限，實際定量限為3.0 mg/kg。

2.4.2回收率實驗

在陰性面包基質(zhì)中添加食品級白礦物油標準儲備溶液進行回收率實驗，添加水平為3.0、50.0、150.0 mg/kg，按照選定的實驗條件測定，每個水平平行測定6 次，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：在以上3 個添加水平下，回收率范圍為90.4%～105.1%，相對標準偏差(RSD)范圍為3.29%～5.77%，該方法的回收率和RSD均符合檢測要求[18]。若在實際樣品檢測中其濃度有超出線性范圍的情況，可將樣品溶液稀釋至線性范圍之內(nèi)再進行測定。

表1　食品級白礦物油的回收率及其精密度(n= 6)

2.5實際樣品分析

采用上述方法對10個市售面包樣品進行檢測，測定結(jié)果見表2?？梢钥闯龀嗣姘?之外，其余面包中MOSH(n-C16-C24)含量在10.1～101.4 mg/kg之間，MOSH(n-C24-C35)含量在4.2～71.3 mg/kg之間。其中面包1中的MOSH含量最高，MOSH(n-C16-C24)含量為101.4 mg/kg，MOSH(n-C24-C35)含量為71.3 mg/kg(見圖5)，其污染原因可能是其生產(chǎn)過程中使用含礦物油的脫模劑和防粘劑的的緣故，也可能是包裝材料上的礦物油的遷移所致[3]。然而國內(nèi)暫無MOSH在面包中的最大使用限量，僅GB 2760—2014[19]中規(guī)定在除膠基糖果以外的其他糖果和鮮蛋中用于被膜劑的食品級白礦物油(一種MOSH產(chǎn)品)的最大使用量為5 g/kg，因此國內(nèi)面包中存在的高含量MOSH應(yīng)引起一定的關(guān)注。

表2　不同面包中的MOSH含量　　單位：mg/kg

圖5　面包1中MOSH的GC-FID譜圖Fig. 5　GC-FID chromatograms of MOSH in bread 1

3　結(jié)論

本文建立了面包中飽和烴類礦物油(MOSH)的硝酸銀硅膠固相萃取GC-FID的分析方法，通過正己烷提取，質(zhì)量分數(shù)為1%的硝酸銀硅膠凈化，在優(yōu)化的色譜條件下可以實現(xiàn)面包中MOSH的分離與定量，方法的檢出限為1 mg/kg，定量限為3 mg/kg。與自動在線技術(shù)相比，本方法操作簡單、成本低。

[1]LAURENCE C, MITCHELL K, JOHN G. Migration of mineral hydrocarbons into foods. 1. Polystyrene containers for hot and cold beverages[J]. Food Additives and Contaminants, 1991, 8(6) : 693-700.

[2]MAURUS B, KONI G. How “white” was the mineral oil in the contaminated Ukrainian sunflower oils[J]. European Journal of Lipid Science and Technology, 2009, 111(4) : 313-319.

[3]European Food Safety Authority (EFSA). Scientific Opinion on Mineral Oil Hydrocarbons in Food[R]. Parma : EFSA, 2012.

[4]KATELL F, FLORIAN G, KARSTEN S, et al. Development of a manual method for the determination of mineral oil in foodsand paperboard[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1 271(1): 192-200.

[5]DENNIS F, ALBERTO P, FLAVIA G, et al.A versatile splitless injection GC-FID method for the determination of mineral oil paraffins in vegetable oils and dried fruit[J]. Food Control, 2010, 21(8): 1 155-1 160.

[6]MAGDALENA W, DAVINSON P, Cristina Nerin.Rapid analytical procedure for determination of mineral oils in edible oil by GC-FID[J]. Food Chemistry, 2013, 141(4):3 993-3 999.

[7]MAURUS B, JAN-ERIK I, GIOVANNA D, et al. Migration of mineral oil from printed paperboard into dry foods: survey of the German market. Part II : advancement of migration during storage[J]. European Food Research and Technology, 2013, 236(3): 459-472.

[8]KONI G. Update on recycled paperboard and its compliance for food contact[J]. Journal of Consumer Protection and Food Safety, 2014, 9(3): 231-219.

[9]SABRINA M, LAURA B, GIORGIA P, et al.Rapid and sensitive solid phase extraction-large volume injection-gas chromatography for the analysis of mineral oil saturated and aromatic hydrocarbons in cardboard and dried foods[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1 243(12): 1-5.

[10]MAURUS B, KONI G. On-line coupled high performance liquid chromatography-gas chromatography for the analysis of contamination by mineral oil. Part 2 : Migration from paperboard into dry foods: Interpretation of chromatograms[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1 255(14) : 76-79.

[11]陸健. 歐洲焙烤食品市場調(diào)查[J]. 中國市場, 2008, 38 : 68-69.

[12]北京智研科信咨詢有限公司. 2014-2020年中國面包市場監(jiān)測與投資方向研究報告[EB/OL]. http://www.cction.com/report/201404/103545.html, 2014-04-14/2015-02-10.

[13]MAURUS B, KONI G. On-line coupled high performance liquid chromatography-gas chromatography for the analysis of contamination by mineral oil. Part 1: Method of analysis[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1 255(14): 56-75.

[14]丘慧澄, 沈友, 甘文靜. 食品中礦物油的測定[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2002, 28(4) : 41-43.

[15]劉亮, 唐善虎, 陳諾, 等. GC-MS法研究礦物油在肉雞體內(nèi)殘留動態(tài)變化[J]. 食品科學, 2010, 31(19) : 87-91.

[16]歐陽長庚, 盧文彪. 利用硝酸銀處理的硅膠色譜方法分離和提純中藥有效成分的思考[J]. 廣州中醫(yī)藥大學學報, 2004, 21(4) : 319-322.

[17]GIORGIA P, MARIOSIMONE Z, PETER Q T, et al. Comparison of two different multidimensional liquid-gas chromatography interfaces for determination of mineral oil saturated hydrocarbons in foodstuffs[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405(2/3): 1 077-1 084.

[18]GB/T 27404-2008.實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測[S].

[19]GB/T 2760-2014.食品添加劑使用標準[S].

Research on the determination of mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) in bread by SPE-GC-FID

AN Hong-mei1，KE Run-hui1*，LIU Xiu1，TIAN Fei-fei2，WANG Li-juan1,HUANG Xin-Wang1，YIN Jian-jun1

1(China national research institute offood&fermentation industry, Beijing 100015, China) 2(Shimadzu(China)Co.Ltd, Beijing 100020, China)

A method for the determination of mineral oil saturated hydrocarbons(MOSH) in bread samples by silver nitrate -silica gel SPE-GC-FID was established. The limits of detection and quantification of this method were 1.0mg/kg and 3.0mg/kg under the optimizing pretreatment and instrument conditions. Satisfactory linearity was obtained with a correlation coefficient of 0.9991 and Spiked recoveries range of 90.4%～105.1% with RSD of 3.29%～5.77% (n=6). The most contaminated sample was a bread with 101.4 mg/kg of MOSH between n-C16and n-C24and 71.3 mg/kg of MOSH between n-C24and n-C35. The method can be applied to determine mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH) in bread samples for its efficiency and simplicity.

mineral oil saturated hydrocarbons(MOSH);bread samples;gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID);silver nitrate-silica gel solid phase extration

碩士,工程師(柯潤輝博士為通訊作者)。

2015-02-28，改回日期：2015-05-05

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601029