基于約氏不動桿菌的萘生物降解特性

姜巖，張曉華，楊穎，張賢明

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基于約氏不動桿菌的萘生物降解特性

姜巖，張曉華，楊穎，張賢明

（重慶工商大學(xué)廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067）

萘是典型的多環(huán)芳烴，毒害大、難降解，既是重要的環(huán)境污染物，又是代表性的石油烴成分，成為各類油污染場地生物修復(fù)的難點。礙于其水溶性差而制約了相關(guān)研究。利用一株從廢油中分離得到的兼具石油烴降解能力和潤濕反轉(zhuǎn)無機雜質(zhì)能力的約氏不動桿菌開展了萘的生物降解特性研究。通過研究降解因素優(yōu)化出基礎(chǔ)的降解條件；在此基礎(chǔ)上，在50～2000 mg·L-1范圍內(nèi)研究了該菌對萘的生物降解特性；并利用Monod模型和Haldane模型對比研究了該菌降解萘的動力學(xué)行為。結(jié)果表明，該菌在以2000 mg·L-1萘為唯一碳源的特定條件下，以5%的接種量可以在146 h左右實現(xiàn)萘的全降解；Haldane模型適合于描述菌株的生長和底物降解行為，而Monod模型只適合于描述低濃度下萘的生物降解特性。

萘；降解；石油；環(huán)境；約氏不動桿菌；動力學(xué)；底物抑制

引 言

萘是典型的多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs），廣泛分布于大氣、水體、土壤、作物和食品中，也是各類油品中重要的石油烴成分，進入環(huán)境后成為難降解有毒害污染物[1-3]。美國環(huán)保署早在20世紀(jì)80年代初就已經(jīng)將其列為環(huán)境中優(yōu)先檢測污染物[4]。

PAHs有多種遷移、轉(zhuǎn)化途徑，其中微生物降解是去除PAHs的最主要途徑[5]。目前，已經(jīng)證實有近20個屬種的微生物能夠降解萘，研究成果涵蓋了菌種的篩選、降解特性研究、代謝途徑分析等[6-8]。其中，假單胞菌屬（sp.）作為最重要的代表性環(huán)境微生物能夠降解包括萘等在內(nèi)的多種污染物，得到最為廣泛的研究[9-11]。Pathak等[12]曾發(fā)現(xiàn)一株sp. HOB1在特定條件下能夠快速降解高達(dá)2000 mg·L-1以上的萘。不動桿菌屬（sp.）也廣泛存在于各類污染環(huán)境中，已經(jīng)證實該菌屬亦可利用部分PAHs作碳源實現(xiàn)生物降解[13-14]；不僅如此，其中的部分菌種還具有在油水兩相間潤濕反轉(zhuǎn)油相固體粒子的特性[15-16]；近年來該菌屬受到越來越多的關(guān)注。除上述常見菌屬外，其他的部分菌屬也得到了越來越多的認(rèn)識，如鏈霉菌屬（sp.）中的一些菌可以在12 h內(nèi)降解超過80%的低濃度萘[13]。

本文即是利用從廢油中分離得到的一株約氏不動桿菌[15-17]，以萘為典型PAHs污染物，研究萘的生物降解條件、降解特性、動力學(xué)行為，為進一步研究PAHs的環(huán)境污染治理以及廢油的生物處理奠定實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗菌株

約氏不動桿菌是本實驗室以廢油為分離材料，經(jīng)分離、純化和16S rRNA鑒定得到，并已證實該菌具有良好的石油烴降解特性[17]。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L，pH7.0～7.2。

無機鹽培養(yǎng)基：硝酸銨1 g，磷酸二氫鉀0.4 g，磷酸氫二鉀0.8 g，氯化鈣0.05 g，硫酸鎂0.05 g，硫酸亞鐵0.05 g，氯化鈉0.8 g，蒸餾水1 L；pH7.0～7.2。以萘作唯一碳源，將萘溶解于丙酮中制備成儲備液；再將萘丙酮溶液分裝在30 ml預(yù)熱至37℃的無機鹽培養(yǎng)基中；最后在37℃恒溫水浴中揮發(fā)丙酮；根據(jù)丙酮用量的不同，其揮發(fā)時間在0.5～8 h左右。無機鹽培養(yǎng)基中初始萘濃度以接種前色譜檢測結(jié)果為準(zhǔn)。

1.3 實驗方法

保藏在斜面的菌種接種至10 ml的LB培養(yǎng)基中，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，以1%～2%的接種量繼續(xù)富集培養(yǎng)1代，嚴(yán)格控制種子液的OD6001.20±0.02；萘的生物降解以接種種子液至30 ml無機鹽選擇培養(yǎng)基中開始，萘的濃度根據(jù)具體實驗?zāi)康亩?；以不接種細(xì)胞的樣品作空白對照，用以監(jiān)測生物降解過程中萘的揮發(fā)；在160 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)，定期檢測殘留于溶液中的萘濃度。

基于上述基本實驗方法，在條件優(yōu)化實驗中，溫度、接種量、pH根據(jù)實驗設(shè)定水平，其他實驗研究均采用優(yōu)化的參數(shù)條件；在動力學(xué)研究中，以降解實驗所得數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分別利用Monod和Haldane模型對比研究約氏不動桿菌降解萘的細(xì)胞生長和底物降解動力學(xué)行為。

1.4 分析方法

細(xì)胞濃度采用紫外分光光度法測定，在600 nm波長下測定發(fā)酵液的吸光度[18]；細(xì)胞干重采用重量法測定，將吸光度值轉(zhuǎn)化為細(xì)胞干重[19]。

底物濃度采用SHIMADZU LC-20A高效液相色譜儀測定。檢測條件為：SPD-M20A紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱、LC-20AD泵、色譜柱為C18反相柱（150 mm×4.6 mm，50 μm），LC-Solution色譜工作站，檢測波長為254 nm，流動相為甲醇:水85:15，流速為1 ml·min-1，柱溫為25℃，進樣量20 μl，出峰時間3.86 min。

樣品和相應(yīng)空白均做3個平行樣，初始萘濃度均為色譜實測結(jié)果，考慮到實驗條件下萘的揮發(fā)性，因此被細(xì)胞利用的萘（mg·L-1）按照下式計算：細(xì)胞降解的萘（樣品初始萘樣品中殘留萘）（空白初始萘空白中殘留萘）。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 溫度對約氏不動桿菌降解萘特性的影響

溫度通過影響細(xì)胞內(nèi)代謝酶系的活力而影響細(xì)胞對底物的降解能力。本文對比研究了溫度在30、35、37、40和43℃下，以10%的接種量，1000 mg·L-1的萘生物降解72 h后細(xì)胞生長與底物降解情況（圖1）。在該反應(yīng)時間內(nèi)，所有反應(yīng)體系內(nèi)的萘均不能實現(xiàn)全降解，該實驗設(shè)計有利于對比研究反應(yīng)條件的影響?？梢钥闯?，在各溫度條件下，細(xì)胞生長與底物降解呈現(xiàn)出一致的規(guī)律。溫度增加，萘的生物降解作用加強，更多的底物消耗用以合成新細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞濃度增加；在35～40℃范圍內(nèi)，約氏不動桿菌表現(xiàn)出旺盛的代謝活力，在37℃時接近降解高峰，此時，萘的去除率接近77%，相應(yīng)的細(xì)胞干重達(dá)到402.8 mg·L-1，表明這株約氏不動桿菌在1000 mg·L-1萘的反應(yīng)體系中表現(xiàn)出優(yōu)良的生長和降解特性。由于該菌株在前期分離、馴化等過程中均是在中溫環(huán)境中進行的，而鑒于可能存在的溫度波動，本文也考察了其耐熱性。從圖1可見，當(dāng)溫度超過40℃時，萘的生物降解作用明顯下降，特別是在溫度達(dá)到43℃時，細(xì)胞的生長和代謝受到顯著抑制。這一現(xiàn)象與王春明等[20]在高溫環(huán)境中由于萘的大量揮發(fā)造成底物限制作用不同，在本實驗體系中，尚有大量底物殘留，表明生物降解作用的下降是由于細(xì)胞在特定反應(yīng)體系中不能耐受高溫環(huán)境而造成活力下降所致。與高溫環(huán)境相比，隨著溫度的下降，細(xì)胞活力也受到抑制，但在考察的溫度范圍內(nèi)下降趨勢較為平緩。在35～40℃保持較高的生物降解活性足以保障該菌的應(yīng)用研究。

圖1 約氏不動桿菌在不同溫度下的細(xì)胞生長與萘降解

2.2 接種量對約氏不動桿菌降解萘特性的影響

將約氏不動桿菌經(jīng)兩次LB培養(yǎng)基活化后，采用不同的接種量轉(zhuǎn)接到含萘選擇培養(yǎng)基中。圖2為約氏不動桿菌在2%、5%、8%、10%、15%的接種量條件下，分別降解1000.7 mg·L-1萘的細(xì)胞生長與底物降解情況。不同的接種量會導(dǎo)致在反應(yīng)體系中初始細(xì)胞濃度的差異，細(xì)胞濃度越高微生物越容易存活，越有利于擺脫延滯期而進入對數(shù)生長期，實現(xiàn)對萘的降解；反之，微生物則需要經(jīng)過較長時間進行物質(zhì)和能源的儲備后才能實現(xiàn)對底物的快速降解。因此，在72 h的生物降解周期內(nèi)，細(xì)胞濃度和萘的去除率均隨接種量增加而增大。此外，接種量越高，接種體細(xì)胞在進入新環(huán)境后耐受有機毒性保持相對高活力的能力越強，也是導(dǎo)致最終獲得了相對較高的萘去除率和生物量的重要原因。

不過，細(xì)胞濃度的差異隨著生物降解作用的繼續(xù)而逐漸減小。從圖中可以看出，當(dāng)菌株歷經(jīng)不同的生物降解周期實現(xiàn)對萘的全降解后，在各反應(yīng)體系中最終的細(xì)胞濃度差別不大，畢竟各反應(yīng)體系中的初始碳源是完全相同的，這決定了最終生物量的多少；從細(xì)胞生長曲線上反饋出的最終細(xì)胞濃度差異也僅在20 mg·L-1左右。此外，一個現(xiàn)象值得關(guān)注，以2%的接種量進行1000 mg·L-1萘的生物降解時，當(dāng)反應(yīng)時間超過4 d后，反應(yīng)體系中殘留的萘在消除揮發(fā)干擾后濃度基本保持不變，萘的去除率從生物降解72 h的58%提高到最大89%左右。這一實驗經(jīng)多次驗證，均得到非常相近的實驗結(jié)果，即生物降解能夠進行，但該菌株在特定體系中無法實現(xiàn)對萘的全降解，其原因有待深入的實驗分析。綜合考慮降解效果和處理成本，5%的接種量被用于后續(xù)實驗研究中。

2.3 初始pH對約氏不動桿菌降解萘特性的影響

無機鹽培養(yǎng)基的初始酸堿環(huán)境對菌株降解萘產(chǎn)生較大影響。圖3指出，當(dāng)初始pH降低到6.6以下時，細(xì)胞的活力快速下降；當(dāng)達(dá)到5.5時，1000 mg·L-1萘的去除率在消除其揮發(fā)干擾后僅為38%左右。穩(wěn)定的生物降解作用發(fā)生在pH為6.6至偏堿性范圍內(nèi)，表現(xiàn)為細(xì)胞生長穩(wěn)定，在經(jīng)過72 h的生物降解后，萘的去除率均保持在70%左右，說明該菌株至少在近中性范圍內(nèi)能夠保持較高的活力。實驗還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始pH超過7.3時出現(xiàn)一個嚴(yán)重問題，無機鹽培養(yǎng)基的溶解度下降，即便在39℃的溫度環(huán)境下進行溶解也會出現(xiàn)明顯的沉淀現(xiàn)象，因此，本文主要研究了在初始pH低于7.3時萘的生物降解特性。

圖3 約氏不動桿菌在不同初始pH下的細(xì)胞生長與萘降解

2.4 約氏不動桿菌對萘的最大耐受濃度

圖4是菌株在初始萘濃度為1600、1800、2000 mg·L-1的選擇培養(yǎng)基中萘的揮發(fā)以及細(xì)胞生長和底物降解情況。萘的揮發(fā)性除了受溫度影響很大以外，也受到萘濃度的影響，特別是對于高濃度萘溶液，萘的揮發(fā)尤為明顯，隨著萘濃度從1600 mg·L-1增加至2000 mg·L-1，其揮發(fā)率提高了5%左右。消除萘的揮發(fā)干擾后，從細(xì)胞生長和底物降解曲線清晰可見，在極限濃度中，隨著底物增加，細(xì)胞克服底物抑制作用經(jīng)歷了更長的生長延滯期，為底物的快速降解和新細(xì)胞的合成貯備能源和物質(zhì)基礎(chǔ)。以2000 mg·L-1的最大耐受濃度為例，在反應(yīng)前70 h細(xì)胞一直處于生長延滯期，萘的快速降解發(fā)生在整個反應(yīng)的后半階段，在70 h以后，細(xì)胞逐漸進入旺盛代謝階段，濃度迅速增加，因此實現(xiàn)了萘的快速降解，表現(xiàn)為降解曲線陡降。另外，底物濃度越高，最終的生物量越大。不過，隨著底物濃度的不斷增加，細(xì)胞得率減小，從1600~1800 mg·L-1細(xì)胞濃度增加了71 mg·L-1，而從1800～2000 mg·L-1細(xì)胞濃度僅增加了57 mg·L-1，其差值是由于消耗的萘用以克服高濃度反應(yīng)體系中更加強烈的底物抑制作用，以維持自身的生長，最終導(dǎo)致細(xì)胞得率降低。2000 mg·L-1即為約氏不動桿菌在特定培養(yǎng)條件下的最大耐受濃度；當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)以50 mg·L-1增加時，生物降解作用停止。

圖4 約氏不動桿菌在高濃度含萘培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長與萘降解

2.5 約氏不動桿菌降解萘動力學(xué)研究

在50～2000 mg·L-1范圍內(nèi)研究了約氏不動桿菌降解萘的細(xì)胞生長與底物降解特性。

2.5.1 約氏不動桿菌降解萘的細(xì)胞生長動力學(xué)

（1）Monod方程

采用Monod方程模擬不同初始濃度萘生物降解動力學(xué)，為求得Monod方程參數(shù)max及S，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求解。各初始底物濃度下的Monod方程結(jié)果如表1所示。

表1 約氏不動桿菌降解不同初始濃度萘的細(xì)胞生長動力學(xué)

Note: “—” indicates negative value.

由表1可見，當(dāng)萘的濃度為50 mg·L-1時，采用雙倒數(shù)作圖法擬合的直線20.995，1/max與1/具有良好的線性關(guān)系，Monod方程適合描述該菌在特定環(huán)境中的細(xì)胞生長行為。但是，當(dāng)萘濃度增大到100 mg·L-1后，相關(guān)系數(shù)減小到0.950，且隨著初始萘濃度的增加而逐漸減小，直至底物濃度增大到400 mg·L-1時，斜率S為負(fù)值，此時，1/max與1/之間已不存在線性關(guān)系。當(dāng)初始萘含量較低時，底物對菌株的抑制作用小，此時，反應(yīng)體系主要表現(xiàn)為底物限制作用，反應(yīng)體系中的萘總體表現(xiàn)為對微生物生長的促進作用，細(xì)胞只需經(jīng)過短暫的調(diào)整期即可進入旺盛生長階段，表現(xiàn)為快速增長的細(xì)胞比生長速率和底物比降解速率；反之，當(dāng)初始底物濃度較高時，由于有機毒性對細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，而這種抑制在Monod模型中并未通過在Haldane模型中的底物抑制常數(shù)得以體現(xiàn)，因此，在底物增加到一定濃度后再以1/max對1/作圖時，斜率出現(xiàn)負(fù)值。不過，在任一特定高濃度底物的生物降解體系中，隨著底物消耗與細(xì)胞累積，底物對微生物的抑制作用逐漸減小，細(xì)胞比生長速率逐漸提高。上述研究表明，當(dāng)反應(yīng)體系中初始底物濃度較低、有機毒性較小時，Monod方程能夠描述細(xì)胞的生長過程；反之，則不適合。不過，對于不同的生物降解體系，Monod方程有其不同的底物濃度適用范圍。

（2）Haldane方程

采用Haldane方程對不同初始濃度的萘生物降解過程中細(xì)胞生長行為進行動力學(xué)模擬[18,21]，將所得實驗數(shù)據(jù)運用MATLAB軟件使用非線性最小二乘法進行回歸，得到約氏不動桿菌降解萘的細(xì)胞生長動力學(xué)方程

回歸過程中得到的殘差是1.52×10-3。圖5是不同初始萘濃度下約氏不動桿菌比生長速率的實驗值與理論值對照。由圖可知，回歸曲線與實驗數(shù)據(jù)點吻合良好，表明Haldane方程適合描述約氏不動桿菌降解萘的動力學(xué)行為。其中，細(xì)胞的最大比生長速率發(fā)生在初始萘濃度為174 mg·L-1，在曲線左側(cè)部分，反應(yīng)體系中主要表現(xiàn)為底物限制作用，即碳源的不足限制了細(xì)胞生長；而在最高點右側(cè)則是底物抑制作用占主導(dǎo)，有機毒性抑制了細(xì)胞生長；同其他相關(guān)動力學(xué)研究體系相比，萘對該菌株表現(xiàn)出抑制作用的濃度相對較高[22-24]。這一結(jié)果也再次證實，Monod模型不適用于高濃度底物的實驗體系（表1）。

圖5 不同初始萘濃度下的細(xì)胞生長動力學(xué)模型預(yù)測值與實驗數(shù)據(jù)點的對照

2.5.2 約氏不動桿菌降解萘的底物降解動力學(xué)

將回歸得到的細(xì)胞比生長速率與萘比降解速率進行線性擬合，得到約氏不動桿菌降解萘的動力學(xué)方程

圖6是在不同初始萘濃度下，利用實驗數(shù)據(jù)得到的萘比降解速率與用MATLAB回歸出的比降解速率的對照?？梢钥闯隼肏aldane模型回歸出的方程曲線與實驗數(shù)據(jù)點吻合良好，表明Haldane方程能夠用來表征約氏不動桿菌降解萘的動力學(xué)行為。當(dāng)?shù)孜餄舛葟?74 mg·L-1增加至1000 mg·L-1時，細(xì)胞從底物飽和狀態(tài)進入到底物抑制環(huán)境中，有機毒性對細(xì)胞的抑制作用迅速增加，因此，底物比降解速率下降較快；而在高濃度有機環(huán)境中，細(xì)胞處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，在不同初始濃度的底物環(huán)境中，無論是細(xì)胞比生長速率還是底物比降解速率差別并不明顯，綜合細(xì)胞降解曲線分析（圖4），此時能否實現(xiàn)生物降解主要取決于細(xì)胞能否克服底物抑制作用而擺脫生長延滯期。

圖6 不同初始萘濃度下的萘降解動力學(xué)模型預(yù)測值與實驗數(shù)據(jù)點的對照

3 結(jié) 論

（1）實驗用約氏不動桿菌在35～40℃的中溫環(huán)境中保持了相對穩(wěn)定的降解能力，特別在37 ℃下表現(xiàn)出最佳的降解能力；接種量對該菌的降解特性也產(chǎn)生較大影響，過低的接種量會導(dǎo)致該菌在特定的萘濃度中不能實現(xiàn)對底物的全降解，綜合考量處理成本選擇5%的接種量。

（2）從廢油中分離得到的約氏不動桿菌具有較強的降解萘能力：該菌能夠以萘作準(zhǔn)一碳源實現(xiàn)代謝；在低于174 mg·L-1的初始底物濃度中，反應(yīng)體系主要表現(xiàn)為底物限制作用，相比于其他生物降解體系，這一極限值較高，體現(xiàn)出該菌對于萘的耐受性較強；在優(yōu)化條件下，該菌株對萘的最大耐受濃度可以達(dá)到2000 mg·L-1，并能實現(xiàn)全降解。

（3）動力學(xué)對比研究發(fā)現(xiàn)，在本實驗體系中，Haldane模型適合于描述在不同初始萘濃度下的細(xì)胞生長和底物降解行為；而Monad模型只適合于描述低濃度下萘的生物降解特性，當(dāng)生物降解體系表現(xiàn)為底物抑制作用占主導(dǎo)時，該模型不再適用。

符 號 說 明

CS——底物濃度 KS——半飽和常數(shù) R2——線性相關(guān)系數(shù) μ——細(xì)胞比生長速率 μmax——最大比生長速率

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Naphthalene biodegradation by

JIANG Yan, ZHANG Xiaohua, YANG Ying, ZHANG Xianming

(Engineering Research Center for Waste Oil Recovery Technology and Equipment of Ministry of Education,Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China)

Naphthalene, typical of polycyclic aromatic hydrocarbons, is highly poisonous and hardly degradable. As the typical petroleum hydrocarbon composition, it is a severe environmental pollutant, and therefore there exists great difficulty in the bioremediation of oil-contaminated sites. Due to its poor water solubility, researches on naphthalene degradation are hindered seriously. In this paper, the strain ofisolated from waste oil is employed to study naphthalene biodegradation with the ability both to degrade petroleum hydrocarbon and to wet inorganic impurities. The reaction conditions are optimized based on the researches on degradation factors and the biodegradation characteristics of naphthalene are manifested in the range of 50 to 2000 mg·L-1. The dynamics behavior of.is studied on the degradation of naphthalene through the comparison of the Monod model and the Haldane model. The results indicated that the strain could utilize naphthalene as sole carbon and energy source to metabolize and 2000 mg·L-1naphthalene could be entirely degraded within about 146 h at 5% inoculum volume and 37℃. The Haldane model is suitable to describe cell growth and the substrate degradation behaviors while the Monod model is appropriate to depict naphthalene biodegradation with low initial concentration.

naphthalene; degradation; petroleum; environment;; kinetics; substrate inhibition

supported by the National Natural Science Foundation of China (21376285), the Natural Science Foundation of Chongqing (CSTC2013jcyjA20014), Chongqing Key Project of Applied Technology Development (cstc2014yykfB90002), Chongqing Board of Education Key Project of Science and Technology (KJZH14210) and the Scientific Platform Project, Ministry of Education (FYKF201506).

date: 2016-01-03.

Dr. JIANG Yan, jiangyan@ctbu.edu.cn

X 592；X 172

A

0438—1157（2016）09—3981—07

10.11949/j.issn.0438-1157.20151992

國家自然科學(xué)基金項目（21376285）；重慶市自然科學(xué)基金項目（CSTC2013jcyjA20014）；重慶市應(yīng)用技術(shù)開發(fā)重點項目（cstc2014yykfB90002）；重慶市教委科技資助重點項目（KJZH14210）；教育部平臺科技資助項目（FYKF201506）。

2016-01-03收到初稿，2016-05-06收到修改稿。

聯(lián)系人及第一作者：姜巖（1971—），男，博士，教授。