擬南芥WHIRLY2基因超表達(dá)引起擬南芥角果發(fā)育異常的分子細(xì)胞學(xué)分析

黃晨星, 任育軍, 李燕云, 繆　穎

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞與系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

?

擬南芥WHIRLY2基因超表達(dá)引起擬南芥角果發(fā)育異常的分子細(xì)胞學(xué)分析

黃晨星, 任育軍, 李燕云, 繆穎

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞與系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

通過(guò)構(gòu)建擬南芥WHIRLY2基因超表達(dá)植株和鑒定這個(gè)基因的突變體，對(duì)WHIRLY2基因調(diào)控?cái)M南芥角果的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了分析.表型觀察結(jié)果顯示過(guò)量表達(dá)WHIRLY2基因的植株角果發(fā)育異常，出現(xiàn)變黃、干癟和早衰現(xiàn)象，角果果皮細(xì)胞中葉綠體的數(shù)量明顯比野生型少，葉綠體中淀粉粒的數(shù)目比野生型明顯增多.進(jìn)一步對(duì)角果發(fā)育、能量代謝、線粒體基因組穩(wěn)定、葉綠體淀粉粒代謝相關(guān)基因的表達(dá)豐度進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)WHIRLY2超表達(dá)植株角果中與線粒體能量代謝相關(guān)的nad1、cytc382、rad50和同時(shí)作用于線粒體和葉綠體的atp9基因的表達(dá)發(fā)生變化.通過(guò)線粒體基因組的結(jié)構(gòu)分析和蛋白質(zhì)凝膠遷移試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)WHIRLY2蛋白可以結(jié)合在線粒體基因組的nad1和cytc382基因啟動(dòng)子的4個(gè)端粒重復(fù)序列AAAATCCCC上，推測(cè)WHIRLY2可能通過(guò)調(diào)控nad1和cytc382基因的轉(zhuǎn)錄從而參與角果發(fā)育的調(diào)控.

擬南芥; 角果發(fā)育; 擬南芥WHIRLY2; nad1; cytc382

WHIRLY蛋白家族是一類雙定位于細(xì)胞器和細(xì)胞核的單鏈DNA結(jié)合蛋白的小家族[1].在擬南芥中它有3個(gè)成員，WHIRLY1和WHIRLY3雙定位于葉綠體和細(xì)胞核中，而WHIRLY2雙定位于線粒體和細(xì)胞核中[1].首個(gè)被鑒定出的WHIRLY家族成員為p24，Desveauxetal[2]從馬鈴薯(Solanum tuberosum)中將其分離出來(lái)，并發(fā)現(xiàn)它是轉(zhuǎn)錄激活因子PBF-2 (PR-10abindingfactor2)，可以與誘導(dǎo)應(yīng)答元件ERE(elicitorresponseelement)以單鏈形式結(jié)合從而調(diào)節(jié)馬鈴薯病原相關(guān)基因pr-10a的表達(dá)，傳遞抗病信號(hào)，后被命名為StWHY1.隨后，在眾多植物中均發(fā)現(xiàn)WHIRLY家族的存在[1].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，WHIRLY家族在不同生物進(jìn)程中行使不同的功能.鑒定結(jié)果表明WHIRLY1除了能調(diào)控病原相關(guān)基因的表達(dá)外，在細(xì)胞核中還能夠維持端粒長(zhǎng)度的穩(wěn)態(tài)，能夠結(jié)合在脅迫相關(guān)基因的啟動(dòng)子上，調(diào)控衰老相關(guān)基因的表達(dá).在擬南芥中WHIRLY蛋白還參與維持細(xì)胞器基因組的穩(wěn)定性[3].

WHIRLY2是WHIRLY家族的成員之一[2]，早期對(duì)WHIRLY2功能的研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中超表達(dá)全長(zhǎng)的WHIRLY2會(huì)導(dǎo)致葉片早衰和角果發(fā)育變小，推測(cè)這與線粒體的呼吸鏈有關(guān)[4,5].最近，Caietal[6]發(fā)現(xiàn)花粉管中WHIRLY2與線粒體的基因組的穩(wěn)定性與DNA數(shù)量有關(guān).本研究基于超表達(dá)和敲除WHIRLY2突變體的表型觀察，從石蠟切片、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)以及分子水平上揭示W(wǎng)HIRLY2對(duì)角果發(fā)育調(diào)控的分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)理，為WHIRLY2功能的研究提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1材料

野生型擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Arabidopsis thalianaColumbia)均勻鋪種在濕濾紙上，4 ℃春化2d后移至人工氣候室中萌發(fā)1d，轉(zhuǎn)至蛭石上生長(zhǎng).培養(yǎng)溫度為22.5 ℃，濕度為60%，光周期為13h光照∶11h黑暗，光強(qiáng)100μmol·s-1·m-2.植株生長(zhǎng)至4周以及7周后分別獲取蓮座葉以及角果，液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆?WHIRLY2的T-DNA插入突變體Salk_118900和Salk_118907購(gòu)自Salk研究所，并根據(jù)網(wǎng)站提供的引物序列進(jìn)行基因組插入篩選(http://signal.salk.edu/)，獲得WHIRLY2T-DNA插入敲除型純合突變體(why2).

1.2方法

1.2.1擬南芥WHIRLY2基因超表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定應(yīng)用5′端引物加CACC和3′端引物加FLAG標(biāo)簽序列，從擬南芥野生型cDNA庫(kù)中擴(kuò)增全長(zhǎng)WHIRLY2編碼序列，利用Gateway系統(tǒng)，將擴(kuò)增片段克隆入pENTR-TOPO載體中，測(cè)序驗(yàn)證WHIRLY2編碼序列的正確性；然后和終端超表達(dá)載體pB2WG7進(jìn)行LR重組反應(yīng)，篩選獲得陽(yáng)性克隆，電激轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，采用浸花法侵染W(wǎng)HIRLY2敲除型突變體擬南芥未開放的花蕾.T1代苗期用0.1% (體積分?jǐn)?shù))Basta篩選獲得10個(gè)以上陽(yáng)性株系，T2代進(jìn)行遺傳分離試驗(yàn)，在T3代獲得純合超表達(dá)轉(zhuǎn)基因(oe-WHY2)植株，并用于表型觀察和后續(xù)試驗(yàn).

1.2.2擬南芥T-DNA插入突變體的Northernblot鑒定利用TRIzol試劑提取4周齡蓮座葉的總RNA，電泳檢測(cè)完整性后于-80 ℃保存.取10μg左右總RNA，根據(jù)Miaoetal的方法[5]，經(jīng)甲醛變性膠電泳、轉(zhuǎn)膜、預(yù)雜交、雜交和洗脫，最后在PhosphateImage上通過(guò)X膠片曝光獲得結(jié)果.探針為32P標(biāo)記的WHIRLY2全長(zhǎng)編碼序列.

1.2.3組織切片技術(shù)和超微結(jié)構(gòu)觀察剪取溫室中生長(zhǎng)7周齡植株的角果投入FAA固定液(100mLFAA中含38%(體積分?jǐn)?shù))甲醛5mL、冰醋酸5mL、70%(體積分?jǐn)?shù))酒精90mL)中固定12h；而后進(jìn)行乙醇梯度脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋和切片，切片厚度5～8μm，脫蠟后甲苯胺藍(lán)染色，光學(xué)顯微鏡觀察角果組織的結(jié)構(gòu)并拍照.

取上述新鮮角果投入2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛中固定2h，磷酸緩沖液漂洗后用1%(體積分?jǐn)?shù))鋨酸繼續(xù)固定1h，利用磷酸緩沖液漂洗后經(jīng)丙酮梯度脫水.組織經(jīng)環(huán)氧樹脂包埋后手工修整，然后利用超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片；醋酸鈾染色10～20min后電鏡觀察并拍照.

1.2.4qRT-PCR試驗(yàn)從oe-WHY2、why2突變體和野生型7周植株的角果中提取的總RNA經(jīng)DNaseⅠ消化，然后利用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(Thermo)進(jìn)行cDNA第1鏈的合成，再采用CFXConnectTMReal-Time系統(tǒng)(BIO-RAD)對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增和檢測(cè).反應(yīng)體系為15μL，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的具體步驟參考北京康為生物公司(CWBIO)生產(chǎn)的UltraSYBRMixture(withROX)試劑(CW0956)說(shuō)明書，每管加入0.2μmol·L-1的擴(kuò)增引物以及20ng合成的第1鏈cDNA.擬南芥Actin2基因作為內(nèi)參基因，其它基因的表達(dá)參照Actin2計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，并將野生型中相應(yīng)基因的表達(dá)設(shè)為1，利用3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)得到的結(jié)果計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差.qRT-PCR中所用的引物為.

mre11-FP：AACAAATCTCAGCCTCGGGTTAC.mre11-RP：AGAAGTTGTTCCGCTTGAGAGGTC.rad50-FP：CCCGCTCTTACAGCTACAAGGTTC.rad50-RP：TTGACCTGCACTGCATCTTCCTC.nbs1-FP：CTTCACTGATACCACCATCCGTTG.nbs1-RP：GCTTCAGAATCCGCTACCACTG.phs1-FP：GCAGGCCAAACAACTGTGAAGC.phs1-RP：CGTGCTACCTACACATCGATCTCC.atp9-FP：CTCCGTGGGTATAAGATCGCAAAG.atp9-RP：TCGTCGATTCTTACCCTCGTTCC.nad1-FP：ACCAGATCAAAGGCTGGCAT.nad1-RP：TCCTGCATTGCTTGACACCA.cytc382-FP：TTGACGGAGCTCTTGGCATT.cytc382-RP：ATTCTGCAAGCGGTTCGGTA.

1.2.5凝膠遷移試驗(yàn)(EMSA)參考Miaoetal抽提擬南芥總蛋白的方法[7]提取野生型、oe-WHY2和why2突變體角果中的總蛋白，應(yīng)用Bradford法測(cè)定總蛋白的濃度.體外合成線粒體nad1啟動(dòng)子區(qū)端粒重復(fù)序列的編碼區(qū)(tel-cs)、非編碼區(qū)(tel-ncs)、端粒雙鏈(tel-ds)、轉(zhuǎn)錄的RNA(tel-RNA)探針，經(jīng)PCR擴(kuò)增后純化回收.根據(jù)Miaoetal的方法[8]進(jìn)行凝膠遷移電泳，探針用帶32P標(biāo)記的ATP進(jìn)行T4-ligase法標(biāo)記.WHIRLY2蛋白與標(biāo)記的探針在10μL結(jié)合體系中室溫孵育30min后，置于0.04g·mL-1非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，同時(shí)分別進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn).電泳結(jié)束后紫外交聯(lián)5～10min，直接曝光檢測(cè).

2　結(jié)果與分析

2.1WHIRLY2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建和敲除型突變體植株的獲得與驗(yàn)證

為了進(jìn)一步考察WHIRLY2蛋白在擬南芥角果發(fā)育過(guò)程中的功能，本試驗(yàn)構(gòu)建了WHIRLY2超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化并獲得10個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)T2代進(jìn)行遺傳分離試驗(yàn)，并在T3獲得了表達(dá)WHIRLY2的純合體轉(zhuǎn)基因株系(oe-WHY2).同時(shí)從Salk研究所購(gòu)買了2個(gè)不同T-DNA插入位置的WHIRLY2敲除突變體why2-1和why2-2(圖1).Northern雜交的結(jié)果表明這2個(gè)突變體中WHIRLY2的mRNA水平幾乎檢測(cè)不出來(lái)，而野生型植株中可以檢測(cè)到600bp的mRNA信號(hào)(圖2)，與WHIRLY2mRNA的一致.半定量PCR的結(jié)果進(jìn)一步表明why2突變體中WHIRLY2的表達(dá)水平明顯比野生型低，而3個(gè)超表達(dá)的純合系(oe-L1、oe-L2和oe-L3)中WHIRLY2表達(dá)水平則明顯比野生型高(圖2).

2.2WHIRLY2對(duì)擬南芥角果發(fā)育及果皮細(xì)胞中葉綠體和質(zhì)體內(nèi)淀粉粒數(shù)量的影響

野生型、oe-WHY2和why2植株在光強(qiáng)100 μmol·s-1·m-2、溫度22.5 ℃和濕度60%的條件下生長(zhǎng)至第7周，觀察3種WHIRLY2不同表達(dá)背景下角果的發(fā)育狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)oe-WHY2植株的角果發(fā)育異常，出現(xiàn)干癟、黃化和早衰現(xiàn)象，而why2的角果與野生型相比并未發(fā)現(xiàn)異常(圖3).進(jìn)一步對(duì)oe-WHY2、why2和野生型的角果進(jìn)行組織切片觀察，發(fā)現(xiàn)oe-WHY2發(fā)育異常的角果的果皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體的數(shù)目相對(duì)于野生型呈極顯著下降(圖4、5)，而why2突變體的角果與野生型比較變化不大，其他組織的結(jié)構(gòu)也沒有顯著變化(圖4).電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，oe-WHY2異常發(fā)育的角果的果皮細(xì)胞葉綠體基粒類囊體和基質(zhì)類囊體以及線粒體都未發(fā)生結(jié)構(gòu)性改變，但葉綠體中淀粉粒累積的數(shù)量比野生型顯著增多，而why2突變體角果的果皮細(xì)胞的葉綠體內(nèi)淀粉粒數(shù)目比野生型略有減少，對(duì)5個(gè)細(xì)胞10個(gè)葉綠體的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明沒有顯著性差異(圖4、5).因此WHIRLY2超表達(dá)引起的角果發(fā)育異?？赡芘c葉綠體的穩(wěn)定性以及葉綠體中淀粉的合成代謝有關(guān).

2.3WHIRLY2蛋白對(duì)角果發(fā)育基因表達(dá)的影響

基于研究結(jié)果[4，6]，本研究對(duì)近60個(gè)與能量代謝、角果發(fā)育、線粒體基因組穩(wěn)定以及葉綠體淀粉代謝相關(guān)的基因在野生型、oe-WHY2和why2的角果中的表達(dá)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，其中nad1、cytc382和rad50三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平在超表達(dá)的角果中呈顯著性上調(diào)，在敲除型的角果中呈明顯下調(diào)；atp9基因的轉(zhuǎn)錄水平在超表達(dá)和敲除型中都表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)(圖7).而nad1、ctyc382和atp9都是線粒體基因組編碼的基因.

2.4WHIRLY2蛋白結(jié)合線粒體基因組的單鏈端粒重復(fù)序列

采用WHIRLY2蛋白的結(jié)合序列與整個(gè)線粒體基因組序列進(jìn)行比對(duì)，考察nad1、cytc382和atp9三個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)nad1和ctyc382共享相同的啟動(dòng)子區(qū)域，而且啟動(dòng)子區(qū)域有4個(gè)重復(fù)的端粒序列(圖7).因此通過(guò)人工合成4個(gè)重復(fù)端粒序列的DNA編碼鏈(4×Tel-cd)、非編碼鏈(4×Tel-ncd)和RNA鏈(4×Tel-RNA),并提取WHIRLY2超表達(dá)和敲除型突變體植株葉片的蛋白質(zhì)進(jìn)行凝聚電泳遷移試驗(yàn).結(jié)果表明，WHIRLY2超表達(dá)植株的蛋白與4×Tel-cd片段溫浴后可形成特異的復(fù)合物，而該復(fù)合物在why2中沒有形成.由此推測(cè)WHIRLY2能結(jié)合在線粒體基因組4×Tel上，調(diào)控下游基因nad1和cytc382基因的表達(dá).

3　討論

本研究發(fā)現(xiàn)超表達(dá)WHIRLY2植株的角果發(fā)育明顯異常，出現(xiàn)干癟、黃化和早衰現(xiàn)象，從細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果可知線粒體并沒有發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化，這點(diǎn)與Maréchal et al[4]的研究結(jié)果相似.但Maréchal et al[4]僅從呼吸電子傳遞系統(tǒng)開展研究，指出其原因是呼吸電子傳遞系統(tǒng)引起線粒體功能下降.而本研究通過(guò)細(xì)胞學(xué)組織切片和超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)角果的果皮細(xì)胞葉綠體數(shù)目顯著減少，葉綠體內(nèi)淀粉粒卻明顯增加.進(jìn)一步研究與角果發(fā)育、能量代謝、線粒體基因組穩(wěn)定相關(guān)的基因以及與葉綠體淀粉粒代謝相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)WHIRLY2明顯上調(diào)了nad1、細(xì)胞色素cytc-382、rad50以及atp9基因的表達(dá)，而敲除WHIRLY2則明顯下調(diào)了nad1、細(xì)胞色素cytc-382和rad50基因的表達(dá).atp9基因的表達(dá)在超表達(dá)和敲除型植株中都表現(xiàn)為上調(diào)，這表明WHIRLY2對(duì)atp9基因表達(dá)的影響是間接、多途徑的.一方面，WHIRLY2在線粒體中通過(guò)影響atp9基因的表達(dá)而影響內(nèi)含子RNA的剪接和編輯，從而影響線粒體基因組的穩(wěn)定性；另一方面WHIRLY2在葉綠體中通過(guò)影響葉綠體碳代謝途徑幾個(gè)相關(guān)基因如淀粉磷酸化酶的表達(dá)，反過(guò)來(lái)調(diào)控atp9基因的表達(dá)水平.而nad1、細(xì)胞色素cytc-382和atp9都是線粒體基因組編碼的基因，而且nad1和細(xì)胞色素cytc-382基因共享相同的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子區(qū)域有4個(gè)重復(fù)端粒序列(圖7).EMSA試驗(yàn)也證明WHIRLY2蛋白可以結(jié)合在單鏈4個(gè)重復(fù)端粒序列的啟動(dòng)子區(qū)域和4個(gè)重復(fù)端粒的RNA序列(圖8)，推測(cè)這直接影響nad1和細(xì)胞色素cytc-382基因的表達(dá)，從而影響線粒體的活力.

[1] KRAUSE K, KILBIENSKI I, MULISCH M, et al. DNA-binding proteins of the Whirly family inArabidopsisthalianaare targeted to the organelles[J]. FEBS Lett, 2005,579:3 707-3 712.

[2] DESVEAUX D, DESPRéS C, JOYEUX A, et al. PBF-2 is a novel single-stranded DNA binding factor implicated in PR-10a gene activation in potato[J]. Plant Cell, 2000,12:1 477-1 489.

[3] 林文芳,任育軍,繆穎.植物Whirly蛋白調(diào)控葉片衰老的研究進(jìn)展[J].植物生理學(xué)報(bào),2014,9:1 274-1 284.

[4] MARéCHAL A, PARENT J S, SABAR M, et al. Overexpression of mtDNA-associated AtWhy2 compromises mitochondrial function[J]. BMC Plant Biology, 2008,8(1):1-15.

[5] YOSHIDA S, ITO M, NISHIDA I, et al. Isolation and RNA gel blot analysis of genes that could serve as potential molecular markers for leaf senescence inArabidopsisthaliana[J]. Plant Cell Physiol, 2001,42(2):170-178.

[6] CAI Q, GUO L, SHEN Z R, et al. Elevation of pollen mitochondrial DNA copy number by WHIRLY2: altered respiration and pollen tube growth inArabidopsis[J]. Plant Physiol, 2015,169(1):660-673.

[7] MIAO Y, ZENTGRAF U. The antagonist function ofArabidopsisWRKY53 and ESR/ESP in leaf senescence is modulated by the Jasmonic and Salicylic acid equilibrium[J]. Plant Cell, 2007,19(3):819-830.

[8] MIAO Y, JIANG J, REN Y, et al. The single-stranded DNA-binding protein WHIRLY1 represses WRKY53 expression and delays leaf senescence in a developmental stage-dependent manner inArabidopsis[J]. Plant Physiol, 2013,163:746-756.

(責(zé)任編輯:葉濟(jì)蓉)

MolecularandcytologyanalysisofArabidopsissiliqueabnormaldevelopmentinducedbyWHIRLY2overexpression

HUANGChenxing,RENYujun,LIYanyun,MIAOYing

(CenterforMolecularCellandSystemsBiology,CollegeofLifeSciences,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China)

ToelucidatetheroleofWHIRLY2inmitochondrialactivity,overexpressingandknockoutlinesofArabidopsis thalianaColumbiawerecultured.PhenotypeanalysisshowedthatsiliqueofWHIRLY2-overexpressinglinebecamedry,yellowandshowedearlysenescence.DecreasingchloroplastnumberandincreasingstarchgranulenumberweredetectedinpericarpcellofWHIRLY2mutantscomparedtowild-typeplant.SubsequentquantitativeRT-PCRwereconductedtoanalyzeexpressionlevelsofgenesrelatedtosiliquedevelopment,energymetabolism,stabilityofmitochondrialgenomeandchloroplastdifferentiationinWHIRLY2mutants.Resultsshowedthattranscriptionlevelsofgenesinvolvedinmitochondrialenergymetabolism,includingnad1, cytc382, rad50andatp9,wereincreasedinthesiliqueofWHIRLY2-overexpressinglines.MitochondrialgenomestructureandelectrophoreticmobilityshiftassaysrevealedthatWHIRLY2proteinwasabletobindtothe4×Telomererepeatsofpromoterregionofnad1andcytc382genes.ItsuggestedthatWHIRLY2mayinfluencemitochondrialactivityviageneexpressionofnad1andcytc382toregulatesiliquedevelopmentinArabidopsis.

Arabidopsis thalianaColumbia;siliquedevelopment; WHIRLY2; nad1; cytc382

2016-02-06

2016-03-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31470383、31400260);福建省“百人計(jì)劃”基金資助項(xiàng)目(KXR14002A).

黃晨星(1987-),男,碩士.研究方向：植物細(xì)胞生物學(xué).Email：hcx3444544@sina.com.通訊作者繆穎(1965-),女,教授,博士生導(dǎo)師.研究方向：植物分子細(xì)胞生物學(xué).Email：ymiao@fafu.edu.cn.

Q291

A

1671-5470(2016)03-0277-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.007