基于譜-效相關(guān)的雷公藤抗炎藥效物質(zhì)的研究△

董捷鳴，續(xù)暢，宮嫚，趙慶國，王伽伯，肖小河，馬致潔*，浦仕彪，3*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合研究中心，北京 100039；3.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650200)

基于譜-效相關(guān)的雷公藤抗炎藥效物質(zhì)的研究△

董捷鳴1，續(xù)暢1，宮嫚2，趙慶國2，王伽伯2，肖小河2，馬致潔1*，浦仕彪1，3*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050；2.解放軍302醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合研究中心，北京 100039；3.云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650200)

目的：基于譜-效相關(guān)分析方法，對雷公藤體外抗炎藥效物質(zhì)進(jìn)行初步篩選。方法：運用LC-Q/TOF-MS技術(shù)表征不同產(chǎn)地雷公藤的化學(xué)成分并初步指認(rèn)其成分；以小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)為模型，檢測細(xì)胞上清液中的白介素-6和白介素-10及誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶，評價雷公藤的體外抗炎效應(yīng)。采用相關(guān)回歸分析方法分析效應(yīng)與成分之間的關(guān)系。結(jié)果：指認(rèn)出雷公藤的10個有效成分；確認(rèn)BMDM模型可以有效評價雷公藤體外抗炎效應(yīng)，并通過簡單及多元相關(guān)回歸分析可知雷公藤甲素、雷公藤晉堿應(yīng)對雷公藤抗炎效應(yīng)有較大相關(guān)。結(jié)論：雷公藤晉堿可能與雷公藤抗炎效應(yīng)相關(guān)性較高。

雷公藤；抗炎效應(yīng)；譜-效相關(guān)；巨噬細(xì)胞；雷公藤晉堿

雷公藤是我國傳統(tǒng)中藥，素來有古方記載。最早出現(xiàn)在《神農(nóng)本草經(jīng)》之中，為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物雷公藤的根，又叫黃騰、黃臘騰、紅藥、水莽草等[1]。雷公藤性寒，味苦，有大毒，以肝、腎、生殖器毒性最為顯著[2-3]，但又因其在自身免疫疾病方面有著不可替代的治療效果，廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病[4-5]。

由于雷公藤在治療自身免疫性疾病等難治疾病上的重要地位，使其成為研究的熱點。但臨床上總體治療指數(shù)低，不良反應(yīng)的發(fā)生率遠(yuǎn)高于其他藥物。為保障臨床應(yīng)用的安全性和有效性，急待有效的質(zhì)量控制方法[6-8]。目前雷公藤質(zhì)量控制主要有測定總量、測定單一成分、測定多指標(biāo)成分及指紋圖譜等手段[9]。近年來，為了提高雷公藤質(zhì)量控制水平，有研究者采用LC-MS/MS建立了同時測定雷公藤藥材中雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤定堿、雷酚內(nèi)酯5種活性成分的質(zhì)控方法[10]。但由于雷公藤藥效與毒性物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，含量測定的指標(biāo)性成分與藥效、毒性的關(guān)聯(lián)性不強，難以保證藥材的安全性及有效性。本實驗旨在擬結(jié)合近年來發(fā)展迅速的生物評價方法對雷公藤進(jìn)行譜效相關(guān)分析，初步探索其抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)，為雷公藤的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent Technology 1290 Infinity UPLC超高效液相色譜儀，Agilent Technology iFunnel 6550 LC-Q-TOF /MS四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜，1290二極光陣列檢測器(G4212A)；Gradient A10 Mill-Q 超純水器(美國 Millipore公司)；微量分析天平(Mettler Toledo AL204，瑞士)；冷凍離心機(Sigma，德國)。

IX71型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；SynergyTMHT多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；AL204微量分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ZK-82B型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；SG403A-HE生物安全柜(美國Baker公司)；恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(美國NAPCO公司)。

1.2 材料

收集浙江、江西、安徽等23個不同地區(qū)的雷公藤干燥根，依次編號，樣品信息見表1。所有樣品均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科主任趙奎君教授鑒定為正品。

甲醇、乙腈(色譜級，德國Merck公司)，甲酸，去離子水，0.22 μm微孔濾膜(津騰)，其他試劑均為市售分析純。

胎牛血清(美國Gibco，批號：16000-044)，DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone，批號：SH30022.01B)，青霉素/鏈霉素雙抗溶液(SV30010，美國Hyclone)，胰蛋白酶(美國Gibco，批號：25200-056)，二甲基亞砜(DMSO，德國Sigma-Aldrich，批號：D2650)；柳氮磺吡啶腸溶片(山西晉新雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號：131102)；實驗細(xì)胞選用小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)細(xì)胞系，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。

表1 23批雷公藤樣品編號及產(chǎn)地信息

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18600 Bar(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：A為CH3CN(含0.1% HCOOH)，B為H2O(含0.1% HCOOH)；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：4 μL；柱溫：30 ℃；樣品溫度：4 ℃；檢測波長：190～420 nm；色譜梯度洗脫條件為：1～8 min，A-B(95∶5)；9～18 min，A-B(60∶40)；19～25 min，A-B(0 ∶100)。

離子源：ESI；毛細(xì)管電壓：4000 V；質(zhì)/核比范圍：m/z80～1000；脫溶劑氣溫度：225 ℃；脫溶劑氣流量：11 L·min-1；霧化器壓力：45 psi(1 psi=6.895 kPa)；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L·min-1；噴嘴電壓：500 V。

2.2 指紋圖譜樣品的制備

取23批不同產(chǎn)地雷公藤樣品干浸膏適量，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇水溶液10 mL-1，超聲溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，配制成2 mg·mL-1(以生藥量計)的供試品溶液。

2.3 基于Elisa法評價雷公藤提取物抗炎效應(yīng)

雷公藤藥物及柳氮磺吡啶作用BMDM細(xì)胞的IC50及給藥時間已有相應(yīng)實驗作為參考[11]。

將BMDM細(xì)胞以1.5×106個/孔種于6孔板中，分別為正常組、柳氮磺砒啶陽性藥組及23組雷公藤提取物。待細(xì)胞貼壁后，分別加入以雷公藤提取物及柳氮磺砒啶的半數(shù)抑制濃度(IC50)為質(zhì)量濃度的各藥含藥血清，每孔200 μL。作用24 h后，分別取各孔上清液，-70℃儲存?zhèn)溆谩２捎肊lisa法對各上清液中的促炎因子白細(xì)胞介素(IL)-6、抑炎因子IL-10及促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)的誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)進(jìn)行測定，具體步驟參照試劑盒。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果及分析

3.1 23批雷公藤指紋圖譜

由圖1可見不同地區(qū)雷公藤化學(xué)成分含量差異較大，為驗證這些差異與其雷公藤產(chǎn)地是否有內(nèi)在的相關(guān)性，我們采用SIMCA-P-11軟件對23批藥材的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析(PCA)，尋找化學(xué)成分差異和產(chǎn)地之間的關(guān)系。

如圖2所示，除了浙江金華的樣品外，其余樣品主要分在3個區(qū)域。產(chǎn)地特別接近的樣品聚集較明顯，但這種分布規(guī)律與產(chǎn)地之間無明顯相關(guān)性，其原因可能與樣品產(chǎn)地比較分散有一定關(guān)系，但從主成分分析結(jié)果可以佐證質(zhì)譜表征的結(jié)果，即不同樣品內(nèi)在的化學(xué)成分差異較大。

圖1 23批不同地區(qū)雷公藤指紋圖譜

圖2 不同產(chǎn)地雷公藤藥材的PCA主成分分析

3.2 雷公藤指紋圖譜指認(rèn)10個主要成分

指紋圖譜指認(rèn)的雷公藤10個主要成分信息見表2。

表2 雷公藤指紋圖譜指認(rèn)的10個主要成分

3.3 各藥提取物作用BMDM細(xì)胞的上清液中IL-6、IL-10及iNOS檢測結(jié)果

由表3可知，IL-6組別中陽性藥及各雷公藤提取物作用BMDM細(xì)胞24 h后，各組細(xì)胞上清液中IL-6的質(zhì)量濃度均高于正常組(P<0.05)；而雷公藤提取物中，除江西萍鄉(xiāng)、云南、河北安國、江西樟樹、福建三明的樣品外，其他樣品上清液中IL-6的質(zhì)量濃度均低于陽性藥柳氮磺砒啶組(P<0.05)。

IL-10組別中可看出陽性藥及各雷公藤提取物作用BMDM細(xì)胞24 h后，除浙江金華、湖南岳陽縣、云南菊花藥市、廣西清平的樣品外，其他樣品及陽性藥細(xì)胞上清液中IL-10的質(zhì)量濃度均高于正常組(P<0.05)；而雷公藤提取物中，除上述樣品外，其余樣品細(xì)胞上清液中IL-10的質(zhì)量濃度均高于陽性藥組，其中貴州黔東南苗族侗族自治州劍河縣、湖北通城、安徽毫州、福建三明市泰寧朱口鎮(zhèn)神下村、福建三明市泰寧朱口鎮(zhèn)垇頭村、貴州黔東南苗族侗族自治州雷州縣的樣品與陽性藥柳氮磺砒啶之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

iNOS組別檢測結(jié)果可看出，陽性藥及各雷公藤提取物作用BMDM細(xì)胞24 h后，其細(xì)胞上清液中iNOS的濃度均高于正常組，其中陽性藥及江西遂州、貴州黔東南苗族侗族自治州劍河縣、湖南邵陽、湖南岳陽縣、云南菊花藥市、安徽毫州、北京、河北安國、福建三明市、貴州黔東南苗族侗族自治州雷州縣的樣品與正常組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；而各雷公藤提取物的細(xì)胞上清液中iNOS的濃度均低于陽性藥組，且除貴州黔東南苗族侗族自治州劍河縣、湖南岳陽縣、云南菊花藥市、安徽毫州、河北安國、福建三明市泰寧朱口鎮(zhèn)垇頭村的樣品外，其余各樣品與陽性藥柳氮磺砒啶之間均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

3.4 雷公藤主要成分與抗炎效應(yīng)的簡單相關(guān)及回歸分析

為了獨立考察各成分與抑炎因子IL-10檢測水平之間的相關(guān)性，以各批次雷公藤對IL-10的影響水平為因變量Y，以雷公藤樣品中主要的10個主要成分的質(zhì)譜峰面積為自變量X1～X10，分別采用SPSS軟件單獨進(jìn)行一元線性回歸分析，相關(guān)分析全部采用Spearman簡單相關(guān)進(jìn)行研究。

表3 各雷公藤提取物作用BMDM細(xì)胞的上清液中IL-6、IL-10及iNOS檢測結(jié)果 /pg·mL-1

注：與正常組相比，*P<0.05；與陽性藥組相比，△P<0.05。

3.4.1 雷公藤甲素(X1)與IL-10(Y)的相關(guān)分析 以雷公藤甲素為例，由表4的X1與Y簡單相關(guān)分析結(jié)果可知X1與Y的簡單相關(guān)系數(shù)為0.269(P=0.215>0.05)，自變量X1與回歸標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測值的散點圖見圖3。由圖3可知雷公內(nèi)酯醇相對含量與雷公藤抗炎效應(yīng)沒有明顯的相關(guān)性，雷公藤甲素可能不是影響IL-10水平的成分。

表4 X1與Y的簡單相關(guān)分析結(jié)果

圖3 自變量X1與回歸標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)測值的散點圖

3.4.2 雷公藤主要成分與抗炎效應(yīng)的簡單相關(guān)分析結(jié)果 所示元素均與IL-10做簡單相關(guān)分析，結(jié)果見表5。簡單相關(guān)分析結(jié)果顯示表內(nèi)成分均與雷公藤抗炎效應(yīng)相關(guān)性不大，進(jìn)一步采用多元相關(guān)分析。

表5 雷公藤中10個主要成分與抗炎效應(yīng)簡單相關(guān)分析總結(jié)果

3.5 多元線性統(tǒng)計相關(guān)方法的選擇

由前述研究可知，IL-10可作為評價雷公藤抗炎效應(yīng)的主要指標(biāo)，為了尋找雷公藤主要成分與抗炎效應(yīng)之間的關(guān)系，本研究使用SAS軟件的多元相關(guān)分析探討效應(yīng)與成分之間的相關(guān)性。將雷公藤中10個主要成分定義為X1～X10作為自變量，炎癥因子IL-10定義為Y作為因變量，建立雷公藤主要成分與抗炎效應(yīng)IL-10的回歸模型。

通過SAS軟件進(jìn)一步分析得到回歸矩陣中各主成分特征及貢獻(xiàn)率，10種成分中前4個變量累Z1～Z4計貢獻(xiàn)率大于0.85。由表6可知，以P<0.05 為統(tǒng)計學(xué)差異水平時Z1、Z3兩個主成分變量進(jìn)入回歸模型后，模型較好地擬合數(shù)據(jù)(F=7.01，P=0.015 4<0.05，r=0.460 1)。因此選擇Z1、Z3兩個主成分完成回歸模型的建立。

表6 IL-10水平的主成分回歸分析的參數(shù)檢驗結(jié)果

表7 參數(shù)檢驗結(jié)果

由表6、表7得到因變量Y在主成分上的線性回歸方程，然后將主成分Z1、Z3的表達(dá)式代回到回歸模型中，按照標(biāo)準(zhǔn)化公式將標(biāo)準(zhǔn)化變量轉(zhuǎn)換為原始自變量，得到自變量Y與原始變量X1～X10的線性回歸方程：Y=14.603 8+(18.464 900 77X1+8.622 035X2+2.432 968X3-308.006X4+2.727 914X5+16.242 98X6+6.200 643X7+1.159 044X8-1.345 01X9-93.225 4X10)×10-8。

通過主成分回歸分析結(jié)果表明，擬合的回歸模型中r=0.460 1，P=0.015 4<0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。由回歸模型可知，X1、X6具有較大的參數(shù)值。

4 討論與結(jié)果

陽性藥柳氮磺砒啶可顯著降低BMDM細(xì)胞上清液中IL-6及iNOS的質(zhì)量濃度，且顯著提高IL-10的質(zhì)量濃度，從而表現(xiàn)出良好的抗炎效果。23批提取物中的許多樣品表現(xiàn)出降低IL-6及iNOS的質(zhì)量濃度、升高IL-10質(zhì)量濃度的活性，而其中的安徽毫州藥市的樣品細(xì)胞上清液中的IL-6及iNOS的質(zhì)量濃度顯著低于柳氮磺砒啶的，而IL-10的質(zhì)量濃度顯著高于柳氮磺砒啶的，這表明該樣品可顯著抑制巨噬細(xì)胞分泌致炎因子IL-6，并顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抑炎因子，還能夠通過抑制iNOS的分泌，從而減少NO的合成，其抗炎功效優(yōu)于柳氮磺砒啶，表現(xiàn)出良好應(yīng)用前景，可對其成分組成及作用機制進(jìn)行進(jìn)一步研究，從而為開發(fā)新一代抗炎藥物提供思路。

通過抑炎因子IL-10與10種主要成分的簡單相關(guān)分析，可初步確定10種主要成分與IL-10均無顯著相關(guān)性；通過10種主要成分與抑炎因子IL-10的主成分回歸分析，表明雷公藤甲素、雷公藤晉堿具有較大的參數(shù)值，說明雷公藤甲素、雷公藤晉堿可能對雷公藤抗炎效應(yīng)有較大的貢獻(xiàn)度。

為了增加臨床應(yīng)用的安全性和有效性，明確雷公藤的藥效成分將是選取治療效果更好、減少毒副作用危害的關(guān)鍵。本實驗初步明確了雷公藤抗炎的藥效成分，為臨床用藥提供了更好的選藥依據(jù)。本實驗僅進(jìn)行了體外實驗的研究，如結(jié)果得到進(jìn)一步確認(rèn)，仍需進(jìn)行體內(nèi)實驗驗證。

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StudyonEffectiveComponentsofRootsofTripterygiumwilfordiiBasedonSpectrum-effectRelationshipsAnalysis

DONG Jieming1，XUChang1，GONGMan2，ZHAOQingguo2，WANGJiabo2，XIAOXiaohe2，MAZhijie1*，PUShibiao1，3*

(1.BeijingFriendshipHospital，CapitalMedical，Beijing100050，China；2.IntegrativeMedicine，Center，302MilitaryHospital，Beijing100039，China；3.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica，YunnanUniversityofTCM，Kunming650200，China)

Objective：Based on the spectrum-effect relationships analysis，to study theinvitroanti-inflammatory effect of the roots ofTripterygiumwilfordiiHook.f.Methods：LC-Q/TOF-MS technology was used to characterize the chemical composition of the roots ofT.wilfordiisamples come from different regions.And macrophages(BMDM)as carrier，interleukin 6(IL-6)，IL-10 and nitric oxide synthase(NOS)as indicators，evaluating the anti-inflammatory effect of the roots ofT.wilfordiiinvitro.Results：Ten kinds of main components were identified.Bone marrow-derived macrophage(BMDM)as carrier was able to evaluate the anti-inflammatory effectinvitro.Through the simple and multiple regression analyses，triptolide and wilforgine could be the anti-inflammatory substances of the roots ofT.wilfordii.Conclusion：Wilforgine may be a higher effect component of the roots ofT.wilfordii.

TripterygiumwilfordiiHook.f.；anti-inflammation；spectrum-effect relationships；macrophages；wilforgine

2016-03-04)

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項目(2014FZ072)；北京友誼醫(yī)院院啟動項目(YYDQKT2014-20)；北京中醫(yī)管理局項目(QN2014-18)；首都中醫(yī)藥研究專項(15ZY04)

*

馬致潔，主管中藥師，研究方向：中藥肝毒性研究，Tel：(010)63138562，E-mail：13811647091@163.com；浦仕彪，博士，講師，研究方向：肝病的中醫(yī)診療研究，E-mail：pushi511@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.12.011