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    重組魚類干擾素研究進(jìn)展

    2016-09-24 10:55:07孔德榮王智誠劉海映王秀利
    河北漁業(yè) 2016年7期

    孔德榮 王智誠 劉海映 王秀利

    摘要:干擾素(Interferons,IFNs)是由免疫細(xì)胞分泌的能對幾種病原,例如對病毒、細(xì)菌、寄生蟲和腫瘤細(xì)胞等產(chǎn)生應(yīng)答的一類蛋白質(zhì)。本文綜述了幾種經(jīng)濟(jì)魚類的干擾素基因及重組魚類干擾素的研究進(jìn)展。

    關(guān)鍵詞:經(jīng)濟(jì)魚類;干擾素基因;重組干擾素

    干擾素(Interferon,IFN)是一類能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)的細(xì)胞因子,它不直接參與抗病毒的生物學(xué)過程,而是通過產(chǎn)生靶基因下游的效應(yīng)基因來調(diào)控病毒的感染,具有多效能、低分子量、分泌型等特點(diǎn)。干擾素最初是由Issacs等人在雞胚絨毛尿囊膜細(xì)胞的病毒干擾實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)。不同物種間干擾素的基因結(jié)構(gòu)和亞基組成具有較大的差異,根據(jù)干擾素與受體結(jié)合的方式和其與抗體結(jié)合的抗原性不同可分為三類:工型干擾素主要包括α和β,Ⅱ型干擾素只有一個(gè)成員為γ型干擾素和Ⅲ型干擾素入。干擾素作為機(jī)體最重要的細(xì)胞因子之一,主要生物學(xué)功能體現(xiàn)為廣譜的抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)能力。根據(jù)人和哺乳動物的相關(guān)研究,干擾素對病毒防御的主要方式是通過轉(zhuǎn)導(dǎo)信號和激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致下游基因受干擾素的表達(dá)調(diào)控,生成多種調(diào)控因子直接作用于入侵的病毒,保護(hù)機(jī)體免受感染。

    斑馬魚(Danio rerio)、大西洋鮭魚(Salmosalar)和斑點(diǎn)綠河純(Tetraodon nigroviridis)等魚類的干擾素基因于2003年被克隆到,之后,許多其他的硬骨魚的干擾素基因被克隆和鑒定。魚類的干擾素可以分為兩類:Ⅰ型、Ⅱ型(IFN-γ)。工型是最早被發(fā)現(xiàn)的IFN家族成員,能夠調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的發(fā)育和分化、誘導(dǎo)表達(dá)以及細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤基因誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。與鳥類和哺乳動物的工型干擾素基因結(jié)構(gòu)不同的是,魚類工型基因包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子,而鳥類和哺乳動物的Ⅰ型干擾素基因不含內(nèi)含子。在哺乳動物中,Ⅱ型干擾素也叫做IFN-γ,是由一個(gè)獨(dú)立基因編碼的,該基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。Ⅱ型干擾素是一種典型的Th1細(xì)胞因子,主要由CD4+Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生,能夠激活Th1的反應(yīng)和活化巨噬細(xì)胞。魚類的Ⅱ型干擾素與哺乳動物的Ⅱ型干擾素同源,許多魚類擁有兩種Ⅱ型干擾素(IFN-γ和IFN-γ2)。

    魚類是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的經(jīng)濟(jì)物種,隨著其規(guī)?;?、工廠化的高密度養(yǎng)殖,其病害時(shí)有爆發(fā),這嚴(yán)重制約了魚類養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展,給養(yǎng)殖生產(chǎn)者造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在魚類養(yǎng)殖過程中,除加強(qiáng)綜合管理外,還要針對不同魚的品種的特定疾病采取預(yù)防和治療措施,但效果甚微。為達(dá)到預(yù)防病原菌和病毒的目的,提高魚類自身免疫能力對于增強(qiáng)其抗病力至關(guān)重要。因干擾素的生物學(xué)作用,科研工作者已將部分魚類的干擾素基因通過基因工程技術(shù)制備重組魚類干擾素,為今后取代抗生素或化學(xué)藥物在魚類病害防治上的應(yīng)用提供了參考。下面,簡要介紹幾種經(jīng)濟(jì)魚類的干擾素及其干擾素基因的重組表達(dá)情況。

    1 草魚的干擾素及其基因的重組表達(dá)與應(yīng)用

    草魚是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類,主要以混養(yǎng)為主,但養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的“四病”及病原微生物對草魚產(chǎn)量及質(zhì)量造成一定的損失。很多學(xué)者致力于提高草魚免疫力的研究。起初,研究者將人α-干擾素(hu-IFN-α)基因序列轉(zhuǎn)入到草魚基因組內(nèi),成功獲得表達(dá)人α-干擾素蛋白的轉(zhuǎn)基因草魚,通過一段時(shí)間的養(yǎng)殖發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因草魚的抗病能力較普通草魚的抗病能力高;后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)植基因能夠遺傳給后代,且雌核發(fā)育陽性率高,但在遺傳過程中受外界或者遺傳因素的影響會有部分丟失。

    草魚的干擾素及相關(guān)基因研究較為廣泛,主要分為以下幾類:

    Ⅰ型干擾素:MTT法(MTT assay)測定原核表達(dá)并經(jīng)純化后的重組草魚Ⅰ型干擾素(rCi-IFN)對草魚腎細(xì)胞系CIK細(xì)胞的抗草魚出血病毒(Gras Carp Hemorrhage Virus,GCHV),結(jié)果顯示rCiIFN的生物活性與其濃度呈正相關(guān)關(guān)系。后續(xù)通過注射實(shí)驗(yàn)檢測到重組rCiIFN蛋白能夠上調(diào)干擾素相關(guān)基因IFN、IRF-1、IRF-7、STAT-3、MX、PKR的表達(dá),且效果較聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,polyI:C)的誘導(dǎo)效果好。目前,草魚rCiIFN已被大量發(fā)酵,并找到最佳給藥方式,且將草魚rCiIFN蛋白摻入飼料中可有效提高草魚幼魚成活率。工型干擾素是多基因家族,主要包括IFNa、β等10余種亞型,最主要且研究最多的應(yīng)屬IFNa、β兩種基因。草魚IFNa已被成功擴(kuò)增出目的序列并獲得高純度rCiIFNa蛋白,抗病毒實(shí)驗(yàn)證明其具有生物學(xué)活性,且對于魚類細(xì)胞系抗病毒效果良好。

    干擾素γ:草魚干擾素γ也稱為干擾素-rel(IFN-rel),利用同源克隆并結(jié)合RACE的方法成功獲得草魚IFN72的cDNA全長序列。已構(gòu)建pET30a(+)-IFN-rel重組表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌胞內(nèi)成功獲得高純度的重組草魚IFNγ2蛋白。以重組IFN-rel蛋白刺激草魚頭腎細(xì)胞,能有效促進(jìn)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)IL-1β mRNA表達(dá)水平。同時(shí),將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-myc-his轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞內(nèi),會使草魚頭腎細(xì)胞中IL8的基因表達(dá)上調(diào)。

    2 鯉魚的干擾素基因

    鯉魚的干擾素基因的研究與草魚相比較為緩慢,陳義龍等通過PCR獲得了鯉魚干擾素γ-2β的全長序列。序列分析表明,鯉魚干擾素基因具有較高的保守性,剪接點(diǎn)之間嚴(yán)格遵守GT-AG規(guī)則,對于其表達(dá)與應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究。鯉魚干擾素調(diào)節(jié)因子的研究相對較成熟,通過RACE技術(shù)克隆得到IRF1、IRF5基因的cDNA序列,實(shí)驗(yàn)證明,鯉魚的IRF1、IRF5雖具有不同的表達(dá)模式,但都可能在抗病毒過程中發(fā)揮作用。韋信賢等人,構(gòu)建過表達(dá)載體鯉魚Toll樣受體2(CcTLR2),同時(shí)轉(zhuǎn)染到鯉魚上皮瘤,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR2可以使干擾素調(diào)節(jié)因子上調(diào)并抑制病毒的增殖。

    3 黑青斑河純和紅鰭東方純的重組干擾素

    黑青斑河純干擾素IFNγ1、IFNγ2兩種基因均得到了克隆,現(xiàn)已證明黑青斑河純IFNγ1與IFNγ2表達(dá)模式存在較大差異。構(gòu)建高效表達(dá)載體,原核表達(dá)黑青斑河純重組IFNγ1蛋白,并以不同濃度重組蛋白刺激頭腎細(xì)胞,結(jié)果表明純化得到的重組蛋白具有生物學(xué)活性,且能夠刺激細(xì)胞增殖。

    馬普等(2015)提取紅鰭東方純腎臟組織的總RNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到干擾素γ(IFNγ)基因序列。將紅鰭東方純IFN7成熟肽序列與表達(dá)載體PET-32a(+)相連,構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-32a-IFN7。將其成功轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),pET-32a-IFN7在BL21中得到了融合表達(dá)。進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的純化和Western Blotting檢測,結(jié)果顯示紅鰭東方純IFNγ基因在大腸桿菌中的表達(dá)量較高,獲得目的蛋白準(zhǔn)確。該研究為后續(xù)紅鰭東方純重組干擾素γ活性驗(yàn)證及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    4 半滑舌鰨和大菱鲆的干擾素

    半滑舌鰨干擾素的研究主要體現(xiàn)在其相關(guān)基因功能的研究與應(yīng)用上。龍昊從半滑舌鰨cD-NA文庫中克隆得到IFIT家族中的一個(gè)基因CsIFIT1,生物學(xué)軟件分析其結(jié)構(gòu),qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析CsIFIT1在免疫相關(guān)的器官組織中的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)在半滑舌鰨中通過過量表達(dá)CsIFIT1可顯著抑制腫大細(xì)胞病毒在魚體中的復(fù)制,當(dāng)降低CsIFIT1表達(dá)后,病毒在組織中的復(fù)制量明顯增高。也有研究表明半滑舌鰨ISG15在病毒感染實(shí)驗(yàn)中也發(fā)揮著類似的抗病毒作用,猜測其可能通過調(diào)節(jié)干擾素相關(guān)免疫因子間接發(fā)揮抗病毒作用。

    林婧赟采用同源克隆及RACE技術(shù)克隆得到大菱鲆干擾素刺激基因15(ISG15)。結(jié)構(gòu)分析表明其包含兩個(gè)類泛素結(jié)構(gòu)域,C末端含有一個(gè)保守的RLRGG基序。表達(dá)分析ISG15在大菱鲆12個(gè)組織(包括腦、鰓、胃、腸等)呈組成型表達(dá),且在頭腎、體腎、脾等免疫相關(guān)組織中的表達(dá)量較高。大菱鲆受到poly I:C和TRBIV刺激后,ISG15基因在鰓、脾、頭腎和肌肉中表達(dá)上調(diào),這為ISG15在抗病毒免疫中發(fā)揮作用的途徑提供了證據(jù)。

    5 牙鲆的重組干擾素

    牙鲆(Paralichthys olivaceus)同樣有以上兩種Ⅱ型干擾素的轉(zhuǎn)錄本,但這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本極為相似,僅有三個(gè)核苷酸不同。目前,采用同源PCR和cDNA末端技術(shù)快速擴(kuò)增褐牙鲆脾組織IRF5基因全長的cDNA(1869 bp)和DNA(3655bp,含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子),其mRNA在鰓和頭腎組織中表達(dá)水平較高,在腦、肝和皮膚中表達(dá)水平較低,揭示了該基因?qū)儆谟补囚~IRF5亞群。同時(shí)利用干擾素誘導(dǎo)劑(Poly I:C)刺激IRF5基因?qū)е铝似渫矶志玫纳险{(diào),表明了該基因很有可能是一種干擾素刺激基因(ISG)。在牙鲆養(yǎng)殖中,愛德華氏病是一種常見的細(xì)菌性疾病,注射重組的Ⅱ型干擾素可以很大地提高其生存率。這表明重組的牙鲆Ⅱ型干擾素能夠增強(qiáng)牙鲆免疫應(yīng)答和抵抗愛德華氏菌的感染。

    6 虹鱒和大西洋鮭的干擾素

    Robertsen等確定并克隆大西洋鮭體內(nèi)兩種Ⅰ型IFN(SasaIFN-a1、SasaIFN-a2),SasaIFN-a1基因cDNA序列感染人胚腎293細(xì)胞系產(chǎn)生了高生物學(xué)活性,使大西洋鮭細(xì)胞系免受IPNV病毒感染,同時(shí)誘導(dǎo)了Mx基因的表達(dá)。

    Jun Zou等根據(jù)虹鱒與大西洋鮭基因組的高等同源性,從虹鱒頭腎細(xì)胞的cDNA文庫中篩選出虹鱒的IFN-γ基因,并對其生物活性進(jìn)行試驗(yàn)分析:兩種基因混合免疫可增強(qiáng)虹鱒機(jī)體免疫力。閆春梅等將構(gòu)建有熒光標(biāo)記的兩種重組真核表達(dá)質(zhì)粒(鯉魚IL-1β及IFN基因序列)混合免疫待產(chǎn)虹鱒親本并在受精過程中進(jìn)行二次免疫,免疫熒光檢測證明兩種重組質(zhì)粒表達(dá)良好,虹鱒幼魚成活率較對照組高。劉敏對赤眼鱒Mx基因全長進(jìn)行克隆、表達(dá)及重組載體構(gòu)建,得到其在各組織的表達(dá)情況。含有IFN基因序列的真核載體pCR3.1轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞內(nèi),經(jīng)培養(yǎng)后細(xì)胞表達(dá)重組大西洋鮭干擾素能夠抵抗傳染性胰壞死病毒(IPNV)以保護(hù)大西洋鮭頭腎TO細(xì)胞。

    7 尼羅羅非魚、斑點(diǎn)叉尾鮰和斜帶石斑魚的干擾素基因

    吳芳等人克隆了尼羅羅非魚γ-干擾素基因,發(fā)現(xiàn)該基因的cDNA大小為690 bp,生物信息學(xué)分析推測編碼206個(gè)氨基酸。qPCR檢測發(fā)現(xiàn)正常尼羅羅非魚個(gè)體γ-干擾素基因在不同組織中均有表達(dá),且在脾臟中表達(dá)量最高,其次是腸、鰓和腎臟,在皮膚、心臟和肌肉組織中的表達(dá)量則較低,推測尼羅羅非魚γ-干擾素參與魚體對病原菌的防御過程,在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

    斑點(diǎn)叉尾鮰(channel catfish)能夠產(chǎn)生兩種Ⅱ型干擾素的mRNAs(IFN-γ1和IFN-γ2),這兩個(gè)mRNA在不同的組織和細(xì)胞類型中表達(dá)形式不同。研究表明,克隆出斑點(diǎn)叉尾鮰的IFN-α基因,其開放閱讀框由492個(gè)核苷酸組成,推測其編碼產(chǎn)物由164個(gè)氨基酸組成。經(jīng)核酸序列分析比對后發(fā)現(xiàn),就干擾素γ而言,斑點(diǎn)叉尾鮰與鯰魚的親緣關(guān)系較近。此外,還有研究發(fā)現(xiàn)與其他魚類重組克隆不同的是斑點(diǎn)叉尾鮰的IFN似乎缺少第一個(gè)成熟的氨基酸和信號序列。

    黃貝等人已克隆出斜帶石斑魚的IFNγcDNA序列,并通過感染polyI:C分析其IFNγ組織表達(dá)情況,進(jìn)而推測IFNγ機(jī)體在抗病毒感染過程中發(fā)揮作用。對于干擾素的作用機(jī)理研究較少,但有人發(fā)現(xiàn)干擾素下游基因Toll樣受體通過依賴MyD88,或TRIF通路傳導(dǎo)信號,從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和IRF的表達(dá),啟動機(jī)體非特異性免疫和獲得性免疫而抵御病原入侵。

    8 結(jié)語

    隨著魚類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大、品種的不斷增加,養(yǎng)殖過程中病害問題也日益嚴(yán)重。因此,養(yǎng)殖過程中開始出現(xiàn)抗生素濫用的情況,不僅會造成魚類產(chǎn)生抗藥性,還會使魚類自身免疫系統(tǒng)受到損害,同時(shí)也會引起環(huán)境的二次污染。目前,在魚類干擾素相關(guān)基因的克隆和調(diào)控等方面的研究已取得了重要的進(jìn)展,為重組魚類干擾素在魚類病害防治上的開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

    (收稿日期:2016-06-15)

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