超高效液相色譜串聯質譜法對水產品中硝基呋喃代謝物的測定

王狄　張嘉楠

摘要：建立了使用Waters UPLC Xevo TQ超高效液相色譜串聯質譜儀檢測水產品中4種硝基呋喃代謝物的分析方法。勻漿后的樣品在酸性環(huán)境下水解，并用2一硝基苯甲醛衍生16h，經磷酸氫二鉀提取，LMS固相萃取小柱凈化后，在三重四極桿多反應監(jiān)測模式下進行測定。方法采用同位素內標法定量，四種代謝物的檢出限（LOD）均低于0.25μg·kg^-1，線性范圍在0.5μg·L^-1到10μg·L^-1間，相關系數大干0.99。在0.5、1.0和5μg·kg^-1濃度下分別進行添加回收試驗（n=5），回收率在75.2%～123.3%之間，相對標準偏差（RSD）小于9.4%。

關鍵詞：硝基呋喃代謝物；固相萃取；超高效液相色譜串聯質譜法；水產品

硝基呋喃類藥物（nitrofurans）主要是指呋喃唑酮（furazolidone，AOZ）、呋喃它酮（furMta-done，AMOZ）、呋喃西林（nitrofurazone，SEM）、呋喃妥因（nitrofurantoin，AHD）等引入硝基的人工合成抗菌藥，近年來發(fā)現其具有慢性毒性，可引起消化道反應，美國、歐盟等工業(yè)發(fā)達國家和地區(qū)已禁止使用。硝基呋喃類藥物在動物體內數小時內可降解，但其代謝產物能與蛋白質緊密結合，形成穩(wěn)定的殘留物，殘留時間達數周之久，甚至在蒸煮、烘烤、磨碎和微波加熱過程中也無法有效降解，因此檢測硝基呋喃類藥物的代謝產物，更能起到監(jiān)控作用。目前歐盟對硝基呋喃類代謝物的檢測方法靈敏度規(guī)定為1μg/kg。

試驗采用了超高效液相色譜一串聯質譜法檢測硝基呋喃類藥物代謝物。在農業(yè)部781號公告-4-2006的基礎上對樣品前處理過程進行了簡化，并且采用固相萃取法對樣品進行凈化，提高了工作效率和實驗結果的穩(wěn)定性。經過多次試驗證明方法的結果及穩(wěn)定性可靠，適用于日常水產品中硝基呋喃代謝物的痕量檢測工作。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC Xevo TQ液相色譜串聯質譜儀（美國沃特世）；雙功能氣浴恒溫振蕩器（江蘇天由有限公司）；臺式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；氮空氣吹掃濃縮儀（北京斯珀特科技有限公司）；CGX一274ASPEC四通道自動固相萃取儀（法國吉爾森）。

甲醇、乙腈、甲酸和正己烷均為色譜純；鹽酸為優(yōu)級純；磷酸氫二鉀為分析純；2-硝基苯甲醛（購自德國CNW公司）；所有標準品及同位素內標均購自德國Dr.Ehrenstorfer；Bond Elut LMS固相萃取小柱（200mg，3mL）。

1.2 樣品前處理

衍生化：稱?。?±0.05）g樣品于離心管中，加入100μg·L^-1的混合內標標準溶液100μL，再加入0.1mol·L^-1鄰硝基苯甲醛100μL、0.2mol·L^-1的鹽酸5mL，漩渦混合30s后，于37℃恒溫箱中避光衍生16h。

提取：待樣品冷卻至室溫后，加入1mol·L^-1磷酸氫二鉀5mL，漩渦混勻，用1mol·L^-1氫氧化鈉調pH值至7.2～7.4后，8000r/min離心10min。

凈化：將5mL樣品上清液加入到BondElutLMS固相萃取小柱中（使用前依次用3mL乙酸乙酯、甲醇和水活化），然后用3mL水淋洗、吹干，最后用3mL乙酸乙酯洗脫。洗脫液于40℃氮氣流下吹干，殘渣用1mL0.1%甲酸水溶解，過0.22μm微孔濾膜后上機測定。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm 2.1×100 mm；進樣量：5μL；流動相：A：0.1%甲酸水B：乙腈；流速：0.3mL/min；柱溫：30℃

質譜條件：

離子源：ESI；檢測方式：多反應監(jiān)測；脫溶劑氣流量：650L/h；錐孔氣流量：50L/h；脫溶劑氣溫度：350℃；毛細管電壓：3kV；離子源：150℃；碰撞氣流量：0.18mL/min；正離子模式；其它參數見表2。

2 結果與討論

2.1 提取方法的選擇

試驗在農業(yè)部781號公告-4-2006前處理方法的基礎上加入了固相萃取凈化過程。由于乙酸乙酯較水極性小，所以在固相萃取過程中，極性較小的乙酸乙酯作為溶劑會一定程度上破壞非極性藥物和非極性吸附劑之間的非極性作用力。因此，在提取過程中簡化掉了藥物從水溶液到乙酸乙酯的轉移過程，同時降低了藥物在轉移過程中的損失，提高了回收率。

2.2 固相萃取小柱的選擇

BondElut LMS：是聚合物吸附劑，萃取機制為非極性，萃取化合物為非極性化合物，在洗脫樣品時無須再添加有機胺類改性劑、緩沖液或者酸等。次級相互作用的消除意味著使用純的有機溶劑或與HPLC流動相兼容的低離子強度的洗脫液即可洗脫目標分析物。這種特性可以很好地保證萃取技術與LC/MS和其它高靈敏度的檢測技術的兼容性。優(yōu)選的吸附劑顆粒大小和大的比表面積保證了萃取效率，可以實現無干擾萃取。實驗參考了Alexander Leitner，Peter Zollner，Wolfgang LindnerE<對樣品的固相萃取凈化方法，并選擇了與其方法所用的固相萃取小柱填料相同的安捷倫Bond Elut LMS固相萃取小柱（200mg，3mL）。通過吉爾森四通道自動固相萃取儀對不同添加水平的樣品進行固相萃取測定試驗，以及相同添加濃度的樣品分別進行固相萃取和無固相萃取過程的對比試驗，結果表明，BondElutLMS固相萃取小柱能夠有效地去除樣品基質中蛋白類基質的干擾，并且能夠保證高的回收率和結果重現性。

2.3 方法的線性關系、精密度及準確度

按照實驗的條件和方法，配置濃度分別為0.5、1、2、5、10μg·L^-1一系列標準溶液進行測定，用定量離子峰面積與內標峰面積比和標準溶液濃度和內標濃度比做校正曲線，線性回歸方程、相關系數及最低檢出限見表3。通過空白基質加標，并按照S/N=3計算方法檢出限。結果表明，4種硝基呋喃代謝物的檢出限為0.05-0.2μg·kg^-1。

2.4 加標回收及精密度實驗

實驗選用大菱鲆、草魚、對蝦為基質，分別采用0.5、1.0和5μg·kg^-1三個加標水平，計算平均回收率和精密度（n=5），結果見表4?；Ч茫軌驅λa品中的硝基呋喃代謝物進行準確的定性和定量分析。

（收稿日期：2016-05-16；～回日期：2016-05-23）