赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的研究

楊 壯，張明星，楊模華，楊石浪，李志輝

（中南林業(yè)科技大學林學院，湖南 長沙 410004）

赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的研究

楊 壯，張明星，楊模華，楊石浪，李志輝

（中南林業(yè)科技大學林學院，湖南 長沙 410004）

以赤皮青岡幼胚為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，探討了2，4-D和6-BA兩種激素共同作用下對赤皮青岡幼胚誘導的影響，以及在4℃條件下不同冷藏天數（5、15、30 d）和不同激素（6-BA和2，4-D）濃度組合對赤皮青岡幼胚誘導的影響。結果表明：6-BA對愈傷組織誘導的影響較大；接種在“MS+1.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+0.1g/L肌醇+1.0g/L水解酪蛋白”培養(yǎng)基上的幼胚，以4℃冰箱中冷藏15 d的幼胚愈傷組織誘導率最高（41.1%）。在此基礎上，選取冷藏15 d的赤皮青岡幼胚，探究了不同基本培養(yǎng)基種類（MS、1/2MS和WPM）和不同激素（6-BA和2，4-D）濃度組合對赤皮青岡幼胚誘導的影響。結果表明：3種培養(yǎng)基對愈傷組織誘導的影響沒有顯著差異，但是每一種培養(yǎng)基中誘導率最高的激素組合各不相同。

赤皮青岡；幼胚 ；激素；冷藏；愈傷組織

赤皮青岡［Cyclobalanopsis gilva （Bl.） Oerst.］為殼斗科青岡屬植物，產于臺灣、廣東、湖南、貴州及華東等地區(qū)，生于海拔200～1 500 m范圍內，生態(tài)適應性較強、較耐干旱瘠薄［1］。赤皮青岡的心材呈深紅褐色，邊材呈黃褐色，紋理直，是我國林業(yè)生產中重要的用材。一方面，赤皮青岡樹大、干直、樹齡長、長速快，是較好的園林綠化樹種，有觀賞、防風等價值，可在東南丘陵山地推廣種植；另一方面，赤皮青岡屬于中上等用材（商品材稱作紅椆），可用于家具、工藝品制作等；此外，赤皮青岡的樹皮和殼斗含有單寧，果實淀粉含量可觀，可用于栲膠、食物制作等領域［2-3］。

目前，我國城鎮(zhèn)化速度不斷加快，人們對紅椆這種優(yōu)良木材的需求大大增加［4］，但是赤皮青岡種子屬于頑拗性種子，其萌發(fā)時間很長，發(fā)芽率較低，且難以保存母本的優(yōu)良性狀，高品質紅椆用材供不應求，因此赤皮青岡快繁技術的研究具有重要意義。運用幼胚誘導愈傷組織進而大量誘導胚狀體的過程能為該樹種建立了一條有效的快繁途徑，還可以結合分子生物學技術進行新品種的培育，大大縮短了育種育苗的周期。研究采用雙因子試驗設計，探索了不同冷藏天數、不同激素組合以及不同基本培養(yǎng)基對誘導赤皮青岡幼胚愈傷組織的影響，以期為赤皮青岡快繁體系建立、分子誘變育種和工廠化組織培養(yǎng)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料來源與處理

以2015年7月10日采自湖南省張家界市一株300 a樹齡赤皮青岡母樹的未成熟種子為試驗材料，種子采下后立即放入冰盒保存，返回試驗室后將未成熟種子放置在4℃的冰箱中冷藏備用。

1.2外植體的處理

從冰箱中取出赤皮青岡未成熟種子，先用少量洗衣粉洗去其表面的粉塵，然后置于流水下沖洗4 h。在超凈工作臺進行消毒滅菌處理：75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～4次，0.1% HgCl2滅菌10 min，無菌水沖洗4～6次。在超凈無菌工作臺上用滅菌的枝剪剪開外面的殼斗和堅硬的外種皮，按試驗方案將帶胚乳的幼胚接種在誘導培養(yǎng)基上，最后將接種的培養(yǎng)基存放在23℃經過消毒的培養(yǎng)溫室里進行暗培養(yǎng)。

1.3 不同激素組合試驗

為篩選出赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導最佳激素組合，采用在4℃冷藏15 d的赤皮青岡未成熟種子為外植體（圖1A），以MS+30 g/L蔗糖+0.1 g/L肌醇+1.0 g/L水解酪蛋白（pH值5.6）為基本培養(yǎng)基，選擇2，4-D和6-BA各4種濃度梯度，按雙因子試驗設計共16個處理（表1），每個處理接種90個外植體，共需接種1 440個外植體，定期觀察，接種40 d后統(tǒng)計出誘導率和褐化率。誘導率=（誘導出愈傷組織的外植體數/接種外植體數）×100%，褐化率=（褐化的外植體數/接種外植體數）×100%。

表1　不同激素組合試驗設計　?。╩g/L）

1.4不同冷藏天數試驗

為篩選出赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的最佳冷藏天數，以MS+30 g/L蔗糖+0.1 g/L肌醇+1.0 g/L水解酪蛋白（pH值5.6）為基本培養(yǎng)基，采用3種激素組合，分別冷藏5、15和30 d后接種。按雙因子試驗設計，共9個處理（表2），每個處理接種90個外植體，共接種810個外植體，定期觀察，接種40 d后統(tǒng)計誘導率，并采用SPSS軟件進行方差分析。

1.5不同基本培養(yǎng)基試驗

表2　不同冷藏天數試驗設計

為篩選出赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導最佳基本培養(yǎng)基種類，以4℃冷藏15 d的赤皮青岡幼胚為外植體，采用上述3種激素組合，選用MS，1/2MS和WPM 3種基本培養(yǎng)基，添加30 g/L蔗糖、0.1 g/L肌醇和1.0 g/L水解酪蛋白，pH值5.6。按照雙因子試驗設計，共9個處理（表3），每個處理接種90個外植體，共需接種外植體810個，定期觀察，接種40 d后統(tǒng)計誘導率，并采用SPSS軟件進行方差分析。

表3　不同基本培養(yǎng)基試驗設計

2 結果與分析

2.1激素種類及濃度對赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的影響

采用雙因子設計的16個處理中，在接種10 d后，處理11的幼胚開始膨脹，出現少量白色愈傷組織（圖1A）；接種15～20 d后，愈傷組織逐漸增多，同時部分種子褐化，培養(yǎng)基并開始變色，該現象以處理2、3和14最為嚴重。接種25 d后，各處理幼胚愈傷組織均明顯增多（圖1B），微距觀察到愈傷組織生長良好（圖1C）。

從表4中可以看出，2，4-D和6-BA兩種激素對于赤皮青岡胚性愈傷組織的誘導有一定的影響。在6-BA激素濃度為0.5和1.0 mg/L的8個處理中，幼胚能誘導產生愈傷組織，其中處理6、11和12的誘導率分別達到了40.0%、44.4%和50.0%，這表明在赤皮青岡胚性愈傷組織的誘導中起主導作用的激素是6-BA。試驗獲得的最佳培養(yǎng)基組合是MS+2.0 mg/L 2，4-D +1 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+0.1 g/L肌醇+1.0 g/L水解酪蛋白，pH值5.6。

圖1　不同激素組合組織培養(yǎng)及微距觀察（A.組織培養(yǎng)外植體-幼胚；B.接種25 d；C.接種25 d 10倍鏡下觀察）

表4　不同激素組合對赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的影響

2.2激素種類及濃度對外植體褐化的影響

在不同激素組合愈傷組織誘導中，記錄了外植體接種40 d后的褐化狀況（圖2A，表4），而且還對褐化外植體進行了顯微結構觀察（圖2B），發(fā)現雖然外植體褐化，但是愈傷組織生長良好。

圖2　幼胚褐化狀況觀察及顯微結構觀察（A.接種40 d后外植體褐化狀況；B.褐化外植體10倍鏡下觀察）

由表4可知，處理13的褐化率（5.6%）最低，處理9的褐化率最高，達83.3%。結合誘導率分析，處理11的褐化率僅為10.0%，而誘導率高達44.4%，因此認為該處理（MS+1.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+0.1g/L肌醇+1.0g/L水解酪蛋白）較適用于赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導。

2.3冷藏天數對赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的影響

雙因子設計的9個處理在接種后，分別進行定期觀察記錄，發(fā)現處理e接種第15 d后幼胚開始膨大，中部出現少量乳白色愈傷組織，同時部分處理的幼胚出現褐化現象，以處理f褐化最為嚴重。接種20 d后，各處理幼胚不再膨脹，愈傷組織持續(xù)增多（圖3A）。接種33 d后，各處理出現較多愈傷組織，且褐化率也增高了，微距觀察誘導出的愈傷組織，生長狀況良好（圖3B）。

圖3　不同冷藏天數組織培養(yǎng)及微距觀察（A.接種20 d；B.接種20 d的愈傷組織10倍鏡下觀察）

從表5中可以看出，除了冷藏天數為30 d的處理i沒有誘導出愈傷組織外，其他處理均誘導出了愈傷組織，而且冷藏15 d的幼胚愈傷組織誘導率最高，與其他兩個處理（冷藏5 d和30 d）有一定差異；但經單因素方差分析，Sig值為0.295，說明冷藏5、15、30 d對愈傷組織的誘導率差異不顯著。冷藏15 d中以B組合（1.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA）的誘導效果最好（即處理e），達到了41.1%，因此認為冷藏15d對幼胚愈傷組織的誘導效果最好，且最佳培養(yǎng)基組合為MS+1.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+0.1 g/L肌醇+1.0 g/L水解酪蛋白，pH值5.6。

表5　不同冷藏天數對赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的影響

2.4基本培養(yǎng)基對赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的影響

雙因子設計的9個處理中，在接種后15 d處理B的幼胚膨大，幼胚中部裂開，出現極少量白色愈傷組織。接種24 d后部分幼胚出現褐化，各處理均有反應，出現乳白的愈傷組織（圖4A）；按雙因子設計配方繼代培養(yǎng)一次，愈傷組織生長擴大，如圖4B所示。

圖4　不同基本培養(yǎng)基組織培養(yǎng)及繼代培養(yǎng)觀察（A.接種24 d；B.繼代培養(yǎng)一次）

單因素方差分析顯示，組間Sig值為0.999，說明3種基本培養(yǎng)基之間的誘導效果并不存在顯著性差異；但是組內差異較大，說明在愈傷組織誘導的過程中植物激素的作用大于基本培養(yǎng)基的作用。從表6中可以看出，每組基本培養(yǎng)基組合中各有1個誘導率較高的組合，分別為處理B（MS+1.0 mg/L 2，4-D +0.5mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+0.1g/L肌醇+1.0g/L水解酪蛋白）、處理D（1/2 MS +0.5 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+0.1 g/L肌醇+1.0 g/L水解酪蛋白）和處理I（WPM+1.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+0.1 g/L肌醇+1.0 g/L水解酪蛋白），誘導率分別達到了40.0%、32.2%和33.3%。雖然這3個組合誘導率差異不大，但是所采用的激素濃度卻不相同，說明基本培養(yǎng)基和植物激素之間存在協(xié)同作用。

表6　不同基本培養(yǎng)基對赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的影響

3 結論與討論

體細胞胚胎發(fā)生是細胞工程中植株再生的重要途徑之一，可作為基因工程的受體系統(tǒng)，同時也是研究細胞全能性、細胞分化及其形態(tài)建成的理想試驗體系［5］。而愈傷組織的誘導是重中之重，只有誘導出良好的愈傷組織才能為體細胞胚胎發(fā)生奠定好基礎。在赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導過程中，2，4-D和6-BA兩種激素發(fā)揮了極其關鍵的作用，2，4-D屬于生長素類似物，在愈傷組織誘導和生根方面有著重要作用，在某些植物的組織培養(yǎng)中還會誘導不定胚的形成；6-BA屬于細胞分裂素，在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素，其目的在于促進細胞分裂，誘導愈傷組織、不定芽和不定胚的產生；生長素與細胞分裂素配合使用，對于器官形成和植株再生有著重要的調控作用［6］，該試驗結果也進一步說明了這兩種激素的關鍵作用，其中6-BA占主導地位。

試驗中采種時間對愈傷組織的誘導很重要，過早和過晚都不能得到良好的愈傷組織，而且不同發(fā)育時期的未成熟合子胚對激素配比要求也有一定差異［7］。由于赤皮青岡采種的難度較大（樹比較高），大小年現象嚴重，采種距離較遠，試驗中未探究赤皮青岡未成熟種子的最佳采種時間，需進行后續(xù)研究。據相關報道［6-10］，適度冷藏對可溶性蛋白、淀粉酶和可溶性糖分有一定的影響，從而對愈傷組織的誘導起到一定作用，但是冷藏時間過短或者過長也會對愈傷組織誘導產生不利影響，所以適量冷藏天數對愈傷組織的誘導很關鍵［11］。研究分析了不同冷藏天數對赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的影響，結果表明不同冷藏時間對赤皮青岡胚性愈傷組織誘導有顯著性差異。其中，4 ℃冷藏15 d的幼胚接種在“MS+1.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/ L 6-BA +30 g/L蔗糖+0.1 g/L肌醇+1.0 g/L水解酪蛋白”培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導率最高，為41.1%。

植物組織培養(yǎng)中，不同植物的生物學特性不同，同一種植物不同部位的組織、同一部位組織的不同生長階段均對營養(yǎng)的要求也不同，只有滿足它們各自的要求才能使其正常生長。因此，選擇合適的培養(yǎng)基對植物組織培養(yǎng)十分重要［12］。MS培養(yǎng)基是一種應用十分廣泛的培養(yǎng)基，其無機鹽類濃度較高，尤其是銨鹽和硝酸鹽，元素平衡較好，緩沖性能好，微量元素和有機成分含量較齊全且較豐富，能夠滿足快速增長的組織對營養(yǎng)元素的要求，但是它不適合生長緩慢、對無機鹽類要求比較低的植物（尤其是不適合銨鹽過高易導致毒害的植物）；1/2MS培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基的大量元素減半，適合無機鹽需求濃度低的植物；WPM培養(yǎng)基主要用于木本植物的組織培養(yǎng)［6］。通過試驗研究，發(fā)現MS、1/2MS和WPM 3種基本培養(yǎng)基對赤皮青岡幼胚愈傷組織的誘導沒有特別顯著的區(qū)別，與不同激素組合獲得不同誘導率，說明不同基本培養(yǎng)基最佳協(xié)同激素種類及濃度各不相同。

褐化現象，又被稱為酚污染，當外植體組織被切割和接種時，損傷切面細胞中酚類物質被氧化成醌，切面迅速變成棕褐色或暗褐色，這些褐色物會逐漸擴散到培養(yǎng)基中，抑制其他酶的活性，毒害整個外植體組織［13-16］。赤皮青岡幼胚里含有單寧物質［2，17］，接種時切面很快就會有褐化現象產生，影響外植體的生長，采用連續(xù)移植外植體的方法可以緩解褐化［18］。在赤皮青岡幼胚愈傷組織誘導的試驗過程中，由于赤皮青岡幼胚殼斗上絨毛較多且存在許多隱蔽難以完全滅菌的地方，因此試驗中往往容易出現的問題就是污染和褐化，然而污染可以盡量避免，但是幼胚褐化問題無法規(guī)避。通過上面的試驗以及有關研究表明外植體雖然出現了褐化現象，但是只要有細胞存活就能產生愈傷組織，這與前人研究結果一致［12-13］。

愈傷組織的保持與增殖是一個關鍵難題［19］，只有解決了這個難題，才能得到更多的胚狀體，達到赤皮青岡高效快速擴繁的目的，為赤皮青岡基因工程和分子水平的研究奠定基礎。

赤皮青岡作為珍貴樹種，又是優(yōu)良的用材樹種，迫切需要建立一個高效快速穩(wěn)定的擴繁體系，其幼胚體細胞胚胎發(fā)生體系是解決這個問題的有效途徑，研究初步建立了赤皮青岡幼胚愈傷組織的誘導體系，但成功獲得體細胞胚并培育成無菌苗還需要進一步深入研究。

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（責任編輯：成 平）

Study on Immature Embryo Callus Induction of Cyclobalanopsis gilva

YANG Zhuang，ZHANG Ming-xing，YANG Mo-hua，YANG Shi-lang，LI Zhi-hui
（Forestry College， Central South University of Forestry and Technology， Changsha 410004， PRC）

Took Cyclobalanopsis gilva immature embryos as explants and MS as basic medium， discussed the induced effect of Cyclobalanopsis gilva immature embryos under combined action of hormones 2， 4-D and 6-BA， and the induced effect of Cyclobalanopsis gilva immature embryos under the condition of 4℃ refrigeration in different days （5 days， 15 days， 30 days） and different hormone （6-BA and 2，4-D） concentrations and combinations. The result showed that 6-BA had greater induced effect on callus； the immature embryos on the medium of “MS+1.0 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA +30 g/L sucrose+0.1g/L inositol+1.0g/L hydrolyzed casein”， the induction rate of immature embryos callus in refrigerator at 4℃ for 15 days was highest （41.1%）. On this basis， selected the refrigerated 15 days of Cyclobalanopsis gilva immature embryo， explored the induced effects of different basic culture medium （MS， 1 / 2 ms and WPM） and different hormone （6-BA and 2，4-D） concentrations and combinations on Cyclobalanopsis gilva immature embryos. The results showed that there was no significant difference in the effect of 3 kinds of medium on the callus induction， but the highest induction rate hormone combination in each medium was different.

Cyclobalanopsis gilva； immature embryo； hormone； cold storage； callus

Q813.1+2

A

1006-060X（2016）08-0001-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.08.001

2016-05-20

國家“十二五”科技支撐計劃資助項目（2012BAD21B03）；中南林業(yè)科技大學大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目（2015）

楊 壯（1994-），男，湖北鄂州市人，本科生，專業(yè)為林學。

李志輝