蓖麻矮化相關(guān)基因RcDof的克隆及分析

孫華軍,李國瑞,2,3,4,黃鳳蘭,2,3,4,李　躍,叢安琪,李　威,齊　蒙,陳永勝,2,3,4

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼　028000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 通遼　028000;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點實驗室,內(nèi)蒙古 通遼　028000;4.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新培育中心，內(nèi)蒙古 通遼　028000;5.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼　028000)

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蓖麻矮化相關(guān)基因RcDof的克隆及分析

孫華軍1,李國瑞1,2,3,4,黃鳳蘭1,2,3,4,李躍1,叢安琪1,李威5,齊蒙5,陳永勝1,2,3,4

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼028000;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 通遼028000;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點實驗室,內(nèi)蒙古 通遼028000;4.內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新培育中心，內(nèi)蒙古 通遼028000;5.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼028000)

為研究RcDof基因在蓖麻矮化中的作用及生物學(xué)功能,提取蓖麻生長躍變期莖尖中基因組DNA,根據(jù)蓖麻中已獲得的鋅指蛋白基因片段設(shè)計引物,采用RACE技術(shù)克隆得到該基因,基因完整閱讀框全長為924 bp,可編碼307個氨基酸,為C2C2型鋅指蛋白,預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為34.020 9 kDa,等電點為9.23。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明α螺旋占1.63%,β折疊占1.30%,其他無規(guī)則卷曲占97.07%,為外釋放蛋白。亞細胞定位于細胞核中,對RcDof基因的生物信息學(xué)分析為進一步研究其在蓖麻矮化過程中的作用機制和功能特征提供理論依據(jù)。

蓖麻矮化;基因克隆;亞細胞定位;生物信息學(xué)分析

蓖麻(RicinuscommunisL.)為大戟科蓖麻屬植物,是特種油料作物[1]。蓖麻油及其衍生物廣泛應(yīng)用于工業(yè)、國防、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域,具有較高的經(jīng)濟價值。由于目前蓖麻產(chǎn)量不高,與其他經(jīng)濟作物如玉米、水稻等相比種植效益低下,使得農(nóng)民的種植積極性受到制約,從而極大地限制了蓖麻種植業(yè)的發(fā)展。而矮稈蓖麻植株矮,增強了其抗倒伏、抗旱性及耐瘠薄能力,使蓖麻防災(zāi)抗災(zāi)能力明顯增強,提高了瘠薄地或邊際地的利用效率,提高蓖麻產(chǎn)量,進而調(diào)動了農(nóng)民種植的積極性[2]。因此，培育抵抗能力強、適合機械化栽培、產(chǎn)量高的蓖麻矮化新品種為蓖麻育種的首要目標[3],也是實現(xiàn)農(nóng)民增收、提高國民利益的有效途徑。

Dof(DNA-binding with one finger)蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[4],在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用。Dof 蛋白一般由200～400 個氨基酸組成。通常包含2 個主要的結(jié)構(gòu)域:位于N-末端的DNA 高度保守結(jié)合域[5]和位于C-末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控域[6]。Dof蛋白N-末端的DNA結(jié)合域是由52個保守的氨基酸殘基組成的C2C2型單鋅指結(jié)構(gòu)域,此單鋅指結(jié)構(gòu)中有4個絕對保守的Cys殘基和1個Zn2+共價結(jié)合。Zn2+和Cys殘基是Dof蛋白保持活性所必需的,二價離子鰲合劑的存在以及對Cys殘基的任何替換都會使Dof蛋白喪失活性[7]。位于Dof 蛋白C-末端的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域,其氨基酸序列較為多變不具有保守性[8]。

研究表明:Dof蛋白在植物生長發(fā)育過程中參與多種生物學(xué)過程,如碳氮代謝、光響應(yīng)、花和花粉發(fā)育、種子發(fā)育和萌發(fā)、次生代謝、保衛(wèi)細胞特異基因的調(diào)控、植物生長素響應(yīng)等,可以調(diào)控植株矮化、花粉敗育等表型變化[9-15]。本試驗擬通過克隆與蓖麻矮化相關(guān)的RcDof基因并進行生物信息學(xué)分析,為進一步研究RcDof基因?qū)Ρ吐榘恼{(diào)控機制奠定理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗材料

蓖麻通蓖5號及其子代矮化品種由內(nèi)蒙古通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA的提取采用TaKaRa的RNA提取試劑盒提取蓖麻通蓖5號生長躍變期莖尖的總RNA,備用。

1.2.2RcDof基因5′RACE和3′RACE的擴增以蓖麻通蓖5號生長躍變期莖尖的總RNA為模板,參照TaKaRa公司的cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄,分別合成5′RACE和3′RACE cDNA第一鏈。根據(jù)蓖麻中已獲得的鋅指蛋白基因片段設(shè)計3′端引物序列為AATTCTGTTGCAACACTG,5′端引物序列為GAAACAAAAGCAAAACC。2條引物間重疊序列為107 bp,擴增出的3′端序列和5′端序列送GENERAY公司測序。

1.2.3RACE擴增片段的克隆5′RACE和3′RACE的PCR擴增產(chǎn)物大小用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收特異條帶,連接pMD-18T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,進行藍白斑篩選,挑取白色單菌落,放大培養(yǎng)后用5′RACE和3′RACE引物進行PCR擴增,擴增程序:94 ℃預(yù)變性 5 min,94 ℃ 變性30 s,51.4 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,28個循環(huán)。將陽性克隆送至GENERAY公司測序。

1.2.4RcDof基因的生物信息學(xué)分析克隆得到的RcDof基因序列,利用ExPASy ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測蛋白質(zhì)的分子式、分子量、等電點和不穩(wěn)定系數(shù)等。利用Predict-protein(http://www.predictprotein.org)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測,利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對蛋白質(zhì)跨膜型進行預(yù)測,利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/job)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測。

1.2.5亞細胞定位分析用限制性內(nèi)切酶NocⅠ和SpeⅠ對表達載體pCAMBIA1302線性化,將RcDof基因與線性化的表達載體pCAMBIA1302連接,得到連接產(chǎn)物為pCAMBIA1302-RcDof,并將連接產(chǎn)物pCAMBIA1302-RcDof轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中,對重組子進行PCR擴增檢測和酶切檢測。將連有RcDof基因的表達載體pCAMBIA1302-RcDof轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105中,并對重組子進行PCR擴增檢測和酶切檢測。參照連肖華等[16]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞進行定位,并在熒光顯微鏡下進行觀察。

2　結(jié)果與分析

2.1蓖麻總RNA的提取

通過圖1可以看出,利用RNA提取試劑盒法提取蓖麻生長躍變期莖尖的總RNA,經(jīng)電泳檢測后沒有DNA污染,28S和18S核糖體RNA亮度接近2∶1,紫外分光光度計檢測結(jié)果顯示OD260/280為1.90,說明提取的蓖麻莖尖總RNA純度高,可用于后續(xù)試驗。

圖1　蓖麻總RNA提取結(jié)果

2.2RcDof基因及編碼的氨基酸特征分析

在已知序列的基礎(chǔ)上利用RACE試劑盒對鋅指蛋白RcDof基因進行5′RACE PCR擴增和3′RACE PCR擴增,產(chǎn)物大小分別為485,513 bp(圖2)。測序后對序列進行拼接獲得具有完整開放閱讀框(Open reading frame,ORF) 全長為924 bp的序列,編碼307個氨基酸,其中絲氨酸含量最高達到41個,占13.4%;蘇氨酸30個,占9.8%;谷氨酰胺和天冬酰胺27個,占8.8%。根據(jù)ExPASy ProtParam 預(yù)測:RcDof基因編碼蛋白的分子式為C1465H2325N425O480S14,分子量為34.020 9 kDa,推測的等電點為9.23,不穩(wěn)定系數(shù)為51.54(>40),屬于不穩(wěn)定蛋白。RcDof肽鏈中帶負電荷殘基總數(shù)20,帶正電荷殘基總數(shù)30,半衰期為30 h。根據(jù)ProtScale 預(yù)測和分析RcDof蛋白氨基酸序列疏水性平均值為-0.727,表現(xiàn)出疏水性,由此推斷該蛋白可能為疏水蛋白。Predict-protein分析發(fā)現(xiàn)α螺旋占1.63%,β折疊占1.30%,其他無規(guī)則卷曲占97.07%。

2.3RcDof同源性和系統(tǒng)進化分析

利用ClustalW 軟件將RcDof的氨基酸序列與其他已知植物的氨基酸序列進行多序列比對(圖3),結(jié)果表明,RcDof與已知植物的Dof家族蛋白高度同源,與毛果楊氨基酸序列同源性達90%。利用MEGA 5.2 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖4),結(jié)果表明,RcDof先與毛果楊PtDof形成分支,結(jié)果符合進化關(guān)系,與同源性比對結(jié)果一致。

M.DL2000 Marker;1.5′RACE擴增產(chǎn)物;2.3′RACE擴增產(chǎn)物。

圖3　多個蛋白同源性比較

圖4　進化樹分析

2.4RcDof功能預(yù)測

Iprscan分析后發(fā)現(xiàn)在RcDof氨基酸序列中有3個Dof型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域,分別位于44～101的zf-Dof-1,55～86的zf-Dof和48～102的zf-Dof-2氨基酸(圖5)。進一步證實該基因具有鋅指結(jié)構(gòu),并極有可能為鋅指蛋白。

圖5　三個鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)

SMART軟件進一步分析后發(fā)現(xiàn)48～84位氨基酸有ZnF_C2C2鋅指結(jié)構(gòu),功能為轉(zhuǎn)錄延伸因子TFIIS和RNA聚合酶的結(jié)合序列。46～81位氨基酸有一個ZnF_RBZ鋅指結(jié)構(gòu),(Ran是細胞內(nèi)的一種具有GTP酶活性的功能蛋白,可以調(diào)節(jié)染色體穩(wěn)定性、細胞核組建以及核質(zhì)運輸?shù)榷喾N細胞進程[17])其主要功能是鋅指中的Ran-binding蛋白質(zhì)結(jié)合域,還有其他蛋白,該區(qū)域能夠結(jié)合RanGDP。47～81位氨基酸有ZnF_C4鋅指結(jié)構(gòu),是一種激素的受體,功能為C4鋅指核激素受體,可以與激素相互作用而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。70～105位氨基酸有Znf_U1鋅指蛋白(表1)。該分析結(jié)果表明該序列含有很多鋅指結(jié)構(gòu),屬于Dof鋅指蛋白,并且極有可能具有以上的功能。

表1　SMART軟件分析結(jié)果

2.5亞細胞定位

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行洋蔥表皮細胞定位發(fā)現(xiàn)RcDof蛋白定位于細胞核中,表明該基因在細胞核中表達(圖6)。

A.定位結(jié)果;B.陽性對照;C.陰性對照。

3　討論

Dof蛋白是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,在動物和酵母中并不存在。Dof蛋白在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用,包括調(diào)控模式植物擬南芥的開花和光敏色素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[17],擬南芥中Dof6轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控ABA的合成影響種子的萌發(fā)[18],擬南芥AtDof4.2基因可以導(dǎo)致花粉敗育[19],煙草Dof蛋白NtBBF1能調(diào)控生長素的誘導(dǎo)表達[20],大豆中Dof轉(zhuǎn)錄因子GmDof4和GmDof11可以通過調(diào)控脂肪酸生物合成過程中的相關(guān)基因,提高種子中油脂含量[21]。上述的報道表明,Dof轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長發(fā)育的多個生物學(xué)過程。

本試驗克隆得到的Dof型鋅指蛋白RcDof基因是蓖麻中第1個報道的鋅指蛋白基因。結(jié)合C2C2鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測,以及參照其在擬南芥和水稻中的功能,該C2C2型鋅指蛋白可能參與蓖麻的生長、發(fā)育及代謝等過程,對該鋅指蛋白基因的表達分析及其功能研究將是下一步探討的主要內(nèi)容。同時亞細胞定位分析也表明該基因定位于細胞核中,本研究可為Dof轉(zhuǎn)錄因子在蓖麻植物中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)理論,為培育蓖麻新品種提供思路和方法。

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Cloning and Analysis of RcDof Gene Associated with Castor Dwarfing

SUN Huajun1,LI Guorui1,2,3,4,HUANG Fenglan1,2,3,4,LI Yue1,CONG Anqi1,LI Wei5,QI Meng5,CHEN Yongsheng1,2,3,4

(1.College of Life Science,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao028000,China;2.Inner Mongolia Industrial Engineering Research Center of Universities for Castor,Tongliao028000,China;3.Inner Mongolia Key Laboratory of Castor Breeding,Tongliao028000,China;4.Inner Mongolia Collaborate Innovation Cultivate Center for Castor,Tongliao02800,China;5.College of Agronomy,Inner Mongolia University for Nationalities,Tongliao028000,China)

In order to research the features and biological function ofRcDofgene in dwarf castor,stem tip genome DNA was extracted in growth climacteric age.Primers were designed according to obtained Zinc finger protein gene fragment.Using RACE technology,the complete full-length open reading frame of 924 bp was cloned,encoding 307 amino acids,belonged to C2C2 zinc finger protein,predicted protein molecular weight was 34.020 9 kDa,isoelectric point was 9.23.The predicted secondary structure α helix accounted for 1.63%,β fold accounted for 1.30%,other non-random coil accounted 97.07%,belonged to outer release proteins.Subcellular localization showed that theRcDofgene located in the nucleus.The bioinformatics analysis ofRcDofgene will lay the foundations for the further study on its action mechanism and function characteristics in the castor dwarfing process.

Castor dwarfing;Gene clone;Subcellular localization;Bioinformatics analysis

2016-03-21

國家自然科學(xué)基金項目(31460353);2015年全區(qū)研究生科研創(chuàng)新資助項目(S20151013601);內(nèi)蒙古民族大學(xué)市校合作項目(SXZD2012006;SXZD2012017);內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)資金項目(KJCX15002);內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新培育中心項目；內(nèi)蒙古自治區(qū)蓖麻育種重點實驗室開放基金項目(MDK2016030)

孫華軍(1992-),女,內(nèi)蒙古呼倫貝爾人,在讀碩士,主要從事蓖麻分子育種研究。

陳永勝(1971-),男,內(nèi)蒙古通遼人,教授,博士,主要從事蓖麻分子育種研究。

Q78

A

1000-7091(2016)04-0063-05

10.7668/hbnxb.2016.04.011