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    大青山油松根際固氮菌的多樣性研究

    2016-09-23 10:20:12牛艷芳王飛宇陳立紅
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年22期
    關(guān)鍵詞:固氮菌大青山離心管

    牛艷芳, 王飛宇, 陳立紅*, 閆 偉

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

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    大青山油松根際固氮菌的多樣性研究

    牛艷芳1,2, 王飛宇1, 陳立紅1*, 閆 偉2

    (1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

    [目的]研究大青山油松樹種根際固氮菌的多樣性。[方法]對從大青山油松(Pinustabulaeformis)根際土壤中分離的固氮菌進行16S rDNA擴增及序列測定,應(yīng)用 DNAMAN 6.0軟件進行多序列比對,使用 MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。[結(jié)果]大青山油松根際土壤中分離的46株固氮菌分屬于Pseudomonas、Bacillus、Phyllobacterium、Cupriavidus、Paenibacillus、Enterobacter、Agrobacterium、Arthrobacter、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等11個不同的類群,其中Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium為優(yōu)勢屬種。系統(tǒng)分析表明,大青山油松根際土壤中固氮菌具有較豐富的多樣性。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為森林生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

    大青山;油松;固氮菌;16S rDNA

    生物固氮是生物圈氮素的重要來源,對于陸地生態(tài)系統(tǒng)具有基礎(chǔ)性作用[1-3]。森林生態(tài)系統(tǒng)作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的主體,在調(diào)節(jié)全球碳平衡和減緩全球氣候變化進程中扮演著重要角色,具有其他生態(tài)系統(tǒng)無可替代的作用[4]。由于近幾十年的開發(fā)和利用,森林、草地、濕地生態(tài)系統(tǒng)均受到了不同程度破壞,造成面積縮小,生態(tài)系統(tǒng)失衡。

    大青山位于內(nèi)蒙古呼和浩特市和包頭市一線北側(cè),屬于陰山山脈中段,地處110°45′52″~111°32′12″E,40°37′41″~40°57′30″N。該區(qū)地處溫帶半干旱區(qū),屬于大陸性氣候,海拔1 050~2 374 m。大青山是陰山山脈植物種數(shù)最豐富的一段山體,森林覆蓋率為41.65%,土壤類型有淋溶灰褐土、粗骨土、山地栗鈣土、灰褐土和草灌灰褐土等。森林植被包括針葉林和闊葉林,其中針葉林主要樹種有油松、青海云杉、杜松,局部地區(qū)出現(xiàn)華北落葉松,闊葉林主要樹種有白樺、遼東櫟、蒙椴、山楊、山杏[5-6]。內(nèi)蒙古從東到西有大興安嶺—陰山山脈—賀蘭山,這些地區(qū)溫度、適度、降雨量、蒸發(fā)量、土壤類型和植被類型等生態(tài)條件復(fù)雜多變,而針葉樹種落葉松和油松是這些山脈森林地帶的主要樹種,它們在維持和改善內(nèi)蒙古生態(tài)環(huán)境中占據(jù)重要地位[7-10]。筆者研究大青山油松樹種根際固氮菌的多樣性,旨在為森林生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1土樣采集試驗地位于內(nèi)蒙古大青山古路板林場人工油松林,地處111°50′40″E,40°58′12″N,坡度16°,海拔1 307 m。該區(qū)地處內(nèi)陸北緯中溫帶,屬于典型的大陸性半干旱季風氣候。年平均降水量為350 ~ 450 mm,濕度0.3~0.6,年平均氣溫6 ℃,無霜期120 d。土壤主要為山地栗鈣土,質(zhì)地多為砂壤和輕壤土,pH在7.0 左右。油松人工林的平均基徑為9.50 cm,平均樹高為549 cm,林齡為21 a[11]。將土壤樣品裝入無菌的封口袋編號標記,帶回后放置于4 ℃冰箱中冷藏。

    1.2固氮菌的分離與純化采用阿須貝培養(yǎng)基(葡萄糖 10 g、KH2PO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.2 g、CaSO40.2 g、CaCO35 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL,pH 7.0~7.2)分離和純化土壤樣品中的固氮菌。稱取10 g土樣,放入裝有90 mL無菌水的加有玻璃珠的三角瓶中,在搖床上150 r/min,振蕩20 min,依次制成10-3、10-4、10-53個不同稀釋度的土壤懸液,分別接種到培養(yǎng)皿中,用無菌玻璃棒涂布均勻,28 ℃下恒溫培養(yǎng)6~7 d。將培養(yǎng)出來的固氮菌菌落采用劃線法進行分離,約4~5代后即可分離到純種的固氮菌。將純化后的固氮保存在試管中,置于4 ℃冰箱中備用[12-15]。

    1.3固氮菌基因組DNA的提取在1.5 mL滅菌的離心管中加入 500 μL TE 溶液,用無菌牙簽刮取培養(yǎng)皿上的單菌落溶于TE溶液中。在每個離心管中加入 50 mg/mL 的溶菌酶3 μL,充分混勻,在 37 ℃下作用 2 h。在每個離心管中再加入5 mol/L NaCl 30 μL和 20% 的 SDS 30 μL,充分混勻,在 65 ℃下作用 1 h。加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),充分混勻,在 12 000 r/min 離心 10 min,此后收集上清液約400 μL于新的滅菌離心管中。加入2倍體積的無水乙醇,充分混勻,12 000 r/min離心 5 min,收集沉淀。用70%的乙醇洗滌沉淀,之后將乙醇倒掉,用無菌濾紙吸干離心管中的水分,風干后再溶于 50 μL 的 ddH2O中,保存于-20 ℃下。

    1.4固氮菌16S rDNA的擴增以固氮菌基因組DNA為模板,采用細菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增16S rDNA。PCR反應(yīng)體系為:12.5 μL DreamTaqGreen PCR Master Mix(2×)、1.0 μL 10 μmol/L引物27f、1 μL 10 μmol/L引物1492 r,1.0 μL模板DNA,添加9.5 μL ddH2O補足至25 μL。PCR擴增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,45 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測[16]。

    1.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進行測序,將測定的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中BLAST同源序列,利用DNAMAN軟件進行多序列比對并人工校對,利用MEGA 4.0軟件計算Kimura′s two-parameter遺傳距離,并構(gòu)建Neighbor-Joining(NJ)自展一致系統(tǒng)發(fā)育樹,自展重復(fù)總數(shù)為1 000[17]。

    2 結(jié)果與分析

    2.116S rDNA的擴增采用阿須貝無氮培養(yǎng)基對采自大青山油松根際土壤中的固氮菌進行分離。根據(jù)菌落形態(tài)、大小和顏色以及菌體形態(tài)和大小等特征,分離出57株固氮菌。以細菌通用引物27f 和1 492r 對分離菌株的16S rDNA 基因片段進行擴增,所得片段大小約為1.5 kb(圖1)。

    圖1 固氮菌16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.1 The amplified products of 16S rDNA gene from nitrogen-fixing bacteria strains

    2.216S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析應(yīng)用 DNAMAN 6.0 軟件對分離出的菌株和從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與待分析序列相近的已知種模式菌株的 16S rDNA序列進行多序列比對,然后使用MEGA4.0軟件采用鄰接法(Neighbor-joining method) 構(gòu)建部分分離的固氮菌菌株與相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖2可以看出,呼和浩特大青山油松根際土壤中固氮菌具有非常豐富的多樣性,它們分布于11個系統(tǒng)發(fā)育分支上。菌株 QS7、QS19、QS30、QS32、QS33、QS36、QS39、QS41、QS50、QS53 等菌株與菌株P(guān)seudomonassp.Ats6 和Pseudomonassp.3-7 聚在一起;菌株 QS25、QS55 和菌株Enterobactersp.D22 聚在一起;菌株 QS14 和菌株Naxibactersp.6981 聚在一起;菌株 QS15 和菌株Burkholderiasp.5AT11 聚在一起;菌株QS1、QS6、QS24、QS261 和菌株Cupriavidusnecatorss1-6-6 聚在一起;菌株QS2、QS54、QS332 和菌株P(guān)hyllobacteriumsophoraeCCBAU 03415 聚在一起;菌株 QS3 和菌株Ensifersp.S16 聚在一起;菌株 QS4、QS27 和菌株AgrobacteriumtumefaciensCh3 聚在一起;菌株 QS31 和菌株ArthrobacterS3.TSA.019 聚在一起;菌株 QS12、QS26與菌株P(guān)aenibacillussp.C-19-1 聚在一起;菌株 QS23、QS29、QS35、QS37 與菌株Bacillussp.DU190(2010) 聚在同一分支上。

    圖2 固氮菌基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2  Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences from nitrogen-fixing bacteria strains

    2.3大青山油松根際固氮菌群落結(jié)構(gòu)分析利用阿須貝培養(yǎng)基從大青山油松根際土壤中共分離出固氮菌57株,經(jīng)16S rDNA序列鑒定出46株固氮菌。其中,Pseudomonas有11株,占23.91%;Bacillus有7株,占15.22%;Arthrobacter有7株,占15.22%;Phyllobacterium有5株,占10.87%;Paenibacillus有4株,占8.7%;Cupriavidus有4株,占8.7%;Enterobacter有3株,占6.52%;Agrobacterium、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等4個屬的固氮菌5株,占10.87%。在大青山油松根際土壤中Pseudomonas、Bacillus、Phyllobacterium、Arthrobacter為優(yōu)勢屬,其數(shù)量從多到少依次為:Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium。

    表1 不同固氮菌類群所占比例

    3 結(jié)論

    結(jié)合菌體形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析,從大青山油松根際土壤中分離出46株固氮菌,它們分布于11個系統(tǒng)發(fā)育分支上。其中,11株屬于Pseudomonas,7株屬于Bacillus,7株屬于Arthrobacter,5株屬于Phyllobacterium,其余18株分屬于Cupriavidus、Paenibacillus、Enterobacter、Agrobacterium、Naxibacter、Burkholderia、Ensifer等7個不同的屬。大青山油松根際土壤中固氮菌具有較豐富的多樣性,其中Pseudomonas、Bacillus、Arthrobacter、Phyllobacterium屬于優(yōu)勢類群。

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    Diversity of Nitrogen-fixing Bacteria fromPinustabulaeformisin Daqing Mountains

    NIU Yan-fang1,2,WANG Fei-yu1,CHEN Li-hong1*et al

    (1.Agricultural College,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia 010019; 2.College of Forestry,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia 010019)

    [Objective] The aim was to study diversity of nitrogen-fixing bacteria isolated fromPinustabulaeformisin Daqing Mountains.[Method] To amply and sequence 16S rDNA gene of nitrogen-fixing bacteria isolated fromPinustabulaeformisin Daqing Mountains,the alignment of 16S rDNA sequences was conducted by DNAMAN 6.0,and the Neighbor-joining phylogenetic tree was constructed by MEGA 4 software.[Result] The phylogenetic analysis showed that forty-six isolates fromP.tabulaeformisbelonged to eleven groups,which arePseudomonas,Bacillus,Phyllobacterium,Cupriavidus,Paenibacillus,Enterobacter,Agrobacterium,Arthrobacter,Naxibacter,Burkholderia,Ensifer,andPseudomonas,Bacillus,Arthrobacter,Phyllobacteriumare dominant groups.The results showed that the nitrogen-fixing bacteria fromP.tabulaeformisin Daqing Mountains have rich diversity.[Conclusion] The results can provide theoretical basis for sustainable development of forest ecosystem.

    Daqing Mountains;Pinustabulaeformis; Nitrogen-fixing bacteria; 16S rDNA

    國家自然科學(xué)基金項目(31260173) 。

    牛艷芳(1977- ),女,內(nèi)蒙古包頭人,博士研究生,研究方向:林木生物技術(shù)。*通訊作者,副教授,博士,從事土壤微生物和林木生物技術(shù)研究。

    2016-06-20

    S 718.8

    A

    0517-6611(2016)22-001-03

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