口腔慢性移植物抗宿主病患者唾液T細胞相關(guān)細胞因子的表達水平

彭艷　雍翔智　馮豆豆　曾啟新　梅國城　陶人川

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科　南寧 530021；2.廣西艾滋病防治研究重點實驗室　南寧 530021

口腔慢性移植物抗宿主病患者唾液T細胞相關(guān)細胞因子的表達水平

彭艷1,2雍翔智1馮豆豆1,2曾啟新1梅國城1陶人川1,2

1.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科南寧 530021；2.廣西艾滋病防治研究重點實驗室南寧 530021

目的檢測異基因造血干細胞移植后口腔慢性移植物抗宿主?。╟GVHD）患者唾液T細胞相關(guān)細胞因子的表達水平，了解患者T細胞的免疫狀態(tài)及其作用機制。方法移植組納入確診為口腔cGVHD患者18例，并對其口腔表征進行評分；對照組納入健康者18例。收集兩組唾液，采用流式液相多重蛋白定量技術(shù)檢測T細胞相關(guān)細胞因子——干擾素（IFN）-γ、白細胞介素（IL）-4、IL-6、IL-10表達水平。結(jié)果移植組中IFN-γ，IL-4水平與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異；移植組IL-6、IL-10表達量分別為255.04 pg·mL-1和1.49 pg·mL-1，顯著高于對照組6.02 pg·mL-1和0.17 pg·mL-1，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；移植組中口腔表征評分與IL-6 、IL-10濃度均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.978（P＜0.01）、r=0.668（P＜0.01），同時IL-6和IL-10濃度呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.666 （P＜0.01）。結(jié)論口腔cGVHD患者唾液IL-6和IL-10表達呈上調(diào)趨勢，口腔表征越嚴重，IL-6和IL-10表達水平越高，提示口腔cGVHD發(fā)病機制可能由Th2細胞相關(guān)細胞因子（IL-6、IL-10）介導(dǎo)。

造血干細胞移植；口腔慢性移植物抗宿主??；T細胞

This study was supported by the Natural Science Foundation of Guangxi（2014GXNSFAA118149）.

［Abstract］ObjectiveThis study aimed to explore the levels of T-cell cytokines in saliva of patients with oral chronic graft-versus-host-disease（cGVHD） who have undergone hematopoietic stem cell transplantation，as well as understand the T-cell immune status in patients. MethodsEighteen oral cGVHD patients were recruited as the transplantation group，and the scores of oral manifestations were recorded. Furthermore，18 healthy volunteers were selected as healthy controls. The unstimulated saliva of the two groups was collected，and the concentrations of T-cell cytokines such as interferon（IFN）-γ，interleukin（IL）-4，IL-6，and IL-10 in saliva were detected by cytometric bead array. ResultsIFN-γ and IL-4 levels in the transplantation group showed no difference from those of healthy controls. By contrast，the levels of IL-6 and IL-10 were significantly higher than those of healthy controls（255.04 pg·mL-1vs. 6.02 pg·mL-1and 1.49 pg·mL-1vs. 0.17 pg·mL-1，respectively；P＜0.01）. The scores of oral manifestations were positively related to IL-6（r=0.978，P＜0.01） and IL-10 （r=0.668，P＜0.01） levels. The levels of IL-6 and IL-10 were also positively correlated（r=0.666，P＜0.01）. ConclusionThe expression levels of IL-6 and IL-10 in saliva were both up-regulated in oral cGVHD patients. Severe oral manifestations corresponded to high levels of IL-6 and IL-10. Thus，Th2 cell cytokines（IL-6 andIL-10） might play a significant role in the pathogenesis of oral cGVHD.

［Key words］hematopoietic stem cell transplantation；oral chronic graft-versus-host-disease；T cell

異基因造血干細胞移植（hematopoietic stemcell transplantation，HSCT）是治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要手段，其中慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host-disease，cGVHD）是常見的并發(fā)癥。cGVHD被確認為是HSCT后，患者在無復(fù)發(fā)疾病影響的情況下高死亡率的原因及影響患者長期健康生存的重要因素［1-2］。

目前，cGVHD的發(fā)生機制尚不明確，大致有兩種觀點：一種理論認為cGVHD僅僅是一個晚期的異源性反應(yīng)，即供者原始T淋巴細胞向輔助性T細胞（T helper cell，Th）2細胞分化，與B細胞活化和自身抗體的產(chǎn)生相關(guān)［3］；另一種觀點則認為是HSCT后T細胞的重建缺陷，包括外周免疫耐受的改變和中樞負免疫應(yīng)答減少，導(dǎo)致細胞因子分泌，溶細胞活動和抗體產(chǎn)生的改變［4］。

口腔是cGVHD 最常累及的器官之一，僅次于皮膚，移植后患者出現(xiàn)口腔cGVHD的范圍為45%～83%，常見的靶組織為黏膜、唾液腺、牙周組織等［5］。唾液是距離病灶最近的體液，同時唾液的采集具有無創(chuàng)性，相較于血液，唾液更易獲取。

本研究通過測定口腔cGVHD患者唾液T細胞相關(guān)細胞因子的表達水平，以初步了解口腔cGVHD患者T細胞免疫特點。

1　材料和方法

1.1研究對象

將2015年1—6月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院確診［6］為口腔cGVHD的患者18例納入移植組，其中男性10例，女性8例，平均年齡（28.72±8.93）歲，移植病程均為100～180 d。同期，將與移植組性別、年齡匹配的無全身及口腔疾病的健康者18例納入對照組，其中男性9例，女性9例，平均年齡（33.47±7.99）歲。所有研究對象均知情同意。

1.2主要試劑和儀器

流式細胞儀、FCAP Array v1.0 CBA分析軟件、流式液相多重蛋白定量技術(shù)（cytometric bead array，CBA）自由組合試劑（BD公司，美國）。

1.3方法

所有研究對象均于早上9：00—11：00就診，根據(jù)2014年美國國立衛(wèi)生研究院（national institutes of health，NIH）制定的診斷［6］及口腔表征評分標(biāo)準(zhǔn)［7］（表1）對口腔cGVHD患者進行評分。

表1　cGVHD患者口腔表征評分標(biāo)準(zhǔn)Tab1　Scoring criteria of oral manifestations among cGVHD patients

所有研究對象均采用50 mL離心管收集非刺激性全唾液，2 h內(nèi)送往實驗室，3 500 r·min-1常溫下離心10 min，收集上清液分裝，保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

批量檢測，每個待測樣本溶解后3 500 r·min-1常溫下離心10 min，取上清液50 μL用于CBA檢測IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10細胞因子。CBA檢測在流式細胞儀上進行，具體步驟參照試劑盒說明，運用FCAP Array v1.0分析軟件進行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及數(shù)據(jù)分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)處理。兩組細胞因子濃度比較采用兩樣本均數(shù)比較的非參數(shù)檢驗，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1基本資料及口腔表征

移植組與對照組年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。18例口腔cGVHD患者中口內(nèi)檢查均見口腔白紋，唇、雙頰、舌、牙齦、上腭均可累及；其中11例有糜爛（紅斑樣病損），主要集中在雙頰、硬腭，疼痛不適，影響進食；5例述有口干，唾液分泌量減少；3例罹患潰瘍，舌邊緣多見?？谇槐碚髟u分分布為1分5例，2分2例，3分2例，4分2例，5分1例，6分5例，9分1例。

2.2兩組唾液IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10濃度比較

采用CBA技術(shù)測定移植組18份和對照組18份唾液樣本中的IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10細胞因子濃度。經(jīng)檢驗，細胞因子濃度均呈非正態(tài)分布，因此用中位數(shù)和四分位數(shù)間距描述，采用兩獨立樣本均數(shù)比較的非參數(shù)檢驗。對兩組唾液中的IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10濃度進行比較，IFN-γ和IL-4濃度無明顯差異（P＞0.05）；而移植組中IL-6、IL-10濃度分別為255.04（1 904.49）pg·mL-1和1.49（3.29）pg·mL-1，顯著高于對照組6.02 （8.56）pg·mL-1和0.17（2.20）pg·mL-1，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3移植組患者口腔表征評分與唾液中IL-6、IL-10濃度相關(guān)性分析

對移植組患者口腔表征評分與唾液中IL-6、IL-10濃度做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：口腔表征評分與唾液中IL-6、IL-10濃度均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.978（P＜0.01）和r=0.668（P＜0.01）；唾液中IL-6和IL-10濃度也呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r=0.666（P＜0.01）。

3　討論

本研究中cGVHD患者的口腔表征基本為口腔白紋、糜爛、潰瘍、口干等，與本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)基本一致［8］。NIH最新發(fā)布的口腔cGVHD診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］中，苔蘚樣改變即過角化白紋被視為特征性表現(xiàn)，病損可累及口腔內(nèi)任何部位；紅斑樣病損多表現(xiàn)在硬腭與軟腭；皰性病損多見于口腔后份黏膜，同時由于患者進食時易破潰而形成潰瘍，從而影響患者的進食和生活質(zhì)量。多數(shù)患者還會伴有疼痛，唾液分泌量減少，進而導(dǎo)致口腔干燥，同時伴隨著唾液免疫球蛋白的減少而導(dǎo)致口腔易感性增高［9］。對口腔表征進行評分，其分值大小可以間接反映疾病的嚴重程度，同時也可根據(jù)口腔表征評分進行相應(yīng)的臨床用藥。

移植物抗宿主病中，骨髓移植物中成熟T細胞被宿主的異型組織相容性抗原（包括主要與次要相容性抗原）激活，增殖分化為效應(yīng)T細胞，并隨血循環(huán)游走至受者全身，對宿主組織或器官發(fā)動免疫攻擊［10］。Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子，參與細胞免疫，IFN-γ可抑制Th2介導(dǎo)的體液免疫。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10，主要介導(dǎo)體液免疫，其中IL-4和IL-10可抑制細胞免疫應(yīng)答。

Hayashida等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Th1細胞因子如IL-2和INF-γ幾乎表達在所有cGVHD口腔病損的患者，細胞因子表達的程度與淋巴細胞浸潤程度或臨床嚴重程度沒有關(guān)系；相比之下，cGVHD口腔病變的患者Th2細胞因子如IL-4和IL-5表達與淋巴細胞浸潤和嚴重的組織損傷有關(guān)；他們認為，Th1細胞因子可能在cGVHD初始階段和/或維持階段起作用，而Th2細胞因子則在疾病進展中起作用。Lin-hares等［12］則認為急性GVHD是Th1淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)，而cGVHD是由Th2淋巴細胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)。

IL-6是一種前炎癥細胞因子，在移植后感染、黏膜炎、肝靜脈閉塞癥和GVHD等情況下，其水平都會升高。有研究［13］指出，IL-6是局部黏膜炎癥反應(yīng)中的重要中介物，可能會是一個潛在的反映活動性口腔cGVHD嚴重程度的生物標(biāo)志物。IL-10是一種抗炎癥因子，可以抑制INF-γ、IL-2等細胞因子分泌。IL-10水平升高可能原因是：當(dāng)系統(tǒng)發(fā)生細胞因子風(fēng)暴時，IL-10作為一種抗炎因子，反應(yīng)性的增高以對抗炎癥反應(yīng)，于是IL-10的水平就和炎癥反應(yīng)的水平呈正相關(guān)關(guān)系。本研究中IL-6和IL-10在口腔cGVHD中高表達，并且與疾病嚴重程度成正相關(guān)關(guān)系，預(yù)示著口腔cGVHD可能是由Th2相關(guān)細胞介導(dǎo)。

常規(guī)的口腔cGVHD復(fù)查及口腔科與移植團隊間的良好溝通，對于移植后患者并發(fā)癥的預(yù)防以及治療是非常重要的。細胞因子有著成為口腔cGVHD監(jiān)測及早期預(yù)警的良好條件，因為細胞因子可以直接刺激并且活化效應(yīng)細胞，展開對靶器官的攻擊，是整個免疫激活過程的核心因素；同時細胞因子對檢測要求低，采用CBA技術(shù)檢測時，血清樣本可在-80 ℃凍存3～6個月，技術(shù)穩(wěn)定，可重復(fù)性好。

綜上，本實驗中口腔cGVHD患者唾液IL-6和IL-10表達呈上調(diào)趨勢；口腔表征越嚴重，IL-6和IL-10表達水平越高，預(yù)示著IL-6和IL-10可以作為潛在性的預(yù)測生物因子對cGVHD進行預(yù)測，以起到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療的作用。

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（本文編輯張玉楠）

Salivary T cell cytokine expression in oral chronic graft-versus-host-disease

Peng Yan1，2，Yong Xiangzhi1，F(xiàn)eng Doudou1，2，Zeng Qixin1，Mei Guocheng1，Tao Renchuan1，2.（1. Dept. of Periodontal Mucosa，Hospital of Stomatology，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2. Guangxi Key Laboratory of AIDS Prevention and Treatment，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

R 781.5

A

10.7518/gjkq.2016.05.008

2016-01-02；

2016-04-19

廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFAA118149）

彭艷，碩士，Email：pengyan1229@126.com

陶人川，教授，博士，Email：dr.taorc@foxmail.com