雙氫青蒿素逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞耐藥性的研究

陶鵬宇，施明杰，黃永焯，王慧媛，徐勤

（1.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海　201203；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州　510405）

雙氫青蒿素逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞耐藥性的研究

陶鵬宇1，2，施明杰1，黃永焯1，王慧媛1，徐勤2

（1.中國科學(xué)院上海藥物研究所，上海201203；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州510405）

【目的】評(píng)價(jià)雙氫青蒿素逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT8/ADR耐藥性的能力，研究其逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制?！痉椒ā坎捎盟募谆嫉螓}（MTT）法、流式細(xì)胞術(shù)分別進(jìn)行細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)雙氫青蒿素和阿霉素聯(lián)合用藥的藥效，采用Western blot法研究逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制。【結(jié)果】雙氫青蒿素和阿霉素聯(lián)用后對(duì)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞有較高的毒性，能誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)耐藥細(xì)胞的自噬。【結(jié)論】雙氫青蒿素能逆轉(zhuǎn)耐藥性，恢復(fù)耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。

雙氫青蒿素；結(jié)腸癌/中西醫(yī)結(jié)合療法；耐藥；自噬；細(xì)胞培養(yǎng)；細(xì)胞凋亡

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤，化療藥物治療是最常用的治療手段之一，然而其療效常常受多藥耐藥性（multidrug resistance，MDR）的限制［1］。腫瘤多藥耐藥的發(fā)生涉及多種機(jī)制，包括ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)［2］，對(duì)藥物誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)［3］，細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)［4］，細(xì)胞凋亡途徑的抑制及抗凋亡機(jī)制的增強(qiáng)［5］等。

青蒿為菊科植物黃蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分，其抗瘧作用的主要有效成分為青蒿素。雙氫青蒿素（DHA）是青蒿素衍生物，具有水溶性強(qiáng)、易吸收、代謝排泄迅速、毒副作用弱等優(yōu)勢(shì)［6］。雙氫青蒿素在治療耐氯喹或?qū)ζ渌喾N藥物耐藥的腦型瘧和惡性瘧時(shí)有特效［7］，在治療血吸蟲、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制瘢痕增生等方面也表現(xiàn)出明顯的調(diào)節(jié)功能［8］。近年來，雙氫青蒿素的抗腫瘤活性亦引起了人們的關(guān)注。

本研究以人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT8/ADR為研究對(duì)象，考察雙氫青蒿素與阿霉素（DOX）聯(lián)合應(yīng)用對(duì)該細(xì)胞的增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡的作用，并采用Western blot法對(duì)雙氫青蒿素逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的研究，從而為中藥聯(lián)合化療藥物治療腫瘤提供新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1藥物、試劑與儀器雙氫青蒿素（DHA，批號(hào)：MB 6911）和阿霉素（DOX，批號(hào)：MB 1087）均購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。β-巰基乙醇、過硫酸銨、異丙醇、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴酚藍(lán)、甲醇、二甲基亞砜、碘化丙啶（PI）等均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RMPI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基干粉、胎牛血清購于美國Gibco公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的重組人磷脂結(jié)合蛋白Annexin V（Annexin V-FITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司；抗微管相關(guān)輕鏈蛋白LC3抗體、抗細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體均購于美國Abcam公司。微孔濾膜（美國Millipore公司）；LDZX-50KBS高溫高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械）；X85-2磁力加熱攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；EPS300電泳儀（上海天能科技有限公司）；GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Mini-protein電泳儀（美國Bio-Rad公司）；1510全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；LA850酸度計(jì)（德國SCHOTT集團(tuán)）；TS-1000脫色搖床（海門市其林貝爾儀器公司）；R8-1渦旋混合器（中國北京吳諾斯科技有限公司）；HF90細(xì)胞培養(yǎng)箱（中國Heal Force生物醫(yī)療科技控股有限公司）；培養(yǎng)基抽濾器（美國Nalgene公司）；Beckaman MICR OLUGE16小型臺(tái)式離心機(jī)（美國Beckman Coulter有限公司）；XDS-1R倒置顯微鏡（意大利Optika公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海醫(yī)療設(shè)備廠）；Ultra pure plus 12-A純水儀（上海和泰儀器公司）。

1.2細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HCT8/ADR及母本細(xì)胞株HCT8由中科院上海藥物所丁健研究員贈(zèng)予。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37°C的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。

1.3雙氫青蒿素和阿霉素聯(lián)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測(cè)定雙氫青蒿素和阿霉素聯(lián)用的抗腫瘤增殖能力。消化、收集對(duì)數(shù)生長期的HCT8/ADR細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組為阿霉素組、雙氫青蒿素組、阿霉素和雙氫青蒿素聯(lián)用組，共計(jì)3組，另設(shè)空白對(duì)照組。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案加入相應(yīng)濃度的藥物，濃度如下：阿霉素組為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L；雙氫青蒿素組為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/L；阿霉素和雙氫青蒿素聯(lián)用組分別固定雙氫青蒿素濃度為5 mg/L和10 mg/L，阿霉素濃度依次為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mg/L；每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。48 h后，向每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO。震蕩1 min，在490 nm下測(cè)定吸光度（D）值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：p細(xì)胞存活（%）= D實(shí)驗(yàn)組/D對(duì)照組×100%。

1.4雙氫青蒿素和阿霉素聯(lián)用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

采用Annexin V/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡率。取對(duì)數(shù)生長期的HCT8/ADR細(xì)胞種于12孔板中，細(xì)胞密度為5×104/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為阿霉素、雙氫青蒿素、阿霉素和雙氫青蒿素聯(lián)用3組，另設(shè)立空白對(duì)照組。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案加入相應(yīng)濃度的藥物，濃度如下：阿霉素組分別為0.05、0.1 mg/L；雙氫青蒿素組10 mg/L；阿霉素和雙氫青蒿素聯(lián)用組固定雙氫青蒿素濃度為10 mg/L，阿霉素濃度分別為0.05、0.1 mg/L。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。棄去培養(yǎng)基，加入含不同樣品的含體積分?jǐn)?shù)10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔0.5 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化，離心收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，分別加入Annexin V-FITC 和PI染色液，在30 min內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.5微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3-II）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin D1）的檢測(cè)采用Western blot方法，檢測(cè)相關(guān)蛋白在HCT8/ADR上的表達(dá)情況。各組藥物濃度分別為雙氫青蒿素10 mg/L，阿霉素0.1 mg/L，雙氫青蒿素10 mg/L+阿霉素0.1 mg/L。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。給藥48 h后，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，置于冰上，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液裂解破碎細(xì)胞，4°C裂解30 min。4°C、12 000 r/min離心10 min，吸取上清，采用BCA定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在樣品中加入緩沖液，煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性，采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）分離，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行非特異性封閉，加入LC3、Cyclin D1抗體4°C孵育過夜，然后用含有體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫20的三（羥甲基）氨基甲烷—鹽酸（Tris-HCl）緩沖鹽溶液洗3次，加入二抗孵育1 h。顯色，洗膜后，成像檢測(cè)。采用Image J2軟件進(jìn)行圖片灰度分析，對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用Origin 9.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)（Student's t test）分析組間差異。

2　結(jié)果

2.1雙氫青蒿素和阿霉素聯(lián)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制結(jié)果在HCT8/ADR細(xì)胞中，單獨(dú)使用阿霉素或者雙氫青蒿素時(shí)，即使在高濃度（10 mg/L），細(xì)胞存活率仍維持在80%以上（圖1）；而當(dāng)雙氫青蒿素以5 mg/L的濃度與阿霉素聯(lián)合使用時(shí)，實(shí)驗(yàn)組在阿霉素濃度為 1.5 mg/L時(shí)就可以將細(xì)胞存活率降到50%。如果進(jìn)一步將雙氫青蒿素的給藥量增至10 mg/L，細(xì)胞存活率在阿霉素濃度為0.05 mg/L時(shí)即可降至50%以下（圖2）。高濃度（10 mg/ L）與低濃度（5 mg/L）雙氫青蒿素處理組的細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明雙氫青蒿素可以增強(qiáng)化療藥物對(duì)耐藥細(xì)胞的毒性。

圖1　不同濃度雙氫青蒿素和阿霉素對(duì)HCT8/ADR的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 1　Cytotoxicity test of HCT8/ADR treated with the same concentration of DOX or DHA?。ā纒，N=6）

2.2細(xì)胞凋亡結(jié)果正常的活細(xì)胞（Q4區(qū)，左下）不能被Annexin V-FITC和PI染色，凋亡晚期細(xì)胞（Q2區(qū)，右上）可以同時(shí)被Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色，而凋亡早期細(xì)胞（Q3區(qū)，右下）僅能被Annexin V-FITC染色。圖3結(jié)果顯示：在相同阿霉素濃度（0.05 mg/L）下，聯(lián)合用藥組發(fā)生早期和晚期凋亡的細(xì)胞比例為25.54%，游離阿霉素組僅為4.15%，聯(lián)合用藥組與DOX組、DHA組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。如果進(jìn)一步增加阿霉素濃度（0.1 mg/L），則聯(lián)合用藥組的凋亡細(xì)胞比例上升至42%，游離阿霉素組僅為6.29%。圖4結(jié)果表明：聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡比例與單藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），表明聯(lián)合用藥組能顯著引起耐藥細(xì)胞HCT8/ADR的細(xì)胞凋亡。

圖2　聯(lián)合用藥對(duì)HCT8/ADR的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 2　Cytotoxicity test of HCT8/ADR treated with DOX combined with 5 or 10 mg/L DHA?。ā纒，N=6）

2.3各組自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)圖5、圖6結(jié)果顯示：48 h后阿霉素組HCT8/ADR細(xì)胞的LC3-Ⅱ表達(dá)量與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；雙氫青蒿素組和聯(lián)合給藥組LC3-Ⅱ表達(dá)量均上調(diào)，但聯(lián)合給藥組LC3-Ⅱ的表達(dá)顯著增高（P ＜0.01），自噬活性最高。雙氫青蒿素組和聯(lián)合給藥組可顯著抑制Cyclin D1表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），這也從另一方面證實(shí)了雙氫青蒿素可以促進(jìn)耐藥細(xì)胞的自噬。

3　討論

近年來，通過大量研究證實(shí)，聯(lián)合用藥可以在抗腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，其通過把不同殺傷作用機(jī)制的抗腫瘤藥物（或治療方法）聯(lián)合起來通過協(xié)同作用把較微弱的死亡信號(hào)放大，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒藥物的耐藥性，增強(qiáng)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤的殺傷作用，確保發(fā)生有效的細(xì)胞凋亡［9］。因此，抗腫瘤藥物聯(lián)合作用可以作為一種克服單一藥物治療阻礙的有效治療策略。而且，低濃度藥物的聯(lián)合作用對(duì)于臨床治療更具有可行性，可以減輕毒副作用、改善患者體質(zhì)、延長壽命和改善生活質(zhì)量［10］?？朔[瘤耐藥性的治療策略已從最初的單一用藥向聯(lián)合用藥方向轉(zhuǎn)變，從機(jī)制的互補(bǔ)、作用的協(xié)同、不良反應(yīng)的減輕等方面發(fā)揮作用。

圖3　各組HCT8/ADR細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖Figure 3　The cell apoptosis test in HCT8/ADR

圖4　各組處理后凋亡細(xì)胞比例比較Figure 4　The apoptotic rate of each group after treatment with DOX，DHA and their combination　（±s，N=3）

圖5　各組LC3和Cyclin D1表達(dá)凝膠電泳圖Figure 5　LC3 and Cyclin D1 protein expression in HCT8/ ADR cells detected by gel electrophoresis

圖6　各組LC3和Cyclin D1的表達(dá)半定量分析結(jié)果比較Figure 6　Semi-quantitative analysis of LC3-Ⅱand Cyclin D1 protein expression in HCT8/ADR cells after treatment?。ā纒，N=3）

LC3是參與自噬泡形成的重要蛋白，分為I型和II型。細(xì)胞中新合成的LC3經(jīng)過加工，成為胞漿可溶性LC3-I。LC3-I經(jīng)泛素化加工修飾，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-II，這一進(jìn)程是自噬過程中必不可少的階段。因此，LC3-II是自噬發(fā)生的特異性標(biāo)記蛋白，LC3-II的含量及LC3-II與LC3-I的比例可標(biāo)志自噬體的數(shù)量和自噬發(fā)生的程度［11］。

真核細(xì)胞的分裂周期遵循G1-S-G2-M演變規(guī)律，細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1在細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，決定細(xì)胞是否進(jìn)入分裂周期和繼續(xù)增殖，是細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)分子。目前已在一些人類癌癥細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Cyclin D1的過度表達(dá)［12］。Cyclin D1能夠通過泛素化降解［13］；細(xì)胞內(nèi)另一個(gè)重要的降解機(jī)制是自噬，自噬也同樣會(huì)引起Cyclin D1的降解［14］。因而，將自噬作為治療靶點(diǎn)是克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的一個(gè)重要策略。

近年來，對(duì)自噬在腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制中的作用研究有著2種截然不同的觀點(diǎn)。一部分研究發(fā)現(xiàn)激活自噬能夠引起化療耐受，作為一種保護(hù)機(jī)制對(duì)腫瘤細(xì)胞起到保護(hù)作用［15-17］。但另有文獻(xiàn)報(bào)道自噬有助于化療增敏，例如，Lee等［18］報(bào)道組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA通過誘導(dǎo)自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡而殺傷耐藥乳腺癌細(xì)胞；Yang等［19］則發(fā)現(xiàn)一種ATP競(jìng)爭(zhēng)性的PI3K/mTOR抑制劑類新藥NVP-BEZ235通過直接激活自噬和阻滯細(xì)胞周期殺傷對(duì)順鉑耐藥的尿路上皮癌細(xì)胞；伊馬替尼可通過增強(qiáng)自噬逆轉(zhuǎn)卡波濟(jì)氏肉瘤對(duì)阿霉素的耐藥性［20］。因此，將自噬作為治療靶點(diǎn)是克服腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的一個(gè)重要策略。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡對(duì)多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用［21-23］；青蒿素的衍生物也能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性［24-25］。本研究結(jié)果顯示：聯(lián)合雙氫青蒿素和阿霉素處理耐藥細(xì)胞促進(jìn)了細(xì)胞凋亡；檢測(cè)各處理組細(xì)胞的自噬水平后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合給藥組LC3-II的蛋白表達(dá)量顯著增高，而Cyclin D1的表達(dá)量顯著降低。通過細(xì)胞毒性和凋亡實(shí)驗(yàn)證明了雙氫青蒿素可以通過增強(qiáng)自噬的方式恢復(fù)人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞HCT8/ADR對(duì)阿霉素的敏感性，具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。這為臨床治療多藥耐藥腫瘤提供了一個(gè)新的研究方向。

［1］Ganoth A，Merimi K C，Peer D.Overcoming multidrug resistance with nanomedicines［J］.Expert Opin Drug Deliv，2015，12（2）：223.

［2］Chen Z，Shi T，Zhang L，et al.Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette（ABC）family in multidrug resistance：A review of the past decade［J］.Cancer Lett，2016，370（1）：153.

［3］O'Grady S，F(xiàn)inn S P，Cuffe S， et al.The role of DNA repair pathways in cisplatin resistant lung cancer［J］.Cancer Treat Rev，2014，40（10）：1161.

［4］Beljanski V，Chiang C，Hiscott J.The intersection between viral oncolysis，drug resistance and autophagy［J］.BiolChem，2015，396 （12）：1269.

［5］Giussani P，Tringali C，Riboni L，et al.Sphingolipids：key regulatorsofapoptosisandpivotalplayersincancerdrug resistance［J］.Int J Mol Sci，2014，15（3）：4356.

［6］KakuruA，JagannathanP，MuhindoMK，etal，Dihydroartemisinin-piperaquine for the prevention of malaria in pregnancy［J］.N Engl J Med，2016，374（10）：928.

［7］Leang R，Taylor W R，Bouth D M，et al.Evidence of plasmodiumfalciparummalariamultidrugresistancetoartemisininand piperaquine in Western Cambodia：dihydroartemisinin-piperaquine open-label multicenter clinical assessment［J］.Antimicrob Agents Chemother，2015，59（8）：4719.

［8］Zhang X G，Li G X，Zhao S S，et al.A review of dihydroartemisinin as another gift from traditional Chinese medicine not only for malaria control but also for schistosomiasis control［J］.Parasitol Res，2014，113（5）：1769.

［9］Khdair A，Chen D，Patil Y，et al.Nanoparticle-mediated combination chemotherapy and photodynamic therapy overcomes tumor drug resistance［J］.J Control Release，2010，141（2）：137.

［10］Ardizzoni A，Grossi F，Scolaro T，et al.Induction chemotherapy followed by concurrent standard radiotherapy and daily low-dose cisplatin in locally advanced non-small-cell lung cancer［J］.Brit J Cancer，1999，81（2）：310.

［11］Klionsky D J，Abdalla F C，Abeliovich H，et al.Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy［J］. Autophagy，2012，8（4）：445.

［12］Fusté N P，Castelblanco E，F(xiàn)elip I，et al.Characterization of cytoplasmic cyclin D1 as a marker of invasiveness in cancer［J］. Oncotarget，2016，7（9）：26979.

［13］Diehl J A，Zindy F，Sherr C J.Inhibition of cyclin D1 phosphorylation on threonine-286 prevents its rapid degradation via the ubiquitin-proteasome pathway［J］.Genes Dev，1997，11 （8）：957.

［14］Cao Y，Zhang A，Cai J，et al.Autophagy regulates the cell cycle of murine HSPCs in a nutrient-dependent manner［J］.Exp Hematol，2015，43（3）：229.

［15］Chen S，Zhu X，Qiao H，et al.Protective autophagy promotes the resistance of HER2-positive breast cancer cells to lapatinib ［J］.Tumour Biol，2016，37（2）：2321.

［16］Su Y C，Davuluri G V，Chen C H，et al.Galectin-1-induced autophagyfacilitatescisplatinresistanceofhepatocellular carcinoma［J］.PLoS One，2016，11（2）：e0148408.

［17］ Cheong J W，Kim Y，Eom J I，et al.Enhanced autophagy in cytarabine arabinoside resistant U937 leukemia cells and its potential as a target for overcoming resistance［J］.Mol Med Rep，2016，13（4）：3433.

［18］Lee Y J，Won A J，Lee J，et al.Molecular mechanism of SAHA on regulation of autophagic cell death in tamoxifenresistant MCF-7 breast cancer cells［J］.Int J Med Sci，2012，9 （10）：881.

［19］Yang F，Qian X J，Qin W，et al.Dual phosphoinositide 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor NVP-BEZ235 hasatherapeuticpotentialandsensitizescisplatinin nasopharyngeal carcinoma［J］.PLoS One，2013，8（3）：e59879.

［20］Basciani S，Vona R，Matarrese P，et al.Imatinib interferes with survival of multidrug resistant Kaposi's sarcoma cells［J］. FEBS Lett，2007，581（30）：5897.

［21］ Lucibello M，Adanti S，Antelmi E，et al.Phospho-TCTP as a therapeutic target of Dihydroartemisinin for aggressive breast cancer cells［J］.Oncotarget，2015，6（7）：5275.

［22］Hu C J，Zhou L，Cai Y.Dihydroartemisinin induces apoptosis of cervicalcancercellsviaupregulationofRKIPand downregulation of bcl-2［J］.Cancer Biol Ther，2014，15（3）：279.

［23］ Lu M，Sun L，Zhou J，et al.Dihydroartemisinin induces apoptosis in colorectal cancer cells through the mitochondriadependent pathway［J］.Tumour Biol，2014，35（6）：5307.

［24］ Luo J，Chen X，Chen G，et al.Dihydroartemisinin induces radiosensitivity in cervical cancer cells by modulating cell cycle progression［J］.Saudi Med J，2013，34（3）：254.

［25］ZhaoY，JiangW，LiB，etal.Artesunateenhances radiosensitivity of human non-small cell lung cancer A549 cells via increasing NO production to induce cell cycle arrest at G2/M phase［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（12）：2039.

【責(zé)任編輯：黃玲】

Reversal of Multidrug Resistance of Human Colon Cancer Cells by Dihydroartemisin

TAO Pengyu1，2，SHI Mingjie1，HUANG Yongzhuo1，WANG Huiyuan1，XU Qin2
（1.Shanghai Medicine Institute of Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203，China；2.Tropical Medicine Institute，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

Objective To investigate the multidrug-resistance reversal action and mechanism of dihydroartemisin （DHA）on human colon cancer cell line HCT8/ADR.Methods The cytotoxicity of dihydroartemisin combined with doxorubicin（DOX）was determined by methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay and cell apoptosis was observed by flow cytometry.Western blot assay was used to measure the autophagy.Results The combined treatment with dihydroartemisin and doxorubicin significantly enhanced the cytotoxicity in HCT8/ADR cells and effectively increased the apoptotic level.Autophagy was also induced by the combined treatment，which maybe played a crucial role in the regulation of doxorubicin-sensitization of HCT8/ADR cells.Conclusion The results indicated that dihydroartemisin can reverse multidrug resistance through increasing the doxorubicin-sensitivity of HCT8/ADR cells.

dihydroartemisin；colonic cancer/TCM-WM therapy；multidrug resistance；autophagy；cell culture；apoptosis

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0698-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.05.019

2016-05-01

陶鵬宇（1989-），男，碩士研究生；E-mail:1120821481@qq.com

王慧媛（1985-），女，副研究員；E-mail:wanghuiyuan@simm.ac.cn；徐勤（1963-），男，教授；E-mail:xuqin@163.com

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào):81402883）；中國科學(xué)院設(shè)備研制項(xiàng)目（編號(hào):YZ201437）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào): 2015A040404042）