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    甲氨蝶呤溫敏凝膠的處方優(yōu)化與體外釋藥特性研究

    2016-09-23 01:20:56季可非熊康萍周萌萌
    中國藥房 2016年22期
    關(guān)鍵詞:溫敏共聚物膠凝

    季可非,劉 宏,郭 敏,熊康萍,周萌萌,郭 偲

    (1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢 430070;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢 430065)

    甲氨蝶呤溫敏凝膠的處方優(yōu)化與體外釋藥特性研究

    季可非1,2*,劉宏1#,郭敏1,2,熊康萍1,2,周萌萌1,2,郭偲1,2

    (1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科,武漢430070;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢430065)

    目的:優(yōu)化甲氨蝶呤溫敏凝膠的處方,并研究其體外釋藥特性。方法:以聚乳酸-羥基乙酸共聚物/聚乙二醇/聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA-PEG-PLGA)為基質(zhì),以甘露醇為黏度調(diào)節(jié)劑,制備甲氨蝶呤溫敏凝膠。以膠凝溫度與35℃偏差的絕對值為指標(biāo),以PLGA-PEG-PLGA、甲氨蝶呤及甘露醇的濃度為因素,通過正交試驗優(yōu)化其處方。采用透析袋法考察甲氨蝶呤溫敏凝膠和甲氨蝶呤溶液的體外累積釋放度。結(jié)果:最優(yōu)處方為PLGA-PEG-PLGA濃度20%、甲氨蝶呤0.10%、甘露醇0.10%。所制備的3批甲氨蝶呤溫敏凝膠的膠凝溫度分別為35.1、35.0、35.0℃,平均載藥率均達(dá)90%以上,12 d的累積釋放度達(dá)90%以上(r=3),而甲氨蝶呤溶液240 h時已基本釋放完全。結(jié)論:成功制得具有緩釋作用的甲氨蝶呤溫敏凝膠,且工藝簡單可行。

    聚乳酸-羥基乙酸共聚物/聚乙二醇/聚乳酸-羥基乙酸共聚物;甲氨蝶呤;溫敏凝膠;正交設(shè)計試驗;體外釋藥

    甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)為廣譜的抗代謝類抗腫瘤藥,臨床上也用于急性白血病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)等的治療,并已作為RA治療的首選藥物之一[1]。MTX早期用于治療RA時多為口服給藥,一方面抑制中性粒細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用,另一方面抑制免疫系統(tǒng)的活性以進行免疫調(diào)節(jié),兩者產(chǎn)生協(xié)同作用最終使得關(guān)節(jié)滑膜組織胺含量減少而改善患者癥狀。然而,RA作為一種慢性免疫性疾病,需長期給藥,很多患者因為MTX嚴(yán)重的副作用不得不停藥。為解決此難題,自20世紀(jì)70年代起MTX開始被用于關(guān)節(jié)腔注射,旨在發(fā)揮較好的局部作用、迅速起效,但MTX從關(guān)節(jié)腔清除速度快,關(guān)節(jié)腔注射MTX注射液可認(rèn)為是無效的[2],且易滲漏而引起全身吸收。長期、頻繁地注射給藥也降低了患者的依從性,甚至造成關(guān)節(jié)感染。因此近年來,用于關(guān)節(jié)腔注射的MTX緩釋體系逐漸受到人們的重視。

    當(dāng)前已有學(xué)者采用左旋聚乳酸(PLLA)[3]、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)[4]為載體制備關(guān)節(jié)腔注射用緩釋微球,但微球制劑往往存在嚴(yán)重的突釋現(xiàn)象,且注射初期會產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng),炎癥的產(chǎn)生是否與微球的粒徑等因素有關(guān)尚不明確。

    PLGA-聚乙二醇-PLGA(PLGA-PEG-PLGA)為一類能響應(yīng)溫度變化且對難溶藥物具有增溶作用的兩親性嵌段共聚物[5],即在低溫下為可自由流動的液體,而達(dá)到相變溫度時由于聚合物鏈中親水段的氫鍵作用減弱,分子結(jié)構(gòu)收縮而導(dǎo)致水分子被擠出,凝膠相變?yōu)榘牍腆w狀。本研究選用PLGAPEG-PLGA為載體,采用物理混合法,制備可供關(guān)節(jié)腔注射的MTX溫敏凝膠,并研究了其體外釋放特性。

    1 材料

    1.1儀器

    1200型高效液相色譜儀、1314B型可變波長紫外檢測器(美國Agilent公司);AB204-N型電子天平(德國Sartorius公司)。

    1.2藥品與試劑

    MTX對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:100138-201104,純度:99.4%);注射用MTX(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號:14070415,規(guī)格:每支0.1 g);甘露醇、氯化鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號:20121211、20120416);PLGAPEG-PLGA[濟南岱罡生物技術(shù)有限公司,丙交酯(LA)-乙交酯(GA)比例:75∶25];甲醇為色譜純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1MTX溫敏凝膠的制備

    精密稱取適量PLGA-PEG-PLGA于燒杯中,滴加蒸餾水至10 ml,于冰浴中磁力攪拌至完全溶脹,形成澄清且可自由流動的聚合物溶液。加入適量MTX、黏度調(diào)節(jié)劑甘露醇、等滲調(diào)節(jié)劑氯化鈉0.09 g于上述溶液中,反復(fù)攪拌使溶解均勻后,置于4℃冰箱中過夜,待形成顏色均一的黃色澄明溶液后用0.45 μm微孔濾膜過濾[6]。將制得的凝膠置于西林瓶中,采用60Co輻射滅菌法(6 kGy)滅菌,即制得MTX溫敏凝膠。

    2.2膠凝溫度的測定

    通過倒置試管法測定MTX溫敏凝膠的膠凝溫度[7]。分別取不同質(zhì)量濃度的MTX溫敏凝膠3 ml于試管中,插入溫度計,將試管置于水浴鍋中,緩慢升溫。每升高1℃后維持該溫度5 min,倒置試管,若凝膠由流動狀態(tài)變?yōu)椴涣鲃訝顟B(tài)即為膠凝,記錄此時的溫度。平行測定3組,取平均值。

    2.3單因素試驗優(yōu)化處方

    2.3.1PLGA-PEG-PLGA對膠凝溫度的影響按“2.1”項下方法分別制備PLGA-PEG-PLGA濃度為18%、20%、25%(g/ml)的MTX溫敏凝膠,分別照“2.2”項下方法測定其膠凝溫度。結(jié)果顯示,隨著PLGA-PEG-PLGA濃度的增加,MTX溫敏凝膠的凝膠溫度呈下降趨勢(36.1~33.3℃)。

    2.3.2氯化鈉對膠凝溫度的影響為使MTX溫敏凝膠更適宜關(guān)節(jié)腔注射給藥,本研究在凝膠中加入等滲調(diào)節(jié)劑氯化鈉。當(dāng)其他各組分含量不變時,使氯化鈉濃度由0增加至0.9%(g/ml),考察MTX溫敏凝膠膠凝溫度的變化。結(jié)果顯示,隨著氯化鈉濃度的增加,膠凝溫度略有降低,但下降程度不具有顯著差異(P>0.05,數(shù)據(jù)略)。故選擇常用的0.9%的氯化鈉作為等滲調(diào)節(jié)劑。

    2.3.3甘露醇對膠凝溫度的影響[8]按“2.1”項下方法分別制備甘露醇濃度由0增加至0.50%(g/ml)的MTX溫敏凝膠,分別測定其膠凝溫度。結(jié)果顯示,隨著甘露醇濃度的增加,膠凝溫度有所上升(33.3~37.0℃)。

    2.4正交設(shè)計試驗優(yōu)化處方

    本試驗參考臨床中MTX用于關(guān)節(jié)腔注射的常用治療劑量[9],選取了高、中、低3個濃度(0.30%、0.20%、0.10%),以考察MTX濃度對膠凝溫度的影響。另外,根據(jù)單因素試驗結(jié)果,以0.9%的氯化鈉為等滲調(diào)節(jié)劑,以PLGA-PEG-PLGA (A,%)、MTX(B,%)和甘露醇(C,%)的用量為考察因素,為滿足MTX溫敏凝膠在關(guān)節(jié)腔注射后可在關(guān)節(jié)腔內(nèi)迅速形成原位凝膠,選取膠凝溫度稍低于人體體溫(37℃)的35℃(預(yù)試驗表明,35℃下凝膠膠凝時間較短,同時在注射過程中不會發(fā)生膠凝)為最優(yōu)溫度,以測得的膠凝溫度與35℃的偏差(|T-35|)為指標(biāo),偏差越小越好。每個因素選取3個水平,按L9(33)正交表進行試驗[10]。因素與水平見表1,正交設(shè)計試驗結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

    表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

    表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

    表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

    由表2可知,各因素對膠凝溫度的影響順序為A>C>B。由表3可知,因素A即聚合物濃度對膠凝溫度有顯著影響(P<0.05)。綜合考慮,最優(yōu)處方為A2B1C1,即PLGA-PEG-PLGA為20%,MTX為0.10%,甘露醇為0.10%。按最優(yōu)處方制備3批樣品,測定其膠凝溫度分別為35.1、35.0、35.0℃。

    2.5體外釋藥特性考察

    2.5.1釋放條件的選擇根據(jù)關(guān)節(jié)腔內(nèi)環(huán)境及組成,在37℃恒溫空氣振蕩浴中進行MTX溫敏凝膠的體外釋放試驗;由于MTX在純水中溶解性較差,而在磷酸鹽緩沖液(PBS,pH為7.4)中可充分溶解,且溶解度滿足漏槽條件,所以釋放介質(zhì)選為PBS(pH 7.4);轉(zhuǎn)速為75 r/min。

    2.5.2檢測波長的選擇按“2.1”項下方法制備空白聚合物凝膠,將MTX與空白聚合物凝膠分別溶解于釋放介質(zhì)中,超聲5 min,0.45 μm微孔濾膜過濾,取濾液在180~400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示,MTX在303 nm波長處有最大吸收,且輔料對其吸收無影響,故檢測波長確定為303 nm。

    2.5.3方法學(xué)考察采用高效液相色譜法測定MTX的含量。色譜柱為依利特C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇-磷酸二氫鈉(10 mmol/L)(25∶75),流速為1.0 ml/min,檢測波長為303 nm,進樣量為20 μl,柱溫為40℃[5]。按相關(guān)方法學(xué)考察,結(jié)果顯示,MTX峰面積(A)對其質(zhì)量濃度(c)進行回歸分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=845 680c+122 337(r=0.999 8,n=5),線性范圍為0.25~160 μg/ml;100、60、40 μg/ml MTX標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率分別為(99.85±0.58)%、(99.62±0.44)%、(99.85± 0.28)%,日內(nèi)RSD分別為0.68%、0.82%、0.56%,日間RSD分別為0.88%、0.96%、1.12%;在轉(zhuǎn)速75 r/min的37℃恒溫空氣振蕩浴中放置14 d,MTX的含量無明顯變化,符合方法學(xué)要求。

    2.5.4累積釋放度考察取按“2.4”項下篩選的最優(yōu)處方制備的MTX溫敏凝膠和MTX溶液(PBS,pH 7.4)各1 ml,置于經(jīng)預(yù)處理過的透析袋內(nèi),放入潔凈的試管中,置于37℃恒溫空氣振蕩浴中,待其完全膠凝后加入30 ml釋放介質(zhì)??刂茰囟仍冢?7±1)℃,轉(zhuǎn)速為75 r/min,分別于0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、336 h取出2 ml釋放液并補充等量新鮮介質(zhì),輕輕搖勻。將取出的釋放液用流動相稀釋,并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后按“2.5.3”項下色譜條件進樣測定MTX含量,計算累積釋放度,繪制釋放曲線。MTX溫敏凝膠和MTX溶液的釋放曲線見圖1。

    圖1MTX溫敏凝膠和MTX溶液的釋放曲線Fig 1 Release curve of MTX thermosensitive hydrogel and MTX solution

    圖1結(jié)果表明,最優(yōu)處方的MTX溫敏凝膠可持續(xù)釋放藥物12 d(288 h)左右,且釋放度可達(dá)90%以上。

    2.6載藥量的測定

    按最優(yōu)處方制備3批樣品,精密量取1 ml,置于100 ml量瓶中,用PBS(pH 7.4)稀釋,超聲至完全溶解。取適量用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液進樣測定MTX含量,計算載藥量[載藥量(%)=MTX含量/凝膠總質(zhì)量×100%]。結(jié)果顯示,3 批MTX溫敏凝膠的載藥量分別為(91.59±0.54)%、(91.83± 0.35)%、(92.37±0.63)%。

    3 討論

    本文采用PLGA-PEG-PLGA為凝膠基質(zhì)制備的溫敏凝膠在室溫及低于室溫時為可自由流動的液體,而注射進入關(guān)節(jié)腔后可因環(huán)境溫度的升高而在注射部位發(fā)生相變形成半固體的凝膠狀,使藥物儲庫在關(guān)節(jié)腔得以緩慢釋放藥物。且該PLGA-PEG-PLGA共聚物為醫(yī)用材料,在體內(nèi)降解后產(chǎn)生乳酸、羥基乙酸和PEG,其中酸性產(chǎn)物二氧化碳和水通過體內(nèi)代謝吸收,而PEG則經(jīng)腎臟排泄[11],生物相容性良好。

    有研究表明,難溶性藥物如吲哚美辛[12]在PLGA-PEGPLGA中的溶解度與水中的溶解度相比有明顯增加。這是由于該共聚物在水溶液中將形成以親水鏈為外殼、疏水鏈為內(nèi)核的球狀膠束,將疏水性藥物包裹在內(nèi),提高了疏水性藥物在共聚物溶液中的溶解度。MTX在水中幾乎不溶,溶解度<1 mg/ml(19℃),而在稀酸、稀堿溶液中易溶,筆者采用PLGAPEG-PLGA作為凝膠載體,使制劑中MTX含量達(dá)到1 mg/ml。預(yù)試驗表明制得的聚合物溶液pH為5.2,符合注射劑的質(zhì)量要求,且可對MTX實現(xiàn)良好的增溶作用,制得的MTX溫敏凝膠載藥量可達(dá)90%以上;同時避免了有機溶劑的使用,降低了該劑型的毒副作用。

    由于PLGA-PEG-PLGA的膠凝溫度為35℃左右,常用的注射劑滅菌方法如熱壓滅菌法會使該載體材料變性,故本研究選用60Co輻射滅菌法滅菌。該法可在常溫下進行,且穿透力強,滅菌前后制劑的膠凝溫度、載藥量及體外釋放度均無顯著性差異,為該制劑的生產(chǎn)及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    [1]Song X,Liang F,Liu N,et al.Construction and characterization of a novel DNA vaccine that is potent antigen-specific tolerizing therapy for experimental arthritis by increasing CD4+CD25+Treg cells and inducing Th1 to Th2 shift in both cells and cytokines[J].Vaccine,2009,27(5):690.

    [2]Wigginton S,Chu BC,Weisman MH,et al.Methotrexate pharmacokinetics after intraarticular injection in patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,1980,23(1):119.

    [3]Liang LS,Jackson J,Min W,et al.Methotrexate loaded poly(L-lactic acid)microspheres for intra-articular delivery of methotrexate to the joint[J].J Pharm Sci,2004,93 (4):943.

    [4]莫麗都爾,陳漢,李學(xué)敏,等.關(guān)節(jié)腔注射用MTX緩釋微球的制備及體內(nèi)外釋藥研究[J].中國新藥雜志,2007,16 (15):1 187.

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    (編輯:鄒麗娟)

    Formulation Optimization and in vitro Release Property Study of Methotrexate Thermosensitive Hydrogels

    JI Kefei1,2,LIU Hong1,GUO Min1,2,XIONG Kangping1,2,ZHOU Mengmeng1,2,GUO Si1,2
    (1.Dept.of Pharmacy,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command,Wuhan 430070,China;2.College of Pharmacy,Hubei University of Traditional Chinese Medicine,Wuhan 430065,China)

    OBJECTIVE:To optimize the formulation of Methotrexate thermosensitive hydrogels,and to study the in vitro release property of it.METHODS:Taking PLGA-PEG-PLGA as matrix and mannitol as viscosity modifiers,Methotrexate thermosensitive hydrogels were prepared.Using the absolute value of the deviation of gelation temperature between 35℃,its formulation was optimized by orthogonal test using the concentrations of PLGA-PEG-PLGA,methotrexate and mannitol as factors.The dialysis bag method was used to investigate accumulative release rate of Methotrexate thermosensitive hydrogels and methotrexate solution within 336 h in vitro.RESULTS:The optimal formulation was as PLGA-PEG-PLGA of 20%,methotrexate of 0.10%and mannitol of 0.10%;gelation temperature were 35.1,35.0,35.0℃.The average drug-loading rate was more than 90%.12 d accumulative release rate was more than 90%(r=3).Methotrexate solution has been substantially completely relased within 240 h.CONCLUSIONS:Methotrexate thermosensitive hydrogels with sustained-release are prepared successfully,and the preparation technology is simple and practical.

    PLGA-PEG-PLGA;Methotrexate;Thermosensitive hydrogel;Orthogonal test;in vitro release

    R943;R927.1

    A

    1001-0408(2016)22-3136-03

    10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.33

    *碩士研究生。研究方向:藥物新制劑、新劑型和新技術(shù)。E-mail:393852596@qq.com

    主任藥師,博士。研究方向:藥物新制劑、新劑型和新技術(shù)。電話:027-68878601。E-mail:honguil@163.com

    2015-08-20

    2015-10-12)

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