復方芪麻膠囊的提取工藝研究

王洛臨，吳小斌，周　蓉，張建軍，袁柳萍

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州　510095；2.廣州中醫(yī)藥大學附屬廣東省第二中醫(yī)院，廣州　510405；3.麗珠集團利民制藥廠，廣東韶關(guān)　512000）

復方芪麻膠囊的提取工藝研究

王洛臨1＊，吳小斌2，周蓉3，張建軍1，袁柳萍2

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學附屬廣東省第二中醫(yī)院，廣州510405；3.麗珠集團利民制藥廠，廣東韶關(guān)512000）

目的：優(yōu)化復方芪麻膠囊的提取工藝。方法：采用藥效實驗法，以大鼠血壓降低值為指標，篩選樣品制備工藝（A工藝為藥材全煎；B工藝為天麻細粉與其余煎煮后藥材混合）；采用單因素和正交試驗法，以黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量和固形物質(zhì)量為指標，以加水倍數(shù)、煎煮時間、煎煮次數(shù)為因素優(yōu)化提取工藝并進行驗證試驗。結(jié)果：藥效實驗表明B工藝樣品降壓作用更優(yōu)；該工藝中其余藥材的最優(yōu)提取工藝為藥材每次加12倍量水煎煮1.5 h，共煎煮3次；驗證試驗顯示黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均提取率分別為64.02%、51.97%，平均固形物質(zhì)量為5.69 g（RSD≤1.92%，n=3）。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定、可行。

復方芪麻膠囊；降壓作用；提取工藝；黃芪甲苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；正交試驗

高血壓是最常見的慢性病，也是心腦血管病最主要的危險因素，其腦卒中、心力衰竭及慢性腎臟病等主要并發(fā)癥不僅致殘、致死率高，而且嚴重消耗醫(yī)療和社會資源。中醫(yī)將高血壓病歸結(jié)為“脈脹”“眩暈”“肝風”“風?！钡炔“Y，以氣虛痰濁型為主。復方芪麻膠囊由黃芪、天麻、橘紅等藥材組成，具有健脾益氣、化痰通絡、理氣散結(jié)的功效，臨床上用于治療氣虛痰濁型高血壓所致的眩暈、頭痛、苔白膩、脈滑等癥［1-3］。為保證制成制劑后的臨床療效，筆者先對制劑工藝路線進行優(yōu)選，再對優(yōu)選出的提取工藝的條件進行優(yōu)化。

1　材料

1.1儀器

1200高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器（德國Sincere公司）；JJ3000動物電子秤（美國G&G公司）；BS224S電子天平（德國Sartorius公司，萬分之一）；BP-100A全自動大鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；PowerLab 8/30多導生理記錄儀（澳大利亞AD Instrument公司）。

1.2藥材、藥品與試劑

黃芪（批號：140101）、天麻（批號：140901）、法半夏（批號：141201）、澤瀉（批號：141101）均購自廣州集和藥品有限公司，經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院劉法錦研究員鑒定，均符合現(xiàn)行藥典各藥材項下的規(guī)定，其中黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量分別為0.045%（g/g）和0.022%（g/g）；黃芪甲苷對照品（批號：110781-200613，純度：95.8%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：11920-201203，純度：97.3%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；水合氯醛溶液（成都市科龍化學試劑廠，批號：20120611，規(guī)格：500 ml/瓶）；依托咪酯（瑞士Adamasbeta公司，批號：P00459，純度：98.2%）；厄貝沙坦片（杭州賽諾菲民生制藥有限公司，批號：0901174，規(guī)格：0.15 g/片）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3動物

SPF級SD大鼠70只，♀♂各半，體質(zhì)量約300 g，鼠齡3個月，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：No.4407207906。

2　方法與結(jié)果

2.1制備工藝的確定

本處方中黃芪和天麻均為君藥，根據(jù)處方中藥味所含已知成分及相關(guān)藥理作用，以及天麻的習慣用法，采用降壓藥效模型進行制備工藝的篩選。

2.1.1樣品的制備 （1）樣品A的制備（工藝A）：全方藥材煎煮2次，每次加10倍水，煎煮1.5 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮成稠膏，真空干燥，制成1 g干浸膏，相當于2.775 g生藥。（2）樣品B的制備（工藝B）：方中天麻粉碎成細粉；黃芪等其余藥材煎煮2次，每次加10倍水，煎煮1.5 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮成稠膏，真空干燥；加入天麻細粉，混勻，制成1 g混合物，相當于6.989 g生藥。

2.1.2藥效對比實驗取大鼠70只，♀♂各半，隨機留取10只大鼠作為正常對照組，其余60只大鼠作為模型組。用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉模型組大鼠后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，剪去其腹部體毛，用5%碘伏消毒、75%乙醇脫碘，蓋上孔巾。沿腹正中線作手術(shù)切口打開腹腔，按無菌操作，小心鈍性分離出左腎動脈后，穿入無菌絲線，將直徑為0.25 mm的針灸針與腎動脈血管長軸緊貼、平行放置，用無菌絲線扎緊腎動脈和針灸針后抽出針灸針，造成大鼠單側(cè)腎動脈狹窄，而且不觸及側(cè)腎臟和動脈［4］。正常對照組大鼠除不結(jié)扎腎動脈外，其余手術(shù)操作均同上。術(shù)后3 d內(nèi)腹腔注射青霉素3×104u/d預防感染。造模4周后模型組大鼠再均分為6組，分別為厄貝沙坦組（陽性對照，0.027 g/kg，經(jīng)人用臨床劑量換算的等效劑量），模型對照組，樣品A高、低劑量組［7.432、1.858 g（生藥）/kg，分別相當于成人日服生藥80、20 g，其中低劑量組與臨床用藥劑量相近］，樣品B高、低劑量組［7.432、1.858 g（生藥）/kg］，每組10只，♀♂各半。正常對照組大鼠給予等體積生理鹽水。給藥方法：生理鹽水溶解藥物，每天1次，連續(xù)灌服給藥8周。測定方法：第8周末，各組大鼠末次給藥后1 h，以100 mg/kg依托咪酯水溶液腹腔注射麻醉后，分離右頸總動脈，插入注有125 u/ml肝素鈉溶液的聚乙烯導管中，通過壓力換能器連接多導生理記錄儀及生理信號處理系統(tǒng)，測量大鼠收縮壓、舒張壓。計量資料以均數(shù)±標準差表示；多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較；方差齊時采用SNK法，方差不齊時采用Dunnett's T3法。統(tǒng)計檢驗由SPSS 2.0軟件完成。大鼠血壓測定結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠血壓測定結(jié)果（±s，n=10）Tab 1　Blood pressure of rats in each group（±s，n=10）

表1　各組大鼠血壓測定結(jié)果（±s，n=10）Tab 1　Blood pressure of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.01Note：vs.normal control group，＊P＜0.01；vs.model control group，#P＜0.01

舒張壓，mmHg 74.58±4.24 113.38±12.77＊76.82±8.86#85.91±313.69#103.88±12.04 82.99±9.69#92.88±13.31#組別正常對照組模型對照組厄貝沙坦組樣品A高劑量組樣品A低劑量組樣品B高劑量組樣品B低劑量組劑量，g/kg 0.027 7.432 1.858 7.432 1.858收縮壓，mmHg 104.03±6.58 175.03±8.99＊128.64±14.58#138.94±10.65#154.80±6.54#140.28±19.57#154.41±12.41#

由表1可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠收縮壓和舒張壓顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，各藥物組收縮壓降低（P＜0.01）；從降低舒張壓的效果來看，樣品B優(yōu)于樣品A，故確定本品的制備工藝路線為工藝B，即方中除天麻粉碎入藥外，其余藥材以煎煮后提取物入藥。

2.2考察指標的測定

2.2.1固形物質(zhì)量的測定精密取煎煮后濃縮液50 ml，置于99℃水浴鍋上蒸干，在105℃下干燥至恒質(zhì)量，按照2015年版《中國藥典》干燥失重法［5］測定，計算固形物質(zhì)量。

2.2.2黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定采用HPLC法測定。

（1）色譜條件。黃芪甲苷：色譜柱為Thermo ODS Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（32∶68），流速為1.0 ml/min；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；柱溫為25℃；漂移管溫度為45℃；氮氣流速為1.5 L/min；進樣量為20 μl。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷：色譜柱為XBridgeTMC18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 minA為20%～40%，20～30 minA為40%）；流速為1.0 ml/min；二極管陣列檢測器，檢測波長為260 nm；柱溫為25℃；進樣量為10 μl。

（2）溶液的制備。對照品溶液的制備：取對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 ml含0.420 0 mg黃芪甲苷的溶液和每1 ml含0.251 8 mg毛蕊異黃酮葡萄糖苷的溶液，即得。

供試品溶液的制備：精密量取煎煮后濃縮液25 ml，照2015年版《中國藥典》（一部）黃芪項下［5］，從“用水飽和的正丁醇振搖提取4次”內(nèi)容起依法操作，制成黃芪甲苷供試品溶液。另精密量取濃縮液1 ml，置于蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷供試品溶液。

陰性對照溶液的制備：按處方比例稱取除黃芪以外的藥材112 g，煎煮2次，每次加10倍量水，煎煮1.5 h，濾過，濃縮至約250 ml，按上述供試品溶液的制備方法分別制備黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的陰性對照溶液。

（3）專屬性試驗。分別吸取2種對照品溶液、2種供試品溶液、2種陰性對照溶液進樣測定。試驗結(jié)果表明，陰性對照溶液在毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷相應位置無色譜峰出現(xiàn)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷主峰與鄰峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1、圖2。

圖1　黃芪甲苷的的高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.陰性對照溶液；C.對照品溶液；1.黃芪甲苷Fig 1　HPLC chromatograms of astragalosideA.test sample；B.negative control；C.substance control；1.stragaloside

圖2　毛蕊異黃酮葡萄糖苷的高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.陰性對照溶液；C.對照品溶液；1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷Fig 2　HPLC chromatogram of isoflavone grape glycosidesA.test sample；B.negative control；C.substance control；1.isoflavone grape glycosides

（4）標準曲線的建立。按規(guī)定方法操作，得黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的線性回歸方程分別為lny=1.487 1lnx+ 4.501 4、y=3 318.33x+31.36（r均為0.999 6，其中y為峰面積、x為質(zhì)量濃度），二者檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.840 0～8.400、0.755 4～2.014 mg/ml。

（5）靈敏度、精密度、穩(wěn)定性和準確度試驗。按相關(guān)方法進行操作，結(jié)果靈敏度試驗中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷定量限分別為0.584 1、0.675 3 μg/μl；精密度試驗中二者峰面積的RSD分別為0.61%、0.85%（n=3）；穩(wěn)定性試驗中二者含量的RSD分別為0.84%、0.91%（n=3，12 h內(nèi)）；重復性試驗中二者含量的RSD分別為0.99%、1.37%（n=3）；準確度試驗中二者加樣回收率平均值分別為99.74%、98.56%（RSD分別為1.79%、1.85%，n=3）。

2.3水煎煮提取工藝的單因素試驗

以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為評價指標，考察不同浸泡時間、加水倍數(shù)、煎煮時間以及煎煮次數(shù)對2個指標的影響。

2.3.1浸泡時間按照處方比例稱取藥材5份，每份152 g，分別浸泡不同時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h），然后加10倍量水，煎煮2次，每次提取1.5 h。

2.3.2煎煮時間按照處方比例稱取藥材5份，每份152 g，加10倍量水，煎煮2次，煎煮提取不同時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）。

2.3.3加水倍數(shù)按照處方比例稱取藥材5份，每份152 g，分別加入不同倍量（6、8、10、12、14倍）的水，煎煮2次，每次1.5 h。

2.3.4提取次數(shù)按照處方比例稱取藥材4份，每份152 g，分別加入10倍量水，分別煎煮1、2、3、4次，每次1.5 h。

分別將上述各條件下的提取液過濾，濃縮定容至250 ml，分別測定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄苷含量，結(jié)果見表2。

由二者含量結(jié)果可見，浸泡時間對各指標成分無明顯影響，故藥材提取前無需浸泡；確定正交試驗水平范圍為煎煮時間1.5～2.5 h、加水倍數(shù)8～12倍、煎煮次數(shù)1～3次。

2.4水煎煮提取工藝的正交試驗

根據(jù)單因素考察結(jié)果確定的水平范圍，以黃芪甲苷含量（X1）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量（X2）和固形物質(zhì)量（X3）為評價指標，并分別賦予權(quán)重系數(shù)為0.3、0.3、0.4，計算綜合評分值［Y，Yi=（X1i/X1max×0.3+X2i/X2max×0.3+X3i/X3max×0.4）×100］；以加水倍數(shù)、煎煮時間和煎煮次數(shù)為考察因素。按照處方比例稱取藥材9份，每份152 g，按正交試驗安排進行提取，濾過，濃縮并定容至250 ml，依法測定。因素與水平見表3、正交試驗結(jié)果見表4、方差分析結(jié)果見表5。

表2　單因素試驗考察結(jié)果Tab 2　Results of single factor test

表3　因素與水平Tab 3　Levels and factors

表4　正交試驗結(jié)果Tab 4　Results of orthogonal test

結(jié)果表明，各因素影響大小為C＞A＞B，并且C、A因素對試驗結(jié)果有顯著性影響（P＜0.05）。最終確定最優(yōu)工藝條件為A3B1C3，即藥材每次加12倍量水煎煮3次，每次1.5 h。

2.5驗證試驗

表5　方差分析結(jié)果Tab 5　Analysis results of variance

按照處方比例稱取藥材3份，每份152 g，根據(jù)優(yōu)化的提取工藝條件進行3次平行試驗，計算黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取率［（提取液體積×提取液中有效成分含量）/（處方中黃芪藥材質(zhì)量×黃芪藥材中有效成分含量）×100%］，結(jié)果見表6。

表6　驗證試驗結(jié)果Tab 6　Results of verification test

表6結(jié)果表明，黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均提取率分別為64.02%、51.97%，固形物平均值為5.69 g，其平均綜合評分值為96.54，與正交試驗最大值97.50接近，提示優(yōu)化的工藝穩(wěn)定、可行。

3　討論

黃芪為方中君藥之一，所含黃芪甲苷具有擴張血管、降低血壓、保護血腦屏障等作用［6-7］，毛蕊異黃酮葡萄糖苷具有舒張血管、保護局部缺血器官、減輕血管緊張素引起的內(nèi)皮細胞損傷等作用［8］。試驗結(jié)果表明，在最優(yōu)提取工藝條件下，黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均提取率均較高，提示該工藝條件穩(wěn)定、可行，為本制劑的下一步研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

天麻為方中君藥之一，所含化學成分有天麻素、天麻苷元、倍半萜類等。文獻報道天麻藥材有明顯的鎮(zhèn)靜、降壓、降低血管阻力等作用［9-10］，但是其作用物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。經(jīng)初步藥效學研究證實，就降血壓作用而言，天麻粉碎入藥優(yōu)于與其他藥材共煎入藥，但這是否與天麻藥材中降壓成分的脂溶性或熱不穩(wěn)定性有關(guān)，還有待進一步研究證實。

［1］黃琳，王清海，丁大珍，等.復方芪麻膠囊對高血壓病早期腎損害的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（7）：192.

［2］袁利梅，劉磊，朱培罡，等.益氣化濁法治療氣虛痰濁型單純收縮期高血壓臨床研究［J］.河南中醫(yī)，2012，32（11）：1 459.

［3］黃琳，王清海，李典鴻，等.復方芪麻膠囊對高血壓患者動態(tài)血壓的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2004，10（5）：57.

［4］楊蕾，李紅宇，宓穗卿，等.天鉤方治療腎性高血壓大鼠的實驗研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1 858.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：302、附錄ⅥB.

［6］邱勇波，劉錦，武飛.黃芪化學成分及藥理作用研究進展［J］.中國療養(yǎng)醫(yī)學，2011，20（5）：435.

［7］梁麗娟，謝俊大，趙奎君.黃芪中化學成分的比較研究進展［J］.中國藥房，2009，20（36）：2 877.

［8］李晶晶，崔國禎，王亮，等.毛蕊異黃酮對H9c2細胞缺糖缺氧損傷的保護作用［J］.中藥藥理與臨床，2014，30（5）：32.

［9］陳維紅，羅棟.天麻素、天麻多糖藥理作用研究進展［J］.中國藥物評價，2013，30（3）：132.

［10］楊超，呂紫媛，伍瑞云.天麻的化學成分與藥理機制研究進展［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2012，50（17）：27.

（編輯：劉萍）

Study on the Extraction Technology of Compound Qima Capsules

WANG Luolin1，WU Xiaobin2，ZHOU Rong3，ZHANG Jianjun1，YUAN Liuping2
（1.Guangdong Province Engineering and Technology Research Institute of Chinese Medicine/Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Research and Development，Guangzhou 510095，China；2.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3.Livzon Group Limin Pharmaceutical Factory，Guangdong Shaoguan 512000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Compound qima capsules.METHODS：With the blood pressure lowering of rats as index，pharmacological efficacy test was used to screen the preparation technology（A was whole herb decoction；B was Gastrodia elata fine powder mixed with other decocted medical materials）.The extraction technology was optimized by single factor and orthogonal test using the contents of astragaloside and isoflavone grape glycosides and the quality of solid as indexes，with added water，decoction time，decoction times as factors；and the verification test was carried out.RESULTS：Pharmacological efficacy test showed that antihypertensive effect of sample by technology B was superior.The optimal extraction condition of other medical materials of technology B was as follows as 12-fold water per time，decocting for 1.5 h，for 3 times.In verification test，average extraction rates of astragaloside and isoflavone grape glycosides were 64.02%and 51.97%，and average value of the quality of solid was 5.69 g（RSD≤1.92%，n=3）.CONCLUSIONS：The optimized extraction technology is stable and feasible.

Compound qima capsules；Antihypertensive effect；Extraction technology；Astragaloside；Isoflavone grape glycosides；Orthogonal test

R284.2；R285

A

1001-0408（2016）22-3128-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.31

＊主任中藥師，碩士生導師。研究方向：中藥制劑。電話：020-83501292。E-mail：luolin_w@163.com

2015-11-03

2016-03-02）