YAP在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

章　杰，林　義，林　雅

(浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院病理科　317500)

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YAP在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

章杰，林義，林雅

(浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院病理科317500)

目的探討Yes相關(guān)蛋白(YAP)在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。方法收集57例該院普通外科行手術(shù)切除的甲狀腺乳頭狀癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，所有患者均經(jīng)病理診斷確認(rèn)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及癌旁組織中的YAP表達(dá)，統(tǒng)計(jì)分析YAP蛋白與腫瘤臨床病理資料間的相關(guān)性。siRNA沉默甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細(xì)胞中YAP基因表達(dá)，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)沉默YAP后B-CPAP細(xì)胞增殖及凋亡水平變化。結(jié)果YAP蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(P<0.05)；且YAP蛋白表達(dá)與TNM分期和腫瘤體積呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，沉默YAP基因可顯著降低B-CPAP細(xì)胞的增殖能力，并促使細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05)。結(jié)論YAP在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)并與腫瘤不良臨床病理特征有關(guān)，下調(diào)YAP基因可顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

Yes相關(guān)蛋白；癌,乳頭狀;甲狀腺腫瘤；基因表達(dá)；細(xì)胞增殖

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中甲狀腺乳頭狀癌是其主要病理類型[1]，甲狀腺癌早期癥狀隱匿、診斷困難、易發(fā)生轉(zhuǎn)移，極大地危害廣大人民群眾的身體健康[2]。近年來(lái)大規(guī)模的流行病學(xué)研究顯示[3]，約半數(shù)以上的患者在確診一年內(nèi)死亡，而僅有5%的患者生存期超過(guò)5年。因此，對(duì)于甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)研究，對(duì)改善我國(guó)未來(lái)甲狀腺癌的診治水平具有重要意義。

Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein，YAP)定位于人類染色體11q13.1上[4]，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在細(xì)胞內(nèi)能夠調(diào)節(jié)包括SMAD(mothers against decapentaplegic protein)家族成員[5]和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)區(qū)域(transcriptional enhancer domain，TEAD)轉(zhuǎn)錄因子家族成員[6]等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的活性。近年研究發(fā)現(xiàn)，YAP對(duì)細(xì)胞增殖具有異常的促進(jìn)作用，因而將YAP定義為一種重要的促癌基因，其生物學(xué)效應(yīng)亦在許多人類惡性腫瘤中得到驗(yàn)證[7]。目前，YAP在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及對(duì)癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用尚不完全清楚。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)、基因轉(zhuǎn)染及增殖凋亡檢測(cè)等方法研究了YAP在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)情況及沉默YAP對(duì)甲狀腺乳頭狀瘤B-CPAP細(xì)胞增殖、凋亡的影響，旨在明確YAP基因在甲狀腺乳頭狀癌診斷及治療分子中的潛在臨床及生物學(xué)意義。

1　資料與方法

1.1一般資料收集57例于2011年5月至2014年2月間在本院普通外科行手術(shù)切除的甲狀腺癌患者，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為甲狀腺乳頭狀癌的組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。入組患者年齡40～71歲，平均(54.5±15.5)歲，其中男37例，女20例。標(biāo)本于離體30 min內(nèi)取材并于中性福爾馬林溶液中保存。

1.2主要試劑兔SP免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物科技有限公司。Trizol試劑及脂質(zhì)體2000(LipofectamineTM 2000)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及real time PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生生物工程有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司；YAP引物，正向5′-CCT GCG TAG CCA GTT ACC AA-3′；反向5′-CCA TCT CAT CCA CAC TGT TC-3′，β-actin引物，正向5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′；反向5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′，由上海生工生物科技有限公司合成；YAP特異性siRNA(sc-38637)及兔抗人YAP多克隆抗體(sc-17140)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3免疫組織化學(xué)石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、水化后，按SP免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。兔抗人YAP一抗工作濃度為1∶100，二抗采用生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體，DAB顯色、蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)組織視野，按文獻(xiàn)所述方法[8]進(jìn)行閱片、評(píng)分，取10個(gè)視野的平均得分作為切片的最終評(píng)分。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞B-CPAP由本實(shí)驗(yàn)室保存。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染B-CPAP細(xì)胞接種于6孔板中，參照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別向B-CPAP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染入陰性對(duì)照siRNA(陰性對(duì)照組)和YAP特異性siRNA(YAP siRNA組)，轉(zhuǎn)染結(jié)束后采用qRT-PCR法檢測(cè)YAP mRNA表達(dá)以確證轉(zhuǎn)染效果。

1.6qRT-PCR按RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)方法提取細(xì)胞中的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-△△ct法計(jì)算YAP mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7MTT檢測(cè)分別收集轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后的B-CPAP細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)進(jìn)行MTT檢測(cè)，于酶標(biāo)儀上490 nm測(cè)定各孔的吸光度(A)值。

1.8流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)取轉(zhuǎn)染72 h后的B-CPAP細(xì)胞，按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

2　結(jié)　　果

2.1甲狀腺乳頭狀癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中YAP 蛋白的表達(dá)情況通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)57例甲狀腺乳頭狀癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中YAP的表達(dá)情況。甲狀腺乳頭狀癌組織中YAP陽(yáng)性表達(dá)率為75.44%(43/57)，而癌旁組織中YAP陽(yáng)性表達(dá)率僅為33.33%(19/57)，兩者間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.367，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1　YAP蛋白在甲狀腺乳頭狀癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)(免疫組織化學(xué)×400)

2.2YAP表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征間的相關(guān)性分析癌組織中YAP蛋白的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌腫瘤體積及TNM分期呈正相關(guān)(P<0.05)，提示腫瘤中YAP蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者可能預(yù)后不良。見(jiàn)表1。

表1　　YAP 表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理 特征的關(guān)系[n]

χ2、P為各項(xiàng)目中不同分組YAP陽(yáng)性率比較所得。

2.3siRNA下調(diào)甲狀腺乳頭狀癌B-CPAP細(xì)胞中YAP的表達(dá)在B-CPAP細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入YAP特異性siRNA及陰性對(duì)照siRNA，qRT-PCR法檢測(cè)得，與陰性對(duì)照組比較，YAP siRNA組B-CPAP細(xì)胞中YAP mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

*：P<0.05，與陰性對(duì)照組比較。

圖2siRNA下調(diào)B-CPAP細(xì)胞中YAP的表達(dá)水平

2.4下調(diào)YAP的表達(dá)能抑制B-CPAP細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡于轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h后，采用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化；結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，YAP siRNA組B-CPAP細(xì)胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。為進(jìn)一步驗(yàn)證沉默YAP對(duì)細(xì)胞增殖的影響，作者使用siRNA轉(zhuǎn)染B-CPAP細(xì)胞72 h后，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化；與陰性對(duì)照組比較，YAP siRNA組可明顯增加B-CPAP細(xì)胞的細(xì)胞比例(P<0.05)見(jiàn)圖3B、C。

A：增殖曲線圖；B ：陰性對(duì)照siRNA、YAP siRNA細(xì)胞凋亡圖；C：凋亡分析圖。

圖3沉默YAP對(duì)B-CPAP細(xì)胞增殖、凋亡的影響

3　討　　論

甲狀腺癌是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤之一。目前，甲狀腺癌治療的主要方法是根治性手術(shù)及術(shù)后規(guī)范放、化療[9]，但甲狀腺癌早期癥狀不明顯，診斷困難，且易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，因此多數(shù)患者就診時(shí)已失去根治性手術(shù)機(jī)會(huì)，對(duì)放化療敏感程度的個(gè)體差異性也是導(dǎo)致術(shù)后早期復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因。近年來(lái)，利妥昔單抗[10]及貝伐單抗[11]等分子靶向治療藥物在甲狀腺癌的治療中顯現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)，有關(guān)甲狀腺癌的分子生物學(xué)診斷和生物靶向治療的研究能給甲狀腺癌的早期診治提供參考依據(jù)，具有重要的意義。

近年來(lái)，許多學(xué)者都進(jìn)行了YAP與腫瘤的相關(guān)性研究。在乳腺癌[12]中，YAP在mRNA及蛋白水平均呈現(xiàn)異常高表達(dá)，并與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。除此之外，YAP基因和經(jīng)典癌基因KRAS一同促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)改變，從而增加腫瘤的惡性生物學(xué)表型[13]。Tu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中YAP基因表達(dá)與腫瘤惡性臨床表型及術(shù)后較短的生存期呈正相關(guān)，利用siRNA在沉默肝癌細(xì)胞中YAP的表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力并促進(jìn)其凋亡。

本研究證實(shí)，YAP在甲狀腺乳頭狀癌中呈明顯高表達(dá)趨勢(shì)，且與甲狀腺乳頭狀癌的腫瘤體積增大及高TNM分期顯著相關(guān)，提示YAP可能在甲狀腺乳頭狀癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探究YAP是否能對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)效應(yīng)，作者通過(guò)特異性siRNA沉默了B-CPAP細(xì)胞中YAP基因的表達(dá)，通過(guò)MTT及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)YAP基因的表達(dá)水平不僅能阻礙B-CPAP細(xì)胞的增殖能力而且可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，這一效應(yīng)可能與沉默YAP后，其所調(diào)控的下游包括survivin、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)和cyclin D1在內(nèi)[15]的多種促生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子形成減少有關(guān)。

綜上所述，YAP在甲狀腺乳頭狀癌中呈現(xiàn)異常的高表達(dá)趨勢(shì)，而且其異常高表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌不良臨床及病理特征相關(guān)。YAP有可能是甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子。

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Expression of YAP in human papillary thyroid cancer and its influence on cell growth

ZhangJie,LinYi,LinYa

(DepartmentofPathology,FirstPeople′sHospitalofWenlingcity,Wenling,Zhejiang317500,China)

ObjectiveTo investigate the expression of Yes-associated protein(YAP) in human papillary thyroid cancer and its influence on cell growth.MethodsThe samples in 57 cases of papillary thyroid cancer treated by operation resection in the general surgery department of this hospital and the matched tumor-adjacent tissues were collected.All the cases were definitely diagnosed by the pathology examination.The expression of YAP protein in the cancer tissue and corresponding tumor-adjacent tissue were determined by the immunohistochemistry(IHC)staining.The relationship between the YAP protein and the clinicopathological data was statistically analyzed.siRNA was used to silence the expression of YAP in B-CPAP cells,MTT and flow cytometry were used to measure the proliferation and apoptosis changes.ResultsThe expression level of YAP was markedly higher in papillary thyroid cancer tissues than in tumor adjacent tissues (P<0.05);moreover the expression of YAP protein was positively correlated with the tumor size and TNM stage (P<0.05).Silencing YAP gene could significantly inhibit the cell proliferation ability and promote cell apoptosis(P<0.05).ConclusionYAP is highly expressed in papillary thyroid cancer tissues and is related with its adverse clinicopathological characteristics,down-regulating YAP gene can significantly inhibit the cell growth.

Yes-associated protein;carcinoma,papillary;thyroid neoplasms;gene expression;cell proliferation

章杰(1982-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事胃腸腫瘤病理診斷工作。

論著·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.022

R736.1

A

1671-8348(2016)12-1653-03

2015-11-30

2015-12-27)