EGCG對哺乳期鉛暴露仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬抗氧化損傷作用的影響*

趙林遠(yuǎn)，尹延彥，李　靜，張小歡,蔣鴻琳,李文杰#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001　2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 453003　3)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科 洛陽 471000

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EGCG對哺乳期鉛暴露仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬抗氧化損傷作用的影響*

趙林遠(yuǎn)1)，尹延彥2)，李靜3)，張小歡1),蔣鴻琳1),李文杰1)#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 4500012)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 新鄉(xiāng) 4530033)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床營養(yǎng)科 洛陽 471000

表沒食子兒茶素沒食子酸酯；哺乳期鉛暴露；仔鼠；學(xué)習(xí)記憶；抗氧化損傷

目的：探討不同劑量的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對哺乳期鉛暴露仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的修復(fù)作用以及海馬組織抗氧化損傷作用的影響。方法：選取10只SPF級C57BL/6孕鼠，分為對照組(2只)和染鉛組(8只)。染鉛組孕鼠自分娩第1天至第20天經(jīng)飲水染鉛(飲用5 g/L的醋酸鉛溶液)，對照組飲用蒸餾水，母鼠通過乳汁對F1代仔鼠染毒。染鉛結(jié)束后，取40只染鉛仔鼠分為低、中、高劑量EGCG干預(yù)組、染鉛模型組，每組10只，10只未經(jīng)染鉛的仔鼠作空白對照，分別用不同濃度的EGCG溶液和生理鹽水等體積灌胃21 d。用Morris水迷宮和抗氧化酶試劑盒分別檢測仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬組織中SOD、GSH-Px活性和MDA含量。結(jié)果：各組小鼠平均逃避潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001)；與染鉛模型組相比，中、高劑量EGCG干預(yù)組SOD、GSH-Px活性明顯升高，MDA含量明顯降低(P<0.05)。結(jié)論：EGCG通過提高抗氧化酶(SOD和GSH-Px)活性拮抗鉛暴露引起的氧化損傷，改善仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

鉛是一種廣泛存在于自然界的對人體具有多器官多系統(tǒng)毒性的重金屬污染物。嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，對鉛的神經(jīng)毒性最為敏感，可引起生長發(fā)育落后、學(xué)習(xí)記憶能力的下降[1-2]。氧化應(yīng)激在鉛的神經(jīng)毒性機(jī)制中發(fā)揮重要作用，鉛可誘導(dǎo)活性氧(ROS)的大量生成，抑制抗氧化酶活性，使機(jī)體氧化/抗氧化機(jī)制失衡導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷[3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是茶多酚中最主要的活性成分[4]，具有諸多易于健康的功效。在神經(jīng)領(lǐng)域中研究[5]發(fā)現(xiàn)，EGCG通過抗氧化性、自由基清除、抗淀粉樣變等機(jī)制擁有多功能的神經(jīng)保護(hù)作用。哺乳期鉛暴露可導(dǎo)致仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降、抗氧化機(jī)制失衡，而EGCG對其是否有拮抗作用，目前尚未見報道。該研究旨在從抗氧化角度探討EGCG對鉛暴露仔鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器醋酸鉛(洛陽市化學(xué)試劑廠)，EGCG(上海晶純生化科技有限公司)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)兩種抗氧化酶活性測定試劑盒和丙二醛(MDA)含量測定試劑盒(南京建成生物有限公司)；AY120電子分析天平(日本島津公司)，Morris水迷宮(北京碩林苑科技有限公司)，LDZ4-0.8臺式離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，722S可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器公司)。

1.3小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的測定仔鼠灌胃結(jié)束后，用Morris水迷宮測量仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力。將小鼠頭朝池壁放入水中，取東、南、西、北4個起始位置之一作為放入點，從小鼠入水開始，記錄其找到目標(biāo)平臺并在平臺上停留3 s 后的時間(即逃避潛伏期)。訓(xùn)練過程中設(shè)置記錄時間為120 s，若小鼠在此時間內(nèi)找不到平臺，則將其放上平臺適應(yīng)10 s，再進(jìn)行下一次實驗。實驗歷時4 d，每d訓(xùn)練4次，每次間隔1 h，取4次結(jié)果的平均值。自動錄像系統(tǒng)記錄小鼠找到平臺的時間和游泳路徑。

1.4樣品的采集和保存在水迷宮結(jié)束后次日，對小鼠禁食，在麻醉狀態(tài)下用摘除眼球法采集血液，放入含抗凝劑的凍存管中，斷頭處死小鼠，剝離腦組織并稱量全腦重量，在冰上快速分離出海馬，用冰生理鹽水沖洗、濾紙拭干所有樣品，均放于-80 ℃冰箱保存。

1.6海馬組織氧化應(yīng)激相關(guān)因子的測定SOD活力測定采用黃嘌呤氧化酶法，GSH-Px與硫代巴比妥酸(TBA)縮合形成紅色產(chǎn)物的方法測定GSH-Px活性,MDA含量測定采用TBA法。將海馬組織加入預(yù)冷的生理鹽水中研磨成組織勻漿，以3 000 r/min 離心10 min(離心半徑為8.56 cm),取上清液按照試劑盒要求進(jìn)行測定。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析處理，各組小鼠體重和平均逃避潛伏期的比較用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析，其他變量采用單因素方差分析的方法，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1EGCG對哺乳期鉛暴露仔鼠體重及腦質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響結(jié)果見表1。

表1　各組小鼠體重及腦質(zhì)量和臟器系數(shù)的比較

小鼠體重：F組間=735.061，F(xiàn)時間=9.785，F(xiàn)交互=54.020，P均<0.001；腦質(zhì)量：F=35.087,P<0.001；臟器系數(shù)：F=9.126,P<0.001；*:與空白對照組比較，P<0.05;#：與鉛暴露模型組比較，P<0.05。

2.2小鼠Morris水迷宮測試結(jié)果見表2。

表2　各組小鼠水迷宮逃避潛伏期比較　s

F時間=216.992，P<0.001；F組間=19.004，P<0.001；F交互=1.246，P=0.056。

2.3EGCG對仔鼠血鉛含量和海馬氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響結(jié)果見表3。

表3　EGCG對仔鼠血鉛和海馬組織氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響

*:與空白對照組比較，P<0.05;#：與鉛暴露模型組比較，P<0.05。

3　討論

重金屬鉛暴露在不同的生命階段會產(chǎn)生不同程度的毒害作用。在大腦快速生長發(fā)育的嬰幼兒時期，長期低水平接觸鉛會造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)不可逆的功能障礙，并且這種改變會持續(xù)到成年階段[6]。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，鉛在人體內(nèi)選擇性地蓄積在海馬部位，對海馬本身結(jié)構(gòu)和功能影響較大，抑制長時程增強(qiáng)效應(yīng)[7]。研究[8]表明，氧自由基的大量產(chǎn)生及細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷在鉛的毒性機(jī)制中發(fā)揮重要作用，而EGCG對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用主要在于能夠清除自由基、鐵離子螯合劑，提高抗氧化酶活性的功能。He等[9]研究發(fā)現(xiàn)，對于D-半乳糖誘導(dǎo)的老年癡呆小鼠模型，給予EGCG腹腔注射可以明顯改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織氧化應(yīng)激水平，這提示EGCG可通過抗氧化機(jī)制來改善老年動物模型的學(xué)習(xí)記憶能力。

血鉛是反映機(jī)體鉛暴露水平及鉛對機(jī)體健康影響的重要指標(biāo)[10]。該研究結(jié)果表明，母鼠哺乳期鉛暴露可致仔鼠血鉛含量升高，仔鼠哺乳期染鉛組(鉛暴露模型組和EGCG干預(yù)組)與非染鉛組(空白對照組)相比，血鉛含量較高，而低、中、高EGCG干預(yù)組血鉛含量較鉛暴露模型組有所減少，但與空白對照組相比依舊很高，提示EGCG對鉛毒的拮抗作用并不是通過驅(qū)鉛來完成的，這與尹述婷[4]的研究結(jié)果一致。腦重量是反映幼年腦組織生長發(fā)育的重要指標(biāo)，國內(nèi)外許多研究[11-12]表明鉛可減輕新生鼠腦重量，影響腦發(fā)育。作者對哺乳期鉛暴露小鼠進(jìn)行不同劑量的EGCG干預(yù)3周之后，對仔鼠腦進(jìn)行稱重，結(jié)果顯示鉛暴露模型組與空白對照組相比腦組織重量明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量EGCG干預(yù)組與鉛暴露組腦質(zhì)量相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果提示，EGCG可明顯改善鉛暴露對腦組織的發(fā)育抑制作用，這與以往的研究[12]結(jié)果相似。

Morris水迷宮結(jié)果顯示，與空白對照組相比，鉛暴露模型組和EGCG干預(yù)組逃避潛伏期明顯延長；與鉛暴露模型組相比，干預(yù)組逃避潛伏期隨著干預(yù)劑量的增加，學(xué)習(xí)記憶能力逐漸增加，提示哺乳期鉛暴露可致仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低，而EGCG干預(yù)可拮抗鉛對仔鼠認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力的損害。

SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的兩種抗氧化酶，SOD可與自由基反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，GSH-Px能特異性催化還原性谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的分解作用，這兩種酶活性間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物,而含量的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[13]。該研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，鉛暴露模型組仔鼠海馬抗氧化酶活性(SOD和GSH-Px)明顯降低，MDA含量則明顯升高，這與國內(nèi)外報道[14-15]基本一致。與鉛暴露模型組比較，EGCG干預(yù)組SOD和GSH-Px酶活性明顯提高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果提示EGCG可提高腦組織內(nèi)抗氧化酶活性，拮抗鉛暴露引起的脂質(zhì)過氧化損傷，改善仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力，具體機(jī)制有待研究。

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(2015-11-28收稿責(zé)任編輯李沛寰)

Effects of EGCG on learning and memory performance and antioxidative injury ability in lead exposed offspring mice during lactation

ZHAOLinyuan1),YINYanyan2),LIJing1),ZHANGXiaohuan1),JIANGHonglin1),LIWenjie1)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,PublicHealthCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)CollegeofBasicMedicalSciences，XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang4530033)DepartmentofClinicalNutrition,theFirstAffiliatedHospital,HenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471000

epigallocatechin gallate;lead exposed during lactation;offspring mice;learning and memory;antioxidative injury

Aim: To explore the effects of epigallocatechin gallate(EGCG)on spatial learning memory performance and antioxidative damage ability in lead exposed offspring mice during lactation. Methods: A total of ten healthy pregnant C5BL/6 mice were randomly allocated into control group and lead exposed group, which were treated with drinking double evaporated water and Pb containing water, respectively from the beginning of offspring birth and lasted until weaning. There were 2 pregnant mice in control group and 8 pregnant mice in lead exposed group. The offspring mice were exposed to lead by maternal milk. Forty lead exposed offspring mice and ten control offspring mice were employed as the research objects. According to the body weight,the mice were stochastically allocated into five groups: lead exposed group(normal saline),low,middle,high dose EGCG interfering groups and control group(ten control offspring mice) and each group was administered for by lavage 21 d.The spatial learning and memory ability was evaluated by Morris water maze,SOD and GSH-Px activity levels and MDA level in hippocampus tissue were measured by corresponding kits. Results: The escape latency in each group measured at different days had significant differences and there were also differences between different groups(P<0.001); the activity levels of SOD and GSH-Px were higher in middle，high interfering groups than those in lead exposed group, while the content of MDA was lower(P<0.05). Conclusion: EGCG may protect offspring mice from lead-induced peroxidation and enhance the spatial learning and memory ability through improving antioxidant enzymes activity.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.011

*國家自然科學(xué)基金資助項目81172716

，男，1965年5月生，博士，教授，研究方向：營養(yǎng)相關(guān)慢性病，E-mail:lwj@zzu.edu.com

Q946.1