α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選反應(yīng)體系的構(gòu)建及其對(duì)烏龍茶的篩選

安品弟，褚克丹，馬玉仙，蔣慧穎，陳　靜，楊江帆（.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)；.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 35000）

α-葡萄糖苷酶抑制劑體外篩選反應(yīng)體系的構(gòu)建及其對(duì)烏龍茶的篩選

安品弟1，褚克丹2，馬玉仙1，蔣慧穎1，陳靜1，楊江帆1
（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350002）

本文以pNPG作為底物，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中pNP的生成量來(lái)檢測(cè)α-葡萄糖苷酶的活性并對(duì)傳統(tǒng)的pNPG法進(jìn)行優(yōu)化，建立了α-葡萄糖苷酶抑制劑的體外篩選反應(yīng)體系，并對(duì)7種烏龍茶進(jìn)行篩選。結(jié)果表明武夷山的武夷巖茶黃片抑制活性最高。結(jié)論：本研究建立的α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選反應(yīng)體系具備了簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，適用于篩選烏龍茶中的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

烏龍茶；α-葡萄糖苷酶；α-葡萄糖苷酶抑制劑；篩選反應(yīng)體系

α-葡萄糖苷酶抑制劑是一種有效的口服降糖藥，能夠與小腸中的α-葡萄糖苷酶的中心活性部位結(jié)合，阻抑酶活性的發(fā)揮，阻滯雙糖水解為單糖，吸收時(shí)間后延從而對(duì)降低餐后高血糖起到有益的作用［1］。α-葡萄糖苷酶抑制劑除了對(duì)糖尿病及糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防和治療有很好的效果外還能抑制蛋白及脂類糖基化［2］。我國(guó)資源豐富，但是大多數(shù)具有降血糖的藥物還沒(méi)開(kāi)發(fā)，因此，叢天然產(chǎn)物中篩選新的低毒、高效的α-葡萄糖苷酶抑制劑越來(lái)越受到人們的重視［3］。

茶葉有著悠久的飲用歷史，因含有多種天然活性成分，而具有多種保健功能。早在民間人們就有用粗老茶葉來(lái)降血糖的經(jīng)驗(yàn)。福建省泉州人民醫(yī)院蔡鴻恩醫(yī)師采用70年以上的老茶樹(shù)，制成“宋茶”，對(duì)10例DM患者進(jìn)行治療觀察，有效率達(dá)70%以上［4］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，茶可以影響糖代謝和胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以降低患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)［5］。但有關(guān)茶葉對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響還未見(jiàn)研究報(bào)道，為此，課題組建立了α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選反應(yīng)體系并對(duì)全國(guó)有代表性的7種烏龍茶進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

茶葉樣品均屬于市購(gòu)，室溫、避光貯存，詳細(xì)情況見(jiàn)表1，α-葡萄糖苷酶，4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），還原型谷胱甘肽均購(gòu)自Sigma公司；對(duì)硝基苯、碳酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等均為分析純。

恒溫水浴鍋（中國(guó)）；AR5120 Sartorius電子分析天平（瑞士賽多利斯）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海姚氏儀器設(shè)備有限公司）；紫外分光光度計(jì)UV-5800（美國(guó)安捷倫科技）。

表1　茶葉樣品

1.2試驗(yàn)方法

（1）pH6.8、67mmol/L的磷酸緩沖溶液：取 KH2PO49.118g，K2HPO415.292g，混勻溶液，加去離子水水定容到1000mL。

（2）10mmol/L pNP：取0.0384g pNP置于棕色試劑瓶中，用磷酸鉀緩沖液定容至25mL。

（3）20mmol/L pNPG：將0.6024g pNPG溶解于磷酸鉀緩沖液并定容至100mL。

（4）0.1mol/LNa2CO3：10.6 gNa2CO3溶于1000mL磷酸鉀緩沖液中，配成0.1mol/L的溶液。

（5）1g/L還原型谷胱甘肽：取25mg還原型谷胱甘肽溶于磷酸鉀緩沖液中并定容至25mL。

1.2.2烏龍茶水提物的制備

依據(jù)各指標(biāo)的特征值以及因子對(duì)于原始指標(biāo)的載荷狀況和公因子綜合得分的計(jì)算公式，得到了安徽省16個(gè)地級(jí)市對(duì)5個(gè)公因子的得分，將五個(gè)得分相加，得到了各個(gè)城市的旅游產(chǎn)業(yè)發(fā)展實(shí)力綜合得分(見(jiàn)表4)．綜合得分為正值，說(shuō)明該市旅游發(fā)展綜合水平居于平均發(fā)展水平之上，且數(shù)值越大，說(shuō)明旅游產(chǎn)業(yè)發(fā)展?fàn)顩r越好；反之，綜合得分為負(fù)值，說(shuō)明該主成分的水平在平均發(fā)展水平之下，且負(fù)值越低，說(shuō)明旅游發(fā)展?fàn)顩r越差[24]．

將巖茶黃片粉碎過(guò)篩（20目），稱取5g磨碎茶樣，加175mL去離子水，在80℃水浴鍋中提取30min，提取2次，提取時(shí)間30 min。將2次提取液冷卻、合并，真空抽濾，得澄清液體。

將10mmol/L pNP，稀釋成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L的不同濃度，然后分別取出1ml，加入0.1mol/LNa2CO3溶液10ml。于波長(zhǎng)為400nm處測(cè)定吸光度值，試驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)管。

1.2.4α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選反應(yīng)體系的建立

a、反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶反應(yīng)的影響

反應(yīng)體系為67mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）2mL，加入3.84U/ mlα-葡萄糖苷酶溶液50μL，1g/L還原型谷胱甘肽50μL，37℃保溫10min后，加入20mmol/L pNPG30μL，37℃反應(yīng)0、5、10、15、20min后，加入0.1mol/ LNa2CO3溶液10ml終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)為400nm處測(cè)定吸光度值［6］，確定酶反應(yīng)的適宜時(shí)間。

b、底物添加量對(duì)酶反應(yīng)的影響

應(yīng)用1.2.4.1節(jié)反應(yīng)體系，分別加入20mmol/L pNPG10、15、20、25、30、35、40、45、50μL，37℃保溫10min后再分別加入0.1mol/LNa2CO3溶液10ml終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)為400nm處測(cè)定吸光度值，確定酶的添加量。

c、酶添加量對(duì)酶反應(yīng)的影響

應(yīng)用1.2.4.1節(jié)反應(yīng)體系，分別加入α-葡萄糖苷酶溶液30、35、40、45、50、55、60、65、70μL，37℃保溫10min后再分別加入0.1mol/LNa2CO3溶液10ml終止反應(yīng)，于波長(zhǎng)為400nm處測(cè)定吸光度值，確定酶的添加量。

d、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以酶活力為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)，分別對(duì)影響酶活的3個(gè)因素反應(yīng)時(shí)間、酶添加量、底物添加量設(shè)計(jì)3個(gè)水平，因素水平表見(jiàn)表2。

1.2.5不同烏龍茶對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

采用在1.2.4節(jié)中建立的篩選反應(yīng)體系，加入濃度為15mg/mL的待測(cè)樣品液（即1.2.2制備的茶湯溶液）500μL，反應(yīng)后于波長(zhǎng)為400nm處測(cè)定吸光度值，同時(shí)設(shè)置空白組（不加樣品）、背景組（只加樣品）。根據(jù)空白組、樣品組、背景組的吸光度值（A空白、A樣品、A背景）。計(jì)算抑制率。其中酶活力單位定義：在37℃，pH值6.8條件下，1 min內(nèi)水解pNPG釋放1 μmoL pNP所需的酶量 （U）。抑制劑活力單位定義：在相同條件下降低1個(gè)酶活力單位所需的抑制劑量。以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。

抑制率=［A空白-（A樣品-A背景）］/A空白×100%

表2　正交試驗(yàn)因素水平表

2　結(jié)果與分析

2.1pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線

pNP的濃度和吸光度值之間的線性關(guān)系為：y=2.112x-0.0244，R2= 0.99908。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選反應(yīng)體系的影響因子

本實(shí)驗(yàn)固定底物添加量pNPG30μL，pH=6.8，考察反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和酶液添加量對(duì)酶反應(yīng)的影響。見(jiàn)圖2-4。

圖2　酶促反應(yīng)速率曲線

圖3　酶液添加量對(duì)酶反應(yīng)的影響

圖4　溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響

可以看出pNP的生成量是隨著時(shí)間的不斷增加而增加的，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為10min時(shí)，pNP的生成量最大，因此可以判定酶反應(yīng)的最佳時(shí)間是10min；由圖3可以看出當(dāng)酶液添加量為45μL時(shí)，酶活力最大，因此可以判定酶液的最佳添加量為45μL，由圖4可以看出，隨著溫度的增高，酶活力隨之增大，當(dāng)溫度為40℃時(shí)，酶活力最高，當(dāng)溫度超過(guò)40℃時(shí)，酶活力開(kāi)始下降，因此，可以判定酶反應(yīng)最佳溫度是40℃。

2.3篩選反應(yīng)體系的條件優(yōu)化

由結(jié)果可知，反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、酶液添加量對(duì)酶活的影響分別是：反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞酶液添加量，根據(jù)k值分析的結(jié)果，體外α-葡萄糖苷酶抑制篩選反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)條件為A2B3C3，即：反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間15min，酶液添加量55μL。在此條件下，其活力均高于正交試驗(yàn)的9組實(shí)驗(yàn)組合的活力，其酶活力平均值為68.9U。

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4　方差分析

*差異顯著（P＜0.05）；**差異極顯著（P＜0.01）

2.4烏龍茶對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

利用本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的反應(yīng)體系對(duì)全國(guó)7種烏龍茶篩選測(cè)試。通過(guò)測(cè)定比較不同烏龍茶對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50，IC50越小，表明抑制效果越好；IC50越大，表明抑制效果越差。不同烏龍茶對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性依次為：巖茶黃片＞鳳凰單叢＞安溪鐵觀音＞凍頂烏龍＞漳平水仙＞文山包種，且?guī)r茶黃片對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用分別是安溪鐵觀音的1.4倍、漳平水仙的1.5倍、凍頂烏龍的1.3倍、文山包種的1.6倍。

表5　不同烏龍茶提取物的酶抑制率

3　討論

我國(guó)茶資源豐富，中國(guó)和日本民間都有用粗老茶醫(yī)治糖尿病的傳統(tǒng)。大量的文獻(xiàn)報(bào)道烏龍茶具有降血糖功效，如何叢烏龍茶中快速、有效的篩選出治療糖尿病的有效成分對(duì)于茶資源再利用和新的茶葉保健品開(kāi)發(fā)具有重要意義。目前雖報(bào)道有2型糖尿病藥物的篩選反應(yīng)體系［7-9］，但為適應(yīng)開(kāi)展大規(guī)模篩選烏龍茶的需要，本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法建立了便捷可靠的α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選反應(yīng)體系。

本實(shí)驗(yàn)先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)影響酶活力的3個(gè)因素（反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、酶液添加量）進(jìn)行了考察，然后又通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)3因素行了綜合考察，叢正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析看，各因素對(duì)酶活的影響按大小排列依次為：C（反應(yīng)溫度）＞A（反應(yīng)時(shí)間）＞B（酶液添加量）。通過(guò)對(duì)各因素的分析研究，我們確定了反應(yīng)體系的篩選條件。首先，依次加入55μL酶液、1g/L還原型谷胱甘肽50μL，振蕩混勻，37℃保溫10min，再加入20mmol/L的底物30μL，37℃反應(yīng)15min，加入0.1mol/LNa2CO3溶液10ml終止反應(yīng)，400nm處測(cè)定吸收值。

利用本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的反應(yīng)體系對(duì)全國(guó)7種烏龍茶篩選測(cè)試。通過(guò)測(cè)定比較不同烏龍茶對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50，結(jié)果表明巖茶黃片的IC50最小，為3.15mg·mL-1，其抑制效果最好；文山包種的IC50最大，為5.05mg·mL-1，其抑制效果相對(duì)來(lái)說(shuō)弱于其他6種烏龍茶。不同烏龍茶對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性依次為：巖茶黃片＞鳳凰單叢＞安溪鐵觀音＞凍頂烏龍＞漳平水仙＞文山包種，且?guī)r茶黃片對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用分別是安溪鐵觀音的1.4倍、漳平水仙的1.5倍、凍頂烏龍的1.3倍、文山包種的1.6倍。

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福建省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”中國(guó)烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新培育專項(xiàng)（K80150001）。