熱敏型核酸酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及催化特性

陳芳霞，陳鵬

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熱敏型核酸酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及催化特性

陳芳霞，陳鵬

西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100

核酸酶在生物工程領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究在優(yōu)化北極蝦核酸酶 (Shrimp nuclease，SNU) 基因序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建SNU的畢赤酵母分泌表達(dá)載體SNU-pPICZα A并轉(zhuǎn)化酵母，以高拷貝整合轉(zhuǎn)化子為基礎(chǔ)，優(yōu)化酶表達(dá)的條件，并對(duì)該酶的催化特性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SNU可在畢赤酵母SMD1168H中高效分泌表達(dá)，最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：培養(yǎng)基BMMY pH 6.0，甲醇濃度為1%，誘導(dǎo)時(shí)間為72 h，誘導(dǎo)后粗酶液比活力為1.4×105U/mL。經(jīng)過(guò)DEAE Sephadex陰離子交換層析可純化獲得高純度的目標(biāo)蛋白，每升菌液可純化15 mg目標(biāo)蛋白，比活力達(dá)到6.291×106U/mg，該酶表觀分子量為50 kDa，PNGaseF酶切證實(shí)該酶存在糖基化現(xiàn)象。二價(jià)金屬離子Ca2+、Mn2+、Co2+、Mg2+及還原劑DTT、β-ME能顯著地提高其水解活性，但Zn2+、Cu2+、SDS、高濃度NaCl抑制該酶的活性，SNU為Ca2+/Mg2+依賴型核酸酶。70 ℃處理10 min可使該酶不可逆的失活。

北極蝦Ca2+/Mg2+依賴型核酸酶，畢赤酵母，分泌表達(dá)優(yōu)化，催化特性

重組蛋白技術(shù)的成熟與發(fā)展為生物醫(yī)藥和生物學(xué)研究提供了非常高效的手段，但在蛋白生產(chǎn)過(guò)程中仍存在諸多技術(shù)性難題。在重組蛋白純化過(guò)程中菌體裂解釋放核酸產(chǎn)生高粘度的裂解液，影響下游的操作和層析純化。蛋白粗提液過(guò)量的核酸將導(dǎo)致純化產(chǎn)品的核酸污染，因此在蛋白純化上游步驟除去核酸意義重大。酶法除去核酸是現(xiàn)今蛋白質(zhì)粗提液處理最主要的途徑。商業(yè)化產(chǎn)品DNase I是最為常用的去除核酸的酶制劑[1]，但存在催化活力低、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，來(lái)源于靈桿菌商品化核酸酶Benzonase endonuclease (Merck) 由于具有高的催化效率，使之成為生物化學(xué)和藥物制劑領(lǐng)域重要的核酸污染控制用酶[2-4]。但Benzonase酶穩(wěn)定性極高、滅活難，在后續(xù)蛋白純化過(guò)程中，需要采用較為復(fù)雜的色譜技術(shù)去除微量的核酸酶，使目標(biāo)蛋白損失以及分離純化的成本明顯增加。因此篩選高活性且易熱失活的熱敏核酸酶對(duì)于蛋白純化工藝的優(yōu)化有重要的價(jià)值，特別是對(duì)生物學(xué)領(lǐng)域眾多嗜熱蛋白純化過(guò)程中，當(dāng)熱敏核酸酶除去核酸后，可以利用嗜熱蛋白的熱穩(wěn)定性，通過(guò)加熱失活的方式高效除去反應(yīng)后的核酸酶。另外核酸酶是生產(chǎn)食品添加劑和醫(yī)藥行業(yè)中重要原料——單核苷酸的重要酶制劑[5]，因此研究開(kāi)發(fā)新的核酸酶，對(duì)于核苷酸生產(chǎn)工藝的改造有重要的實(shí)踐價(jià)值。

北極蝦胰臟中純化的核酸酶 (Shrimp nuclease，SNU) 是少有報(bào)道的一種熱敏核酸酶，其在65 ℃的活力半衰期為1 min，且熱失活表現(xiàn)為不可逆[6]，已有的研究都是從北極蝦胰臟中直接提取該核酸酶，關(guān)于北極蝦核酸酶的重組表達(dá)至今未有文獻(xiàn)報(bào)道。與之同源的熱敏型蟹核酸酶DSN及其突變體DSN-TL成功在宿主BL21 (DE3) 中重組表達(dá)[7-8]，其他一些非特異性核酸酶 (DNase Ι[9])，靈桿菌核酸酶[10-11]，NucA[12])也都已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌周質(zhì)或培養(yǎng)基中的分泌表達(dá)，雖然利用原核表達(dá)系統(tǒng)胞內(nèi)高效表達(dá)核酸酶有零星的文獻(xiàn)報(bào)道，但是這些核酸酶的重組中往往存在對(duì)宿主細(xì)胞的高毒性，表現(xiàn)出宿主很難生長(zhǎng)或者以無(wú)活性的包涵體形式表達(dá)等問(wèn)題，加之多數(shù)核酸酶存在糖基化現(xiàn)象[13]，使利用原核系統(tǒng)表達(dá)核酸酶存在較大的技術(shù)障礙。畢赤酵母具有原核生物無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，非常適合于對(duì)宿主高毒性核酸酶的重組表達(dá)。本研究利用重疊PCR優(yōu)化北極蝦核酸酶基因并構(gòu)建畢赤酵母分泌表達(dá)載體，在篩選高拷貝轉(zhuǎn)化菌的基礎(chǔ)上，構(gòu)建北極蝦核酸酶的重組表達(dá)體系，并對(duì)重組表達(dá)酶的催化特性進(jìn)行分析，以期為該酶的分子改造及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌菌株TOP10、畢赤酵母SMD1168H和畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα A均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶與主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、蛋白Marker均購(gòu)自Fermentas公司。IProof DNA聚合酶為Bio-Rad公司產(chǎn)品，pEasy Blunt Zero克隆載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PNGaseF、DNA Marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。其他常用生化及分子生物學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。DEAE sephadex A-50為GE公司產(chǎn)品。引物合成及測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 核酸酶密碼子的優(yōu)化

參考GenBank報(bào)道的北極冷水蝦核酸酶蛋白質(zhì)序列 (GenBank Accession No. CBG22733)，去除N端的23個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，參考Sharp等[14]的方法對(duì)成熟蛋白的381個(gè)氨基酸殘基編碼的cDNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化序列合成32條引物用于優(yōu)化基因的拼接合成，其中N端和C端對(duì)應(yīng)的引物分別添加Ⅰ和Ⅰ的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。利用PCR拼接合成的基因序列克隆到pEasy Blunt Zero載體上，送北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.2 分泌表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：

分別參考Sambrook[15]的方法和Easy SelectTMExpression Kit的說(shuō)明。

1.2.3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子鑒定及表達(dá)分析

轉(zhuǎn)化子鑒定：挑單克隆于20 μL 20 mmol/L NaOH溶液中，煮沸10 min，10 000 r/min離心2 min，取1 μL上清作為模板，用AOX PCR擴(kuò)增確定目的基因是否整合到酵母中。

高Zeocin抗性菌株SNU插入拷貝數(shù)測(cè)定：參考李凱等[16]的方法進(jìn)行，目的基因SNU和內(nèi)參基因GAPDH引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物

Table 1 Primers used in this study

Underlined letters indicateⅠⅠdigestion sites.

表達(dá)分析：挑取數(shù)個(gè)單菌落接種于5 mL BMGY培養(yǎng)基中，250 r/min、30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜直到600為2–6。經(jīng)BMGY培養(yǎng)的5 mL菌液5 000 r/min離心10 min，用BMGY培養(yǎng)基重懸菌體于50 mL BMMY培養(yǎng)基中，250 r/min、30 ℃培養(yǎng)，每24 h補(bǔ)加甲醇一次至終濃度為1%，并于24、42、78、96 h分別取樣1 mL，離心，取上清，加終濃度至10%的三氯乙酸沉淀蛋白，沉淀用預(yù)冷80%丙酮洗滌2–3次，SDS-PAGE分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。篩選獲得的目標(biāo)蛋白表達(dá)量高的克隆用于后續(xù)的研究。

1.2.4 表達(dá)條件的優(yōu)化

選擇表達(dá)量最高的克隆，參考1.2.3的步驟，分別在不同誘導(dǎo)時(shí)間 (24、48、72、96 h)，不同甲醇誘導(dǎo)濃度 (體積分?jǐn)?shù)為1%，0.5%) 下進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化。

1.2.5 表達(dá)蛋白的純化

經(jīng)最優(yōu)培養(yǎng)條件誘導(dǎo)獲得的畢赤酵母培養(yǎng)液離心后，上清經(jīng)溶液A (10 mmol/L Tris-HCI，pH 7.0，50 mmol/L NaCl) 4 ℃透析過(guò)夜后上樣于預(yù)先平衡的DEAE Sephadex A-50離子交換柱上，然后用溶液A除去未結(jié)合的蛋白，用含0–1.0 mol/L NaCl的溶液A進(jìn)行線性梯度洗脫，分步收集洗脫液并進(jìn)行酶活測(cè)定。將各活性管合并于10 mmol/L Tris-HCl緩沖液 (pH 7.0) 4 ℃透析過(guò)夜，經(jīng)PEG6 000濃縮后進(jìn)行電泳檢測(cè)。蛋白濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法，用牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 PNGaseF分析核酸酶糖基化

根據(jù)PNGaseF說(shuō)明書進(jìn)行[17]。10 μg純化酶液中加入10 μL變性緩沖液，100 ℃保溫3 min使酶蛋白變性以暴露所有的糖基化位點(diǎn)，然后加入穩(wěn)定劑緩沖液5 μL，1 U PNGaseF，去離子水補(bǔ)足體積至30 μL，37 ℃反應(yīng)18 h后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.7 核酸酶酶活性的測(cè)定

參照Ko等的方法[18]進(jìn)行。酶活力單位定義為每分鐘生成的核苷酸量在260 nm處的吸光值⊿=1.0時(shí)為1 U。以20 μg pEASY-Blunt Zero質(zhì)粒DNA 為底物。反應(yīng)體系為：2 μL緩沖液 (100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L MgSO4)，10 μg pEASY-Blunt Zero質(zhì)粒載體，1 U純化的核酸酶，用ddH2O補(bǔ)充至終體積為20 μL，混勻，37 ℃保溫10 min。反應(yīng)結(jié)束后，加1/4體積1 mol/L HCl，25% TCA終止反應(yīng)。上清用滅菌ddH2O稀釋，在260 nm處測(cè)定光吸收值。

1.2.8 不同反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH、金屬離子及還原劑對(duì)核酸酶活性的影響

參考1.2.7的方法，分析不同反應(yīng)時(shí)間和溫度 (0、4、28、37、50、60 ℃) 對(duì)水解活性的影響，同時(shí)分析了不同pH (4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0) 和0、1、5、10 mmol/L金屬離子 (Mg2+、Ca2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+) 對(duì)水解活性的影響。同時(shí)測(cè)定了1、10 mmol/L DTT/β-巰基乙醇，0.1%、1%的表面活性劑Triton X-100/Tween-20/SDS以及50、100、200、300、400 mmol/L NaCl對(duì)核酸酶活性的影響，反應(yīng)完畢后立即用10 μL 250 mmol/L EDTA終止反應(yīng)，1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.9 核酸酶的不可逆熱失活分析

為了確定核酸酶的不可逆失活溫度，參考1.2.7的方法，反應(yīng)體系預(yù)先不加底物于50、60、70 ℃分別保溫10 min，加熱后的溶液冰上放置 30 min后，加入底物，37 ℃反應(yīng)30 min，電泳檢測(cè)是否存在水解活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

通過(guò)32條引物重疊延伸PCR獲得了去除信號(hào)肽的核酸酶編碼區(qū)序列，電泳分析顯示在1 200 bp左右有一特異DNA擴(kuò)增帶，經(jīng)克隆測(cè)序顯示含有1 176 bp的目標(biāo)編碼區(qū) (含畢赤酵母Kex2 signal及Ste13 signal 切割序列)，與預(yù)期結(jié)果一致。優(yōu)化合成的核酸酶基因經(jīng)ⅠⅠ雙酶切連接至pPICZα A載體，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切驗(yàn)證，插入片段與預(yù)期大小一致，說(shuō)明重組表達(dá)載體pPICZα A -SNU構(gòu)建成功。

2.2 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

通過(guò)Zeocin抗性水平，篩選酵母高拷貝整合轉(zhuǎn)化子[19]，然后PCR鑒定正確的6個(gè)克隆分別在pH 6.0，1%甲醇濃度下誘導(dǎo)表達(dá)，從蛋白表達(dá)水平再次篩選出目標(biāo)蛋白表達(dá)量高的單克隆菌株，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明此高拷貝菌株有8個(gè)目的基因拷貝整合到酵母基因組。誘導(dǎo)96 h的培養(yǎng)液上清濃縮進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，在50 kDa處出現(xiàn)明顯的條帶 (圖1)，略大于北極蝦核酸酶的理論分子量42 kDa。

從甲醇濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，圖1中可以看出最佳組合為：1%的誘導(dǎo)甲醇濃度，72 h目的蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值，可能是0.5%的甲醇濃度，不能滿足畢赤酵母所需的碳源，使得目的蛋白表達(dá)量略低。

圖1 不同甲醇誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間下SNU表達(dá)量的SDS-PAGE分析

2.3 重組核酸酶的純化

隨著酵母誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)的限制造成溶菌現(xiàn)象或蛋白的降解，SDS-PAGE分析檢測(cè)到蛋白種類增多 (圖1，泳道10)，研究選擇誘導(dǎo) 72 h的上清經(jīng)透析和陰離子交換層析進(jìn)行純化，梯度洗脫活性管經(jīng)濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示為單一條帶(圖2A)。

圖2 表達(dá)蛋白的純化 (A) 和糖基化分析 (B)

2.4 PNGase F分析核酸酶糖基化

SDS-PAGE分析純化后的SNU分子量大于理論分子量，推測(cè)可能存在翻譯后的糖基化修飾。經(jīng)PNGaseF處理的SNU SDS-PAGE分析顯示分子大小為48 kDa，比預(yù)期分子量仍偏大 (圖2B)，說(shuō)明畢赤酵母表達(dá)的SNU可能存在非PNGase F可水解的其他糖基化修飾。

2.5 核酸酶SNU催化特性分析

2.5.1 不同反應(yīng)溫度和pH對(duì)酶活性的影響

為便于研究SNU的催化影響因素，在給酶量為1 U，10 μg質(zhì)粒為底物，反應(yīng)條件為37 ℃，pH 8.0的條件下，SNU水解核酸的時(shí)間進(jìn)程測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以10 μg質(zhì)粒為底物最佳反應(yīng)時(shí)間為10 min。

在0–60 ℃范圍內(nèi)測(cè)定SNU水解核酸的活性，如圖3A所示，在0–60 ℃范圍內(nèi)SNU均具有水解活性，即使在0 ℃條件下也表現(xiàn)出一定的水解活性，溫度達(dá)到37 ℃酶的活性達(dá)到最大值，隨著溫度的升高，催化水解程度明顯降低。在pH 4–10范圍內(nèi)分析核酸酶SNU的水解活性，由圖3B所示，SNU在pH 5.0–9.0的酸堿范圍都保持一定的水解活性，最適pH范圍為6.0–8.0。

圖3 溫度 (A) 和pH (B) 對(duì)SNU酶活性的影響

2.5.2 金屬離子對(duì)酶活性的影響

SNU的水解活性需要二價(jià)金屬離子催化，實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系中添加不同的金屬離子引起的效應(yīng)存在差異，Mg2+、Co2+、Ca2+、Mn2+能有效激活核酸酶水解反應(yīng)，Mg2+/Mn2+對(duì)核酸酶激活作用明顯大于Co2+和Ca2+，并且不同濃度的二價(jià)離子對(duì)核酸酶活性有著不同的促進(jìn)作用，伴隨Mg2+和Mn2+濃度的增加 (≥5 mmol/L)，激活作用減弱，5 mmol/L Mg2+和 1 mmol/L Mn2+顯著提高水解效率，而核酸酶對(duì)Co2+和Ca2+濃度在5 mmol/L和10 mmol/L變化不敏感，表現(xiàn)為水解程度相差不大。但是低濃度和高濃度的Zn2+和Cu2+抑制了酶催化水解反應(yīng)。

2.5.3 不同還原劑、變性劑、表面活性劑和NaCl對(duì)核酸酶活性的影響

研究還原劑DTT、β-巰基乙醇、表面活性劑Triton X-100、Tween-20、SDS等因素對(duì)核酸酶的影響，與對(duì)照組相比額外添加一定濃度的DTT、β-ME、Triton X-100、Tween-20等都有效提高了酶的水解活性，而0.1% SDS完全抑制酶的活性。SNU的活性受鹽濃度明顯影響，NaCl濃度低于0.1 mol/L時(shí)，SNU表現(xiàn)高的活性，當(dāng)NaCl高于0.1 mol/L時(shí)即表現(xiàn)出對(duì)核酸酶活性的明顯抑制，當(dāng)反應(yīng)體系中NaCl增加至0.3 mol/L時(shí)核酸酶活性被完全抑制。

2.6 核酸酶的不可逆熱失活分析

酶的熱失活是終止酶切反應(yīng)的一種簡(jiǎn)便易行的方法，缺失質(zhì)粒底物的酶切反應(yīng)體系分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃孵育10 min后，加入質(zhì)粒底物進(jìn)行水解反應(yīng)，結(jié)果表明70 ℃預(yù)保溫10 min使SNU完全失活。

3 討論

自然生境的多樣性為分離不同催化特性的酶提供了基礎(chǔ)。從嗜冷生物中獲取熱敏感的酶已有較多成功的報(bào)道，如從北極蝦中分離的蝦堿性磷酸酶 (Shrimp alkaline phosphatase，SAP) 是基因工程操作過(guò)程使用的主要去磷酸化酶[20]；南極細(xì)菌TAB5中分離的堿性磷酸酶TAP (TAB5 alkaline phosphatase，TAP)在原核系統(tǒng)中可以實(shí)現(xiàn)重組表達(dá)而成為SAP的有效替代酶[[21]。從北極蝦胰臟中純化獲得的核酸酶SNU特異作用于雙鏈的DNA，核酸序列分析顯示其屬于RNA/DNA非特異性核酸酶，在Ca2+和Mg2+同時(shí)存在時(shí)，可能表現(xiàn)出RNase活性[6]。同時(shí)SNU與勘察加半島蟹胰臟中發(fā)現(xiàn)的雙鏈特異型核酸酶DSN具有相似的催化特性，在金屬離子Ca2+、Mg2+、Co2+等存在條件下，能夠有效切割雙鏈DNA，而無(wú)RNase活性[22]，這些特性為SNU在生物技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用提供了依據(jù)。

關(guān)于北極蝦核酸酶的重組表達(dá)至今尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究構(gòu)建了北極蝦核酸酶的畢赤酵母分泌表達(dá)載體SNU-pPICZα A，成功實(shí)現(xiàn)了北極蝦核酸酶SNU分泌表達(dá)，優(yōu)化了SNU最佳表達(dá)條件和純化方法，每升培養(yǎng)液可以純化15 mg高活性的SNU，依據(jù)Kunitz測(cè)定法對(duì)酶活力單位的定義，已報(bào)道的nuclease與DNase I的比活力分別為8.6×106U/mg和7.2×105U/mg[12]，本研究重組酶SNU的比活力達(dá)到6.291×106U/mg，屬于高活性的核酸酶。N-糖基化對(duì)蛋白的活性，結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性起到了重要的作用[23-24]，PNGaseF水解證明重組SNU存在糖基化現(xiàn)象。這些結(jié)果為后續(xù)規(guī)?；呙芏劝l(fā)酵生產(chǎn)該核酸酶奠定了基礎(chǔ)。

純化的SNU表現(xiàn)出70 ℃，10 min不可逆的失活，這與從天然原料中純化獲得的SNU (65 ℃不可逆失活15 min) 的特性較為接近，是一種典型的熱敏型核酸酶。Sugiyama等將核酸酶依據(jù)酶對(duì)輔因子和最適pH的不同分為兩類：Ca2+/Mg2+依賴型核酸酶和Zn2+依賴型核酸酶[25]，依據(jù)SNU催化特性證明其為Ca2+/Mg2+依賴型核酸酶。最適反應(yīng)條件分析顯示SNU可在寬泛的條件下保持其催化活性，且表現(xiàn)出對(duì)金屬離子的依賴性，非離子型去污劑，還原劑可明顯增加核酸酶的活性，不可逆熱失活及優(yōu)異的催化特性為該酶在細(xì)胞裂解液粘度的降低以及蛋白類生物藥物中核酸去除等生物工程領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Secretory expression and characterization of heat sensitive nuclease in

Fangxia Chen, and Peng Chen

College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China

Nucleases is an important enzyme widely used in biotechnology. A codon optimized nuclease gene (SNU) from Northern Shrimps was inserted into pPICZα A vector, and expressed extracellularly in strain SMD1168H. On the basis of multi-copy recombinant strain, we further optimized the expression condition and characterized SNU. SNU was highly expressed and stable after 1% methanol induction for 72 h, yield reached 1.4×105U/mL. SDS-PAGE electrophoresis demonstrated that this is a N-linked glycoprotein of 50 kDa. It was purified by one step DEAE Sephadex chromatography to the purity of about 15 mg/L with a specific activity of 6.291×106U/mg. Functional analysis on the nuclease activity indicated that it was stimulated by bivalent iron, such as Ca2+, Mn2+, Co2+and Mg2+, but inhibited by Zn2+, Cu2+and high salt. Meanwhile, it was irreversibly inactivated at 70 ℃ for 10 min.

Northern Shrimp Mg2+/Ca2+-independent nuclease,, secretory expression optimization, catalytic characteristics

November 5, 2015; Accepted: January 25, 2016

陳芳霞，陳鵬. 熱敏型核酸酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及催化特性. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(7): 991–995.

Chen FX, Chen P. Secretory expression and characterization of heat sensitive nuclease in. Chin J Biotech, 2016, 32(7): 991–995.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 30400282, 31171606), Basic Science Research Fund in Northwest A&F University (No. 2452015214).

Corresponding author: Peng Chen. Tel/Fax: +86-29-87091637; E-mail: pengchen@nwsuaf.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 30400282，31171606)，西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi) (No. 2452015214) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)