直接抗人球蛋白試驗陽性在貧血患者的分布特征及臨床意義

王曉平　楊君青

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·論著·

直接抗人球蛋白試驗陽性在貧血患者的分布特征及臨床意義

王曉平楊君青

目的分析直接抗人球蛋白試驗(DAT)陽性在不同血紅蛋白含量貧血患者中的分布特征，并探討DAT陽性的影響因素及其臨床意義。方法采用試管法對不同血紅蛋白含量的從輕度至極重度貧血的216例住院患者標本進行直抗試驗，陽性者進行分型檢測。結(jié)果216例患者DAT陽性63例，陽性率29.2%，對DAT陽性患者標本分型，抗-IgG+抗-C3d 陽性42例(占66.7%)；抗-IgG 陽性12例(占19%)；抗-C3d 陽性9例(占14.3%)，陽性率分布以血紅蛋白含量在50～59 g/L范圍內(nèi)陽性率最高，達60.9%，與其他貧血組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DAT陽性患者疾病類型分布為自身免疫性溶血性貧血(AIHA)最多為31例(49.2%)，風濕免疫性疾病16例(25.3%)，血液病6例(9.5%)，腫瘤、新生兒溶血病各出現(xiàn)4例(6.3%)，肝臟疾病及其他不明原因DAT陽性各1例(1.6%)。結(jié)論DAT陽性是影響患者貧血狀態(tài)的重要因素之一，對于需接受輸血治療的貧血患者，特別是血紅蛋白含量在50～59 g/L范圍內(nèi)的患者在治療過程中應對其進行DAT檢測及分型試驗，分析造成其DAT陽性的因素，以保障臨床有效輸血。

直接抗人球蛋白試驗；貧血；輸血治療

貧血(anemia)是指全身循環(huán)紅細胞總量減少，在臨床上表現(xiàn)為外周血單位容積中血紅蛋白量(Hb)、紅細胞數(shù)量(RBC)和血細胞比容(Hct)低于參考區(qū)間下限的臨床征象，診斷依據(jù)常以Hb水平低于參考區(qū)間的下限為標準[1]?？谷饲虻鞍自囼?(Coombs試驗)是免疫血液學的經(jīng)典試驗，免疫血液學工作使用的抗人球蛋白試驗分為間接抗人球蛋白試驗(IAT)和直接抗人球蛋白試驗(DAT)兩種。DAT在臨床上主要應用于胎母血型不合新生兒溶血病的診斷、免疫溶血性輸血反應的調(diào)查、自身免疫性溶血性貧血(AIHA)的診斷、藥物誘發(fā)型溶血病的診斷等[2]。其他諸多疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、血液病、腫瘤、感染等，均可能出現(xiàn)紅細胞存活期縮短、患者的DAT呈陽性[3-5]。文獻報道DAT陽性率在貧血待查患者中達60.4%[6]，檢測DAT能幫助鑒定溶血是否有免疫基礎[7]，以及免疫性溶血性貧血的類型，進而判斷溶血的嚴重程度。為進一步研究不同程度貧血患者中DAT陽性結(jié)果的分布范圍及概率，探討造成DAT陽性的因素，我們檢測了不同血紅蛋白含量貧血患者的DAT，同時對檢出的DAT陽性者進行分型檢測(抗-IgG+抗-C3d/抗-IgG/抗-C3d)，報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料2015年1～7月在邯鄲市第醫(yī)院住院貧血患者216例。其中男100例，女116例；年齡1 d～78歲，平均年齡52.28歲。臨床表現(xiàn)疑似血液病49例、AIHA 37例、風濕免疫性疾病32例、肝臟疾病30例、腫瘤29例、新生兒溶血病17例、感染性疾病16例，其他不明原因6例?；颊呔胁煌潭鹊母纹⒛[大、黃疸等貧血癥狀。216例患者中，輕度貧血62例(Hb>90 g/L)，中度貧血111例(Hb 60～90 g/L)，重度貧血35例(Hb 30～60 g/L)，極重度貧血8例(Hb<30 g/L)。貧血的一般診斷標準[8]：男性成年人Hb<120 g/L，RBC<4.0×1012/L，Hct<0.40；女性成年人Hb<110 g/L，RBC<3.5×1012/L，Hct<0.35；小兒定為出生后10 d Hb<145 g/L，10 d至3個月 Hb<100 g/L，3個月至6歲Hb<110 g/L，6～14歲Hb<120 g/L；老年人定為Hb<110 g/L，RBC<3.5×1012/L，Hct<0.35。

1.2試劑和儀器直接抗人球蛋白試劑盒(抗-IgG+抗-C3d/抗-IgG/抗-C3d)，上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司；日本SYSMEX公司全自動血細胞分析儀及試劑。

1.3檢測方法應用全自動血液分析儀檢測外周血血紅蛋白含量，采集0.5 ml EDTA-K2抗凝的靜脈血加入試管中混勻，2 h內(nèi)進行檢測分析，得到相應的血紅蛋白結(jié)果；DAT采集5 ml患者EDTA-K2抗凝血，離心分離紅細胞與血漿，將紅細胞用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次，配成5%的紅細胞懸液。分別標記被檢、陰性、陽性及自身對照試管4支，向被檢管和對照管中分別加入1滴5%紅細胞懸液，0.9%氯化鈉溶液洗滌3～4次，最后一次洗滌，除盡上清液。立即向被檢管中加入抗人球蛋白試劑1 滴，向?qū)φ展苤屑尤?滴鹽水或6%白蛋白，混勻。1 000 g離心15 s，觀察凝集情況，評分并記錄結(jié)果。若被檢管中未觀察到凝集，向含有抗球蛋白試劑的試管中加入IgG致敏紅細胞，1 000 g離心15 s，觀察并記錄結(jié)果，對陰性結(jié)果進行確認，如果IgG 致敏細胞不凝集，陰性結(jié)果無效，需重復實驗。初檢只用多特異性抗球蛋白試劑，如果DAT 陰性，無需后續(xù)試驗，如果DAT 陽性，再用單特異性試劑(抗-IgG和抗-C3d)做DAT，確定球蛋白種類。多特異性抗人球蛋白試劑陽性標本，再分別用直接抗人球蛋白試劑盒(抗-IgG/抗-C3d)進行分型試驗，分型試驗按試劑說明書操作。將住院的216例不同程度貧血患者按照血紅蛋白含量差異進行分組，分為<50 g/L、50～59 g/L、60～69 g/L、70～79 g/L、80～90 g/L、>90 g/L 6組，統(tǒng)計直抗陽性分布范圍及疾病類型。

1.4統(tǒng)計學分析應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料采用χ2檢驗， P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1216例貧血患者DAT陽性率216例貧血患者DAT陽性63例，DAT陰性153例，陽性率29.2%。見表1。

表1　216例貧血患者DAT陽性率　例

2.2DAT陽性患者各分型例數(shù)及百分率63例DAT陽性患者中，抗-IgG+抗-C3d陽性42例，占66.7%；抗-IgG陽性12例，占19%；抗-C3d陽性9例，占14.3%。見表2。

表2　DAT陽性患者各分型例數(shù)及百分率　例(%)

2.3不同血紅蛋白含量的患者DAT陽性分布6組患者陽性率比較，血紅蛋白含量<90 g/L的5組貧血患者，與>90 g/L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中50～59 g/L組DAT陽性率最高為60.9%，與其他<90 g/L貧血4組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中63例DAT陽性患者接受輸血次數(shù)均為2次及以上，153例DAT陰性患者接受輸血次數(shù)均<2次。見表3。

2.463例DAT陽性患者疾病類型分布及分型鑒定結(jié)果63例DAT陽性患者中，AIHA最多為31例(49.2%)，風濕免疫性疾病16例(25.3%)，血液病6

表3　不同血紅蛋白含量的患者DAT陽性分布

例(9.5%)，腫瘤、新生兒溶血病各出現(xiàn)4例(6.3%)，肝臟疾病及其他不明原因DAT陽性各1例(1.6%)。見表4。

表4　63例DAT陽性患者疾病類型分布及分型鑒定結(jié)果

3　討論

Coombs試驗，分為直接抗人球蛋白試驗(DAT)、間接抗人球蛋白試驗(IAT)[9]。如補體成分依次從C5～C9激活，則引起紅細胞溶血，如補體成分只是從C1～C3激活，激活的C3結(jié)合紅細胞膜上C3受體，C3可進一步激活為C3d等，紅細胞膜上形成穩(wěn)定的補體C3d-C3d受體復合物。此時紅細胞標本加人抗補體抗體，可出現(xiàn)凝集反應[10]。臨床上諸多疾病患者均可表現(xiàn)出不同程度的黃疸、肝脾腫大等貧血癥狀，且部分疾病可引起DAT陽性[11,12]，而DAT陽性表明患者紅細胞表面致敏了不完全抗體和(或)補體，DAT陽性患者可出現(xiàn)新生成紅細胞又被致敏破壞，或患者紅細胞被破壞的速度快于機體造血而造成不同程度貧血[13]。這說明抗人球蛋白試驗在相關疾病診斷及進行輸血治療方面具有一定的臨床價值[5,12]。

本研究檢測的住院貧血患者DAT陽性率為29.2%，高于張小偉等[5]報道的河北承德地區(qū)患者DAT陽性率(14.0%)，考慮可能因素為張小偉等[5]的研究樣本包括了門診及住院患者，而本研究只選擇了住院的貧血患者，故DAT陽性率較高。探討DAT陽性的疾病類型分布，可間接分析造成貧血的原因，本研究DAT陽性患者中，疾病類型分布為AIHA最多為31例(49.2%)，風濕免疫性疾病16例(25.3%)，血液病6例(9.5%)，腫瘤、新生兒溶血病各出現(xiàn)4例(6.3%)，肝臟疾病及其他不明原因DAT陽性各1例(1.6%)。多種疾病諸如SLE、血液病、腫瘤等其DAT陽性結(jié)果可持續(xù)48 h～3個月，而AIHA導致的陽性結(jié)果則會長期存在[5]。AIHA既可作為原發(fā)性疾病單獨存在，也可繼發(fā)于其他疾病，血中有自身抗體和(或)針對自身抗原的致敏淋巴細胞，自身抗體在不同自身免疫病中有交叉或重疊現(xiàn)象；病程慢性遷延，發(fā)作和緩解反復交替，有的成為終身痼疾；組織損害部位有淋巴細胞和漿細胞浸潤，常見嗜酸性粒細胞增多；免疫抑制劑(包括腎上腺皮質(zhì)激素)或手術切除淋巴組織有一定療效[10]。其他繼發(fā)AIHA的疾病如血液系統(tǒng)、風濕類疾病等導致的DAT陽性，其原因主要是紅細胞自身抗體或者免疫復合物黏附在紅細胞膜上，并由于致病因素引起自身抗原的變異及免疫穩(wěn)定性的破壞，致使免疫調(diào)節(jié)功能紊亂而產(chǎn)生[14]。本研究發(fā)現(xiàn)不同的DAT 陽性患者中AIHA 和風濕免疫性疾病明顯高于其他病種，與文獻報道[14]一致。

DAT的作用在于評估獲得性溶血性貧血病因，不能用來測定溶血存在與否，甚至少數(shù)AIHA患者的DAT是陰性的，另據(jù)報道DAT陽性反應發(fā)生率也占無溶血性貧血住院患者的8%[10]。DAT陽性患者與其紅細胞附著抗體的種類、補體也有關聯(lián)，文獻報道AIHA患者中單獨IgG型主要為繼發(fā)性因素，病因包括感染、藥物誘發(fā)、自身免疫性疾病等[15]，報道顯示單獨IgG型在溫抗體型AIHA中占20%[10]；單獨C3d陽性主要為冷凝集素綜合征，是伴有冷反應性自身抗體的身免疫性溶血性貧血中最常見的一種類型，占免疫性溶血性貧血的16%～32%[10]， 其發(fā)病分為急性及慢性，急性常繼發(fā)于淋巴組織增生癥(如淋巴瘤)或肺炎支原體感染，慢性的常發(fā)生在老年人有輕度到中等程度溶血，冷凝集素綜合征為細胞首先被C3的C3d補體致敏，患者是否溶血取決于其免疫狀態(tài)[16]；抗-IgG和抗-C3d同時陽性以混合型AIHA為主，混合型AIHA在急性情況常常伴有十分低的血紅蛋白濃度特性出現(xiàn)，可為原發(fā)的或繼發(fā)，常常與系統(tǒng)性紅斑狼瘡有關，特別需注意的是系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者在其紅細胞上有補體致敏，甚至不存在明顯溶血，但當系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者繼發(fā)成為AIHA，則表明患者紅細胞上已經(jīng)致敏了補體和IgG[10]，混合型AIHA其產(chǎn)生自身抗體和補體，作用于紅細胞膜上，導致紅細胞破壞增多而引起的溶血性貧血，由于輸入的紅細胞將很快被破壞清除，其改善機體缺氧的效果是短暫的，通常不主張輸血[17]，僅在需要時給予，以維持足夠的輸氧作用。

如急慢性貧血患者需要輸注紅細胞，一般需通過增加患者的Hb濃度來提高其血液攜氧能力[18]。Hb水平低于參考區(qū)間下限可作為貧血的診斷標準，不同的Hb含量則部分體現(xiàn)了貧血患者處在不同的病程。本研究發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白含量在50～59 g/L范圍內(nèi)的貧血患者接受輸血治療其血紅蛋白不見增加或是提高不明顯的可能性更大。且63例DAT陽性患者接受輸血次數(shù)均為2次及以上，超過DAT陰性患者，說明DAT陽性對臨床輸血治療效果有一定影響，所以應更加注重去除造成DAT陽性的因素，以保障臨床對內(nèi)科貧血患者的有效輸血。

綜上所述，DAT陽性是影響患者貧血狀態(tài)的重要因素之一，對于需接受輸血治療的住院貧血患者，特別是血紅蛋白含量在一定范圍內(nèi)的患者在治療過程中更應重視對其進行DAT檢測及分型試驗，分析造成其DAT陽性的因素，以保障臨床有效輸血。由于本研究納入的患者樣本數(shù)量及統(tǒng)計分析的DAT陽性例數(shù)不多，故試驗結(jié)果可能出現(xiàn)系統(tǒng)誤差，需將來進一步擴大樣本量并對更多DAT陽性樣本進行研究。

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056002河北省邯鄲市第一醫(yī)院輸血科(王曉平)；河北省秦皇島市中心血站(楊君青)

楊君青，066000河北省秦皇島市中心血站；

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R 392.7

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1002-7386(2016)18-2796-03

2015-12-12)