N-3多不飽和脂肪酸的抗炎效應對C57BL/6-PD-1-/-基因敲除小鼠心房電重構(gòu)的影響

付國強　曹義戰(zhàn)　仲月霞　田小溪　王伯良

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N-3多不飽和脂肪酸的抗炎效應對C57BL/6-PD-1-/-基因敲除小鼠心房電重構(gòu)的影響

付國強曹義戰(zhàn)仲月霞田小溪王伯良

目的：觀察N-3多不飽和脂肪酸(PUFAs)飼養(yǎng)對C57BL/6-PD-1-/-小鼠體內(nèi)炎癥和心房電重構(gòu)的影響。方法：觀察和比較C57BL/6、PD-1-/-和PUFAs組小鼠的血清炎性細胞因子表達水平和心房有效不應期。結(jié)果：與C57BL/6組小鼠相比，PD-1-/-組小鼠血清白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、腫瘤壞死因子(TNF)和 γ干擾素(IFN-γ)水平明顯升高，同時PD-1-/-小鼠右心耳、右房低側(cè)壁、右房高側(cè)壁、右房游離壁心房肌有效不應期明顯縮短；PUFAs組小鼠血清炎性細胞因子水平較C57BL/6小鼠組大部分仍升高，但升高趨勢較PD-1-/-組得到一定程度的遏制， PUFAs組心房有效不應期和C57BL/6組相比無統(tǒng)計學差異。與PD-1-/-組相比，PUFAs組血清炎性細胞因子水平均明顯降低，心房有效不應期明顯延長。結(jié)論：PD-1基因敲除后C57BL/6小鼠體內(nèi)炎性細胞因子水平明顯升高，并出現(xiàn)心房有效不應期縮短， N-3多不飽和脂肪酸飼養(yǎng)能夠遏制這種變化趨勢。

PD-1基因敲除；炎性細胞因子；心房電重構(gòu)；心房顫動；N-3多不飽和脂肪酸

心房顫動(房顫)是臨床最常見的心律失常，流行病學研究發(fā)現(xiàn),房顫在普通人群中的發(fā)病率約為2%，在80歲以上人群中的發(fā)病率超過9%[1]。房顫患者腦卒中、心力衰竭及全因死亡率均明顯升高[2]。近年來的流行病學和病例對照研究均提示，炎癥可能是房顫的致病因素[3]，但具體機制不明確。心房的電重構(gòu)能夠通過多種機制使心房內(nèi)易于形成多發(fā)折返環(huán)，是房顫發(fā)生的病理生理機制之一[4]。

程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)是T細胞表面的CD28家族重要的負性共刺激因子，PD-1基因的缺失可以增強T細胞活性，提高體內(nèi)的炎癥水平[5]。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1基因敲除小鼠心臟局部有大量的炎性細胞浸潤[6]，甚至出現(xiàn)致死性心肌炎[7]。

研究表明，在飼料中添加N-3多不飽和脂肪酸能夠降低實驗動物體內(nèi)系統(tǒng)性炎癥水平[8]。在本研究中，我們對比觀察C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1-/-小鼠和N-3多不飽和脂肪酸飼養(yǎng)的C57BL/6-PD-1-/-小鼠血清炎性細胞因子的表達，檢測3組小鼠心房肌有效不應期的改變，探討炎癥及抗炎治療對心房電重構(gòu)的影響。

1　材料和方法

1.1實驗動物

C57BL/6-PD-1-/-小鼠由日本京都大學的Tasuku Honjo教授贈送，該模型主要用于研究炎癥及免疫機制在疾病中的作用。實驗分為3組：C57BL/6小鼠組、C57BL/6-PD-1-/-小鼠組(PD-1-/-組)和N-3多不飽和脂肪酸飼養(yǎng)的C57BL/6-PD-1-/-小鼠組(PUFAs組)，每組20只，均為雄性，6～8周齡。實驗前均飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部神經(jīng)生物教研室SPF級實驗動物中心。實驗開始前4周，PUFAs組小鼠的飼料添加二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，5 mg/d。

1.2實驗方法

1.2.1血清不飽和脂肪酸水平檢測通過氣相色譜法檢測血清不飽和脂肪酸[9]。摘眼球法獲取實驗動物血液約2 mL，800轉(zhuǎn)/min離心5 min，吸取血清100 μL，加入無水甲醇-苯-氫氧化鈉，混勻后靜置20 min，再加入0.5 mmol/L甲醇-鹽酸1 mL，充分混勻，4500轉(zhuǎn)/min離心15 min，取環(huán)己烷層，得到甲酯化的脂肪酸。應用日本島津公司GC/MS-QP2010 氣相色譜儀對脂肪酸甲酯化產(chǎn)物進行分析，測定血清N-3多不飽和脂肪酸水平。

1.2.2流式細胞儀微球芯片捕獲技術(shù)檢測炎性細胞因子表達應用鼠Th1/Th2/TH17細胞因子檢測試劑盒(BD Bioscience)同時檢測7種細胞因子即白細胞介素(IL)-2、IL-4、 IL-6、IL-10、IL-17A、腫瘤壞死因子(TNF )和 γ干擾素(IFN-γ)。該試劑盒可以檢測出血清中pg級別的炎性細胞因子。其原理是先將不同捕獲抗體包被在不同熒光強度的微球上形成捕獲微球，然后和待測樣品溶液混合，微球上的特異性抗體與血清中相應的抗原或蛋白結(jié)合，再加入熒光標記的檢測抗體，形成“三明治”夾心復合物，在流式細胞儀上進行檢測，通過微球上不同的熒光強度來區(qū)分細胞因子。

摘眼球法取實驗動物血約1 mL，800轉(zhuǎn)/min離心5 min，吸取血清50 μL和PE標記的檢測抗體和捕獲微球在避光和室溫條件下共孵育2 h，緩沖液清洗未結(jié)合的抗體，重懸于250 μL緩沖液中上機檢測。選擇獲取模式，分辨率為1024；設(shè)獲取細胞數(shù)為 R1門內(nèi)10000個，保證每一種細胞因子的捕獲微球都能獲取大約300個；獲取數(shù)據(jù)時流速為中速。在本研究中微球上的熒光強度在氬激光器激活下于650 nm達到峰值，在BD FACScalibur流式細胞儀通過FL4檢測。PE熒光標記的血清樣本熒光強度在FL2檢測。

嚴格按照試劑盒使用說明中的步驟制備標準品，通過專用的分析軟件，獲取炎性細胞因子標準曲線，用于量化分析檢測樣品中每一種細胞因子，本研究中定標后標準曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)均>0.99。

1.2.3心房肌有效不應期檢測按參考文獻[10]的方法檢測小鼠心房肌有效不應期。各組小鼠均通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉。麻醉完成后給予氣管插管和呼吸機輔助呼吸，在右側(cè)第4肋間隙開胸，將自制電極依次放置在右心房的心耳(RAA)、高側(cè)壁(HRA)、低側(cè)壁(HLA)和游離壁(ARA)。在機械通氣過程中，動脈血氣pH值調(diào)整在7.35～7.45。

心房有效不應期的檢測在100 ms周期進行,每6次S1刺激后附加一次額外刺激S2，最初的額外刺激偶聯(lián)間期設(shè)定在30 ms，偶聯(lián)間期設(shè)定為每6次刺激遞增5 ms，直到額外的刺激導致一次心房捕獲。然后將額外刺激周期減少5 ms后，再每次遞增1 ms，直至再次發(fā)生心房捕獲，將沒有導致心房捕獲的最長的S1S2間期確定為心房有效不應期。

1.3統(tǒng)計學處理

應用SPSS統(tǒng)計軟件對資料進行分析，實驗數(shù)據(jù)比較應用單因素方差分析，以P<0.05為學意義差異。

2　結(jié)果

2.1血清不飽和脂肪酸相對濃度的變化

與C57BL/6組比較，血清不飽和脂肪酸相對濃度在PD-1-/-組未見明顯升高(P>0.05)，經(jīng)過4周N-3多不飽和脂肪酸喂養(yǎng)后，PUFAs組血清不飽和脂肪酸相對濃度較PD-1-/-組和C57BL/6組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

2.2炎性細胞因子

與C57BL/6組相比，血清炎性細胞因子在PD-1-/-組明顯升高(P<0.05)，PUFAs組血清炎性細胞因子與C57BL/6組相比，IL-2無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，其余炎性細胞因子仍明顯升高(P<0.05)，但幅度降低。與PD-1-/-組相比，PUFAs組的各種細胞因子水平均明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.3心房有效不應期檢測

檢測了右心耳(RAA)、右房低側(cè)壁(LRA)、右房高側(cè)壁(HRA)、右房游離壁(ARA)的心房有效不應期(AERPs )，PD-1-/-小鼠組心房有效不應期均較C57BL/6組縮短，而PUFAs組這一趨勢得到明顯遏制，相比PD-1-/-組明顯延長(P<0.05)，與C57BL/6組對比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表3。

表1　3組小鼠血清中不同不飽和脂肪酸成分的變化/%

注：N-3 PUFAs 為N-3多不飽和脂肪酸，EPA為二十碳五烯酸，DHA為二十二碳六烯酸。與PD-1-/-組比較，(1)P<0.01；與C57BL/6組比較，(2)P<0.01

表2　3組小鼠血清炎性細胞因子水平比較/pg·mL-1

注：與C57BL/6組比較，(1)P<0.01 ，(2)P<0.05；與PD-1-/-組比較，(3)P<0.01，(4)P<0.05；與C57BL/6組比較，(5)P<0.05

表3　3組小鼠心房有效不應期比較/ms

注：與C57BL/6組比較，(1)P<0.01，(2)P<0.05；與PD-1-/-組比較，(3)P<0.05

3　討論

炎癥參與了心房電重構(gòu)，炎性細胞因子導致心臟局部組織炎癥反應，使心房肌細胞出現(xiàn)變性、壞死、凋亡，促進心房肌纖維化及瘢痕形成。心肌纖維化及心肌疤痕形成被認為是心房肌電生理的非均一性和各向異性增加及傳導速度減慢的病理學基礎(chǔ)[11]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，心臟外科手術(shù)后伴隨的炎癥狀態(tài)能夠影響心房組織的電結(jié)構(gòu)，且炎癥程度與心房電傳導的不均一性、房顫的維持時間呈正相關(guān)[12]。在這一過程中，炎性細胞因子發(fā)揮著重要作用，過度表達的腫瘤壞死因子α(TNF-α)能夠下調(diào)連接蛋白40[13]、Kv4.2、Kv4.3、Kv1.5 和 KChIP-2離子通道的表達[14-15]，下調(diào)連接蛋白40可降低心臟傳導，使房性心律失常的易感性增加。而鉀離子通道相關(guān)蛋白生成的減少能夠減低相應的鉀電流活動，降低心房有效不應期。

PD-1是屬于CD28家族的負性共刺激因子，它可以誘導表達于CD8+和CD4+T細胞、自然殺傷細胞、B細胞以及活化的單核細胞。 PD-1基因敲除后會引起T細胞易于激活，從而提高機體炎癥水平[16]。本研究中，盡管3組實驗動物生活環(huán)境相同，但環(huán)境中的病原體(細菌、病毒等)能夠更大程度地激活PD-1-/-組小鼠體內(nèi)的炎性過程，使其血清中出現(xiàn)了高水平的細胞因子。

研究表明N-3多不飽和脂肪酸預處理可以減少TNF-α及IL-10的生成[17-18]，在培養(yǎng)基中額外添加N-3多不飽和脂肪酸能夠明顯減少IL-6[19]、IL-1β[20]、IL-8[21]的生成。本實驗PUFAs組小鼠炎性細胞因子水平降低，再次證明不飽和脂肪酸的抗炎作用。

心房電重構(gòu)引起的電生理變化是房顫發(fā)生和維持的電生理基礎(chǔ)[22]。心房有效不應期的縮短和有效不應期離散度的增加能夠促進心房內(nèi)多發(fā)折返環(huán)生成，從而使得房顫易于發(fā)生[23]。本實驗發(fā)現(xiàn)，和C57BL/6組相比，PD-1-/-組小鼠血清炎性細胞因子升高，心房有效不應期縮短。通過在飼料中添加N-3多不飽和脂肪酸，PUFAs組小鼠血清炎性細胞因子升高趨勢得到明顯遏制，同時心房有效不應期縮短趨勢也明顯降低。由于心房電重構(gòu)和房顫發(fā)病易感性的密切關(guān)系，我們推斷N-3多不飽和脂肪酸能夠通過其抗炎效應遏制炎性細胞因子生成，影響心房電重構(gòu)，具有一定的預防和治療房顫的作用。

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(收稿：2015-11-30修回：2016-05-18 )

(本文編輯：丁媛媛)

N-3 polyunsaturated fatty acids prevents atrial electrical remodeling by inhibiting inflammation in C57BL/6-PD-1-/-mice

FU Guoqiang,CAO Yizhan ，ZHONG Yuexia， TIAN Xiaoxi ，WANG Boliang.

Department of Emergency,Tangdu Hospital,Fourth Military Medical University,ShanXi710038,China

Objective:To investigate the effect of dietary N-3 polyunsaturated fatty acids on the inflammation and atrial electrical remodeling in C57BL/6-PD-1-/-mice.Methods:The expression of inflammatory cytokines and the atrial effective refractory periods (AERPs) in C57BL/6,PD-1-/-and PUFA groups were observed and compared.Results:The interleukin (IL)-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-17A,tumor necrosis factor(TNF) and γ-interferon (IFN-γ) were significantly increased in PD-1-/-group compared with C57BL/6 group; meanwhile,the PD-1-/-micegroup appeared significantlyshorter AERPs in the right atrial appendage,low lateral wall,high lateral wall and free wall of right atrium compared with C57BL/6 group.Most of the inflammatory cytokines in PUFAs group mice still rose compared with C57BL/6 mice,but the rising trend had a certain degree of containment compared with PD-1-/-mice; at the same time the AERPs in PUFAs mice had no statistical difference compared with C57BL/6 mice.The PUFA group demonstrated asignificantly lower inflammatory cytokine level and longer AERPs compared with PD-1-/-group.Conclusion:Our findings strongly support that the inflammatory cytokines levels increase significantly in PD-1-/-mice,at the same time PD-1-/-mice appear significantly shorter AERPs,dietary anti-inflammation drug N-3 PUFA supplementation can curb this trend.

PD-1 deficiency； Inflammatory cytokines；Atrial electricity remodeling； Atrial fibrillation; N-3 polyunsaturated fatty acids

國家自然科學基金 (81070161)

710038西安，第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院急診科

王伯良，Email:wliang@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.04.013