H10N8禽流感病毒血凝素中和抗體的結合位點鑒定

胡金芳，孫春昀，饒木頂，謝良志

1中國醫(yī)學科學院　北京協(xié)和醫(yī)學院　細胞工程中心，北京 1000052神州細胞工程有限公司新藥研發(fā)部，北京 1001763北京義翹神州生物技術有限公司生物分子研發(fā)部，北京 100176

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·論著·

H10N8禽流感病毒血凝素中和抗體的結合位點鑒定

胡金芳1，孫春昀2，饒木頂3，謝良志1

1中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院細胞工程中心，北京 1000052神州細胞工程有限公司新藥研發(fā)部，北京 1001763北京義翹神州生物技術有限公司生物分子研發(fā)部，北京 100176

目的制備并篩選H10N8型禽流感病毒血凝素蛋白的中和抗體，并對其抗原結合位點進行鑒定。方法采用基因工程技術制備H10N8血凝素蛋白單克隆抗體,通過假病毒微量中和實驗篩選中和抗體，ELISA和Western blot實驗確定抗體結合血凝素蛋白的區(qū)域，Discovery Studio 3.5模擬與對接分析軟件預測抗原結合位點，進而研究其在H10亞型內(nèi)的保守性。結果獲得1株具有假病毒中和活性的H10N8單克隆抗體，該抗體的結合表位在HA1上，且具有H10亞型內(nèi)的保守性。結論成功制備1株中和抗體，為H10N8禽流感疫苗和單克隆藥物的研究提供了基礎。

H10N8禽流感病毒；血凝素蛋白；中和抗體；表位

ActaAcadMedSin，2016,38(4)：404-410

2013年冬至2014年，江西省報道了3例H10N8型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)感染人的病例，其中2例死亡，相關的研究顯示江西和廣東活禽市場的部分從業(yè)人員和動物體內(nèi)也攜帶H10N8病毒[1- 3]。雖然H10N8未達到H5N1的爆發(fā)率和高致死率，但是AIV能夠通過抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)變產(chǎn)生新的亞型，改變病毒的細胞嗜性，擴大宿主范圍，從而獲得跨越種屬屏障引發(fā)流感大流行的潛力[4]，對畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生事業(yè)存在潛在的威脅。目前對H10亞型AIV的研究并不深入，缺乏有效的防治手段，傳統(tǒng)的抗流感病毒藥物有口服生物利用度低、快速選擇耐藥性病毒等不良反應，而疫苗的生產(chǎn)則往往滯后于流感爆發(fā)。相比而言，病毒中和抗體能夠阻斷病毒和宿主細胞表面特異性受體的結合，干擾病毒包膜與宿主細胞膜的融合，并且可以通過激活補體[5]、促進效應細胞清除病毒或殺傷被感染的細胞等免疫機制抵御流感病毒[6]，具有較高的研究和利用價值。本研究利用H10N3_HA蛋白免疫動物獲得對H10N8型AIV具有中和活性的單克隆抗體，并對其結合表位進行初步預測，旨在為以后的抗體治療奠定基礎。

材料和方法

材料日本大耳白兔(北京金牧陽實驗動物養(yǎng)殖有限責任公司)；SfiI、NotI(美國Fermentas)；Sinofection?轉(zhuǎn)染試劑，HEK293E細胞，H10N3_HA(Cat. 11693-V08H)、H10N3_HA1(Cat.11693-V08H1)、H10N8_ HA(Cat.40359-V08B)、H10N8_HA1(Cat.40359-V08H1)，轉(zhuǎn)移載體pwpxl-luc，包裝載體psd，包膜載體pCMV-H10N3-HA，包膜載體pCMV-H10N8-HA(北京義翹神州生物技術有限公司)；293T/17人胚腎細胞系(ATCC)；293FT人胚腎細胞系(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心)；豚鼠血紅細胞(中國食品藥品檢定研究院動物實驗室)；細胞裂解液、熒光素酶檢測系統(tǒng)(美國Promega公司)；MG96-PCR儀(杭州朗基科學儀器有限公司)；OctetRED生物芯片系統(tǒng)(美國Pall Corporation)。

單克隆抗體的制備及篩選H10N3_HA蛋白免疫日本大耳白兔，獲得高滴度免疫效價。取脾用TRIzol試劑盒 (美國Invitrogen)抽提總RNA，以Oligod T為引物用SuperScript Ⅲ 第一鏈合成系統(tǒng)(美國Invitrogen；Cat. 18080051)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用兔抗體框架區(qū)引物對從cDNA中擴增獲得抗體的Vκ、Vλ和 VH。將純化后的VL(Vκ+ Vλ) 和VH基因片段做為模板，用重疊延伸PCR技術在VH和VL之間引入連接子，擴增獲得編碼單鏈可變區(qū)片段(scFv)的基因。將scFv片段用SfiI和NotI雙酶切后通過T4 DNA Ligase(日本TaKaRa；Cat. 2011B)連接到pCANTAB5E (美國GE Healthcare)載體上，構建成抗體噬菌體展示文庫。在該載體上，scFv被插入到外殼蛋白結構基因Ⅲ前，形成scFv和gⅢ的融合蛋白展示在噬菌體的表面。scFv構建過程和表達載體圖譜見圖1。將構建成的噬菌體抗體文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中擴增，加入VCSM1輔助噬菌體，獲得噬菌體抗體庫。以H10N8蛋白為固相抗原進行“吸附-洗脫-擴增”篩選，對分析出的陽性抗體測序。將抗體的可變區(qū)分別與兔κ和IgG恒定區(qū)相連接，構建成完整抗體表達載體。利用Sinofection?轉(zhuǎn)染試劑將單個抗體的輕重鏈表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK293E細胞中表達，采用蛋白A柱親和純化后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)鑒定。

抗體與HA和HA1的結合實驗利用ELISA和Western blot檢測抗體與HA和HA1的結合作用，分別從構象表位和線性表位對抗原抗體結合進行分析。

ELISA結合活性實驗：抗體稀釋到2 μg/ml，100 μl/孔包被酶標板，4℃過夜。將H10N3_HA、H10N3_HA1、H10N8_HA、H10N8_HA1蛋白和陰性對照(一株帶his標簽的與流感無關蛋白，Sino Biological Inc.)分別稀釋為0.3、0.1、0.033、0.011、0.0037 μg/ml，100 μl/孔加入酶標板，室溫作用1 h，洗液洗板3次。然后加入0.5 μg/ml辣根過氧化物酶標記的C-his(Sino Biological Inc.)，100 μl/孔，室溫孵育1 h后顯色終止，測定450 nm處的光密度值。

Western blot實驗：H10N3_HA、H10N3_HA1、H10N8_HA、H10N8_HA1蛋白經(jīng)13%SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，蛋白上樣量均為1 μg，將稀釋到5 μg/ml的待鑒定抗體與剪切膜室溫孵育2 h，洗膜3次，加入山羊抗兔IgG(H+L)抗體(DyLight 800-Labeled；美國KPL公司)，使用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Odyssey；美國LI-COR公司)顯色。

VH：重鏈可變區(qū)；VL：輕鏈可變區(qū)；scFv：單鏈可變區(qū)片段

VH：H variable fragment of heavy chain；VL：L variable fragment of light chain；scFv：single-chain variable fragments

圖 1scFv構建過程和表達載體示意圖

Fig 1Schematic illustration of the amplification of scFv-encoding genes and the expression vector

Octet RED親和活性分析將生物素標記的H10N3_HA、H10N3_HA1、H10N8_HA、H10N8-HA1蛋白稀釋到4 μg/ml，抗體稀釋為終濃度5 μg/ml。設置OctetRED檢測程序，按照PBS緩沖液、生物素標記的蛋白、PBS緩沖液、待測抗體、PBS緩沖液的順序點樣，每次250 μl/孔，依次測定出抗體和各抗原的親和力。

血凝抑制活性鑒定將H10N3_HA、H10N8_HA蛋白按不同起始濃度2倍梯度連續(xù)稀釋加入96孔血凝板中，50 μl/孔，然后每孔50 μl加入1%豚鼠血紅細胞(豚鼠血紅細胞用100倍體積的生理鹽水稀釋，得到1%豚鼠血紅細胞)，室溫靜置1 h，測定各個蛋白的血凝效價[7]?？贵w2倍梯度連續(xù)稀釋加入血凝板中，25 μl/孔，然后分別加入4個凝血單位的血凝素蛋白，25 μl/孔，室溫孵育1 h，最后每孔50 μl加入1%豚鼠血紅細胞，室溫靜置1 h，以100%抑制凝集的最大稀釋度為該抗體的血凝抑制滴度。

假病毒微量中和實驗將含有熒光素酶報告基因的轉(zhuǎn)移載體pwpxl-luc、包裝載體psd、包膜載體pCMV-H10Nx-HA(H10Nx為H10N3或H10N8)按8∶4∶1比例混合，然后將轉(zhuǎn)染試劑Sinofection?按2.4 μl∶1 μg的比例和質(zhì)?；旌?，多質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T/17人胚腎細胞株包裝假病毒pseudo-H10N3和pseudo-H10N8。轉(zhuǎn)染后48 h收細胞上清，用0.45 μm濾膜過濾，濾液中加入50 μg/ml甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理的胰蛋白酶(美國Sigma-Aldrich)，37℃孵育45 min后感染293FT細胞，計算半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(tissue culture infective dose，TCID50)，以100×TCID50/孔作為中和實驗的感染劑量。中和實驗中，4倍體積100×TCID50的假病毒和1倍體積的不同稀釋濃度的抗體混合，4℃孵育1 h后加入接種293FT的96孔板中；感染48 h，吸出培養(yǎng)基，加入50 μl細胞裂解液，靜置2 min后將孔板中的細胞裂解液吸取40 μl加入到白色不透明的96孔檢測板中，按照化學發(fā)光儀(德國Berthold Technologies)和熒光素酶檢測試劑(美國Promega)的操作流程進行檢測。

結合表位對接分析Protein Data Bank(PDB)檢索H10N8_HA序列并分析，鑒定H10N8_HA和抗體的同源性。用Discovery Studio 3.5構建H10N8_HA(A/Jiangxi-Donghu/346/2013，PDB entry：4XQ5)[8]和抗體的同源模型，抗體Fab的三維結構由3個獨立的結構模型作為輕鏈模板、重鏈模板和界面模板構建。其中輕鏈模板是埃博拉病毒糖蛋白肽表位抗體Fab片段13F6- 1- 2 (PDB entry：2QHR)的輕鏈[9]，重鏈模板是兔單抗Fab片段M204 (PDB entry： 4HBC)的重鏈[10]，工作界面模板來自埃博拉病毒糖蛋白肽表位抗體Fab片段13F6- 1- 2 (PDB entry： 2QHR)，最后通過MODELLER模塊統(tǒng)計空間限制完成相關蛋白結構模型的優(yōu)化[11]，生成H10N8_HA和抗體的同源模型和環(huán)區(qū)模型。整體模型利用Discovery Studio 3.5的CHARMm進一步優(yōu)化[12]，H10N8_HA和抗體的分子對接過程由ZDock[13]和RDock[14]模塊執(zhí)行，對接模型潛在的抗體表位分析由分析交互模塊完成。

結　　果

H10N8中和單抗的SDS-PAGE鑒定制備出一株兔單抗，命名為R110，理論相對分子質(zhì)量為150 000左右，由于糖基化的原因，非還原SDS-PAGE顯示抗體R110的實際相對分子質(zhì)量為190 000～195 000；還原SDS-PAGE在50 000和27 000附近存在條帶，分別為抗體的重鏈和輕鏈(圖2)。

ELISA結合活性結果包被在酶標板上的抗體R110能與不同濃度的HA和HA1蛋白結合，而與陰性對照無結合(圖3)，抗體的結合量隨著HA和HA1蛋白濃度的升高而不斷增加，并最終達到飽和，從而證實抗體能夠和血凝素蛋白特異性結合。

免疫印跡分析抗體對HA和HA1蛋白的識別在還原SDS-PAGE上，HA蛋白的條帶在60 000～70 000，HA1蛋白在40 000～45 000(圖4)，抗體和4種蛋白都有結合，顯示抗體結合位點在HA1上。

Octet RED親和分析結果抗體R110與4株血凝素蛋白的Octet RED親和結合見圖5，KD值分別為：7.32×10-10mol/L (H10N3_HA)、1.76×10-11mol/L(H10N3_HA1)、2.01×10-10mol/L (H10N8_HA)、3.11×10-12mol/L(H10N8_HA1)，顯示抗體對HA及HA1蛋白均有較高的親和力。

Mr：相對分子質(zhì)量；1、3：marker；2：單抗R110的非還原電泳條帶；4：單抗R110的還原電泳條帶

Mr： relative molecular mass；1，3： marker；2： monoclonal antibody R110 under non-reducing condition；4： monoclonal antibody R110 under reducing condition

圖 2單抗R110非還原和還原十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖

Fig 2Analysis of monoclonal antibody R110 by non-reducing and reducing sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis

血凝抑制實驗結果抗體R110與4個凝血單位(4HAU)的血凝素蛋白孵育后加入1%豚鼠血紅細胞產(chǎn)生血凝抑制效應，表明HA與受體的結合被阻斷，100%抑制H10N3_HA(4HAU：2.0 μg/ml)和H10N8_HA(4HAU：1.4 μg/ml)的濃度分別為2.8 μg/ml、0.63 μg/ml(重復3次平行實驗，3個復孔不一致時，取濃度高的1個作為該抗體的效價)。

假病毒微量中和實驗結果通過熒光素酶表達量的高低對假病毒感染細胞的活性進行間接判斷。48 h后相對熒光素酶測定顯示，100 μl H10N3假病毒和H10N8假病毒上清液感染靶細胞后平均相對熒光素酶的值分別為4×105和1×106，具有極高的感染活性。加入抗體R110后，隨著抗體濃度的增加，假病毒的感染性下降，表明抗體具有阻止假病毒感染的中和活性。定義病毒中和率(%)=[1-(實驗孔相對熒光素酶活性均值-細胞對照相對熒光素酶活性均值)/(病毒對照相對熒光素酶活性均值-細胞對照相對熒光素酶活性均值)]×100%?？贵wR110對H10N3和H10N8兩種假病毒均有較高的中和活性，當抗體濃度達到約100 ng/ml時，病毒中和率達到接近100%的平臺區(qū)(圖6)。

NC：陰性對照

NC：negative control

A.H10N3；B.H10N8

圖 3單抗R110與HA及HA1蛋白的ELISA結合活性

Fig 3The analysis of binding function for monoclonal antibody R110 with HA and HA1 protein by ELISA

1：marker；2：R110對H10N3_HA的識別；3：R110對H10N3_HA1的識別；4：R110對H10N8_HA的識別；5：R110對H10N8_HA1的識別

1：marker；2：R110 against H10N3_HA；3：R110 against H10N3_HA1；4：R110 against H10N8_HA；5：R110 against H10N8_HA1

圖 4Western blot分析單抗R110對HA和HA1的識別

Fig 4Western blot for monoclonal antibody R110 binding to HA and HA1 protein

結合表位對接分析結果構建抗體R110與H10N8_HA的對接模型(圖7)，并分析潛在的抗體結合表位(圖8)，表位區(qū)域預測為：Pro172-Arg179(PQTTNTYR)、Ser196-Asn202(SSTQEKN)、Ala229-Ser237(ARPQVNGQS)。

根據(jù)H10亞型血凝素基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹，從NCBI查找該亞型內(nèi)(H10N1-H10N9)每個亞型的一條代表性HA蛋白序列(H10N1：A/wild bird/Korea/A12/2010；H10N2：A/avian/Israel/824/2005；H10N3：A/duck/Hong Kong/786/1979；H10N4：A/wild bird/Korea/A01/2011；H10N5：A/duck/Mongolia/149/03；H10N6：A/long-tailed duck/Wisconsin/10 OS3919/2010；H10N7：A/goose/Guizhou/829/2012；H10N8：A/Jiangxi/IPB13/2013；H10N9：A/chicken/Jiangsu/RD5/2013)，用BioEdit進行多序列比對(圖9)，結果表明上述位點具有亞型內(nèi)的保守性。

討　　論

AIV傳播給人的必要條件之一是能夠感染人體內(nèi)的宿主細胞，并進行有效的繁殖，其細胞嗜性及宿主范圍主要由病毒的HA決定[16]，HA是AIV重要的表面抗原糖蛋白，能識別并結合宿主細胞表面的唾液酸受體，介導病毒外膜與細胞內(nèi)小體膜的融合，在病毒感染宿主細胞的吸附、注入和跨膜過程中發(fā)揮關鍵作用，是禽流感疫苗、中和抗體和診斷試劑的重要靶點[17]。HA蛋白由HA1和HA2兩個亞單位通過富含堿性氨基酸的裂解區(qū)域連接，以三聚體的形式鑲嵌在病毒囊膜的雙層類脂膜中。HA三聚體由兩部分構成，一部分是3個HA1單體構成的球狀頭部，另一部分是3個HA2單體及HA1剩余部分組成的柄部，其中球狀頭部區(qū)域含有受體結合位點和抗原決定簇，能夠識別細胞膜表面唾液酸受體，在病毒感染的預防和治療中具有重要的意義。

圖 5R110與生物素標記的H10N3_HA蛋白(A)、H10N3_HA1蛋白(B)、H10N8_HA蛋白(C)和H10N8_HA1蛋白(D)的親和活性

Fig 5Affinity of R110 with biotinylated H10N3_HA(A)，H10N3_HA1(B)，H10N8_HA(C) and H10N8_HA1(D)

圖 6單抗R110對H10N3和H10N8假病毒的微量中和作用

Fig 6Neutralization by monoclonal antibody R110 against pseudo-H10N3 and pseudo-H10N8

紅色：抗體Fab模型；綠色：H10N8-HA結構模型

red color：model of monoclonal antibody Fab；green color：model of H10N8_HA

圖 7R110與H10N8-HA 對接模型

Fig 7Molecular docking of H10N8_HA and monoclonal antibody R110 model

圖 8抗原結合表位預測(黃色區(qū)域為預測抗體結合表位)

Fig 8Prediction of epitopes on antigen(the yellow region is the predicted epitopes on antigen)

A： Pro172-Arg179(PQTTNTYR)；B： Ser196-Asn202(SSTQEKN)；C： Ala229-Ser237(ARPQVNGQS)

圖 9H10亞型內(nèi)預測結合表位的保守性比較

Fig 9Comparing the conservation of predicted epitopes in H10 subtypes

本研究利用HA蛋白免疫兔子產(chǎn)生H10N8血凝素抗體，免疫動物所用的蛋白為哺乳動物細胞表達，具有糖基化等細胞修飾，其生物學特性與天然蛋白相似，并且能排除病毒中其他蛋白組分的干擾，與病毒免疫相比更安全，得到中和抗體的概率也更高。假病毒中和實驗結果表明該抗體具有中和活性，能夠阻止病毒侵入細胞，另外，抗體能夠抑制H10N8_HA蛋白的凝血作用，顯示其與血凝素蛋白的結合位點可能在HA1亞基上。在此基礎上，利用Western blot和ELISA分析抗體R110對HA和HA1蛋白的結合活性，進一步證明該抗體與HA1亞基結合。

HA蛋白變異性很強，由于抗原漂移的高頻發(fā)生，大多數(shù)的中和抗體只能識別特定的流感病毒亞型，本研究顯示單抗R110對H10N3禽流感病毒也具有中和活性。根據(jù)抗體序列，利用Discovery Studio 3.5模擬與對接分析程序預測潛在的抗原結合表位，然后選擇H10亞型內(nèi)每個亞型的代表性HA序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)抗原結合位點在H10亞型內(nèi)具有保守性，提示可以選擇更多亞型的禽流感毒株進行廣譜中和活性驗證，并進一步鑒定抗原決定簇序列，為相關疫苗和藥物的研制提供基礎。

綜上，本研究獲得的單抗可能具有H10亞型內(nèi)的廣譜中和特性，在H10亞型禽流感的預防和早期治療中具有潛在的臨床應用價值。

[1]Qi W，Su S，Xiao C，et al. Antibodies against H10N8 avian influenza virus among animal workers in Guangdong province before November 30，2013，when the first human H10N8 case was recognized[J]. BMC Med，2014，12：205.

[2]Hu M，Li X，Ni X，et al. Coexistence of avian influenza virus H10 and H9 subtypes among chickens in live poultry markets during an outbreak of infection with a novel H10N8 virus in human in Nanchang，China[J]. Jpn J Infect Dis，2015，68(5)：364- 369.

[3]Su S，Qi W，Zhou P，et al. First evidence of H10N8 avian influenza virus infections among feral dogs in live poultry markets in Guangdong province，China[J]. Clin Infect Dis，2014，59(5)： 748- 750.

[4]Imai M，Watanabe T，Hatta M，et al. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1virus in ferrets[J].Nature，2012，486(7403)：420- 428.

[5]Terajima M，Cruz J，Co MD，et al. Complement-dependent lysis of influenza a virus-infected cells by broadly cross-reactive human monoclonal antibodies[J]. J Virol，2011，85(24)：13463- 13467.

[6]Corti D，Lanzavecchia A. Broadly neutralizing antiviral antibodies [J]. Annu Rev Immunol，2013，31(1)：705- 742.

[7]Wiriyarat W，Lerdsamran H，Pooruk P，et al. Erythrocyte binding preference of 16 subtypes of low pathogenic avian influenza and 2009 pandemic influenza A(H1N1)viruses[J]. Vet Microbiol，2010，146(3- 4)：346- 349.

[8]Zhang H，deVries RP，Tzarum N，et al. A human-infecting H10N8 influenza virus retains a strong preference for avian-type receptors[J]. Cell Host Microbe，2015，17(3)：377- 384.

[9]Lee JE，Kuehne A，Abelson DM，et al. Complex of a protective antibody with its Ebola virus GP peptide epitope： unusual features of a V lambda x light chain[J].J Mol Biol，2008，375(1)： 202- 216.

[10]Arai H，Glabe C，Luecke H. Crystal structure of a conformation-dependent rabbit IgG Fab specific for amyloid prefibrillar oligomers[J].Biochim Biophys Acta，2012，1820 (12)： 1908- 1914.

[11]Sali A，Potterton L，Yuan F，et al. Evaluation of comparative protein modeling by Modeller[J]. Proteins，1995，23(3)：318- 326.

[12]Brooks BR，Bruccoleri RE，Olafson BD，et al.Charmm：a program for macromolecular energy，minimization，and dynamics calculations[J]. J Comput Chem，1983，4(2)：187- 217.

[13]Chen R，Li L，Weng Z. ZDock：an initial-stage protein-docking algorithm[J]. Proteins，2003，52(1)：80- 87.

[14]Li L，Chen R，Weng Z. RDock：refinement of rigid-body protein docking predictions[J]. Proteins，2003，53(3)：693- 707.

[15]Qi W，Zhou X，Shi W，et al. Genesis of the novel human-infecting influenza A(H10N8)virus and potential genetic diversity of the virus in poultry，China[J].Euro Surveill，2014，19 (25)：50- 62.

[16]Rogers GN，Pritchett TJ，Lane JL，et al. Differential sensitivity of human，avian，and equine influenza A viruses to a glycoprotein inhibitor of infection：selection of receptor specific variants[J].Virology，1983，131(2)：394- 408.

[17]SKehel JJ，Wiley DC.Receptor binding and membrane fusion in virus entry：the influenza hemagglutinin[J].Annu Rev Biochem，2000，69(1)：531- 569.

Identification of Epitopes for Neutralizing Antibodies Against H10N8 Avian Influenza Virus Hemagglutinin

HU Jin-fang1，SUN Chun-yun2，RAO Mu-ding3，XIE Liang-zhi1

1Cell Engineering Center，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China2New Drug R&D Department，Sinocelltech Ltd，Beijing 100176，China3Molecular Biology R&D Department，Sino Biological Inc，Beijing 100176，China

XIE Liang-zhiTel：010- 51029808，E-mail： liangzhi@yahoo.com

ObjectiveTo develop neutralizing monoclonal antibodies (MAbs) against H10N8 avian influenza virus hemagglutinin and to identify the binding sites. MethodsMAbs against hemagglutinin of H10N8 avian influenza virus were developed by genetic engineering. Neutralizing MAbs were screened by microneutralization assay，and then tested by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blot to identity the binding sites.The homology modeling process was performed using Discovery Studio 3.5 software，while the binding epitopes were analyzed by BioEdit software. ResultsOne MAb that could neutralize the H10N8 pseudovirus was obtained and characterized. Analysis about epitopes suggested that the antibody could bind to the HA1 region of hemagglutinin，while the epitopes on antigen were conserved in H10 subtypes.ConclusionsOne neutralizing antibody was obtained by this research.The MAb may potentially be further developed as a pre-clinical candidate to treat avian influenza H10N8 virus infection.

avian influenza H10N8 virus；hemagglutinin；neutralizing antibody；epitopes

十二五“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(20142X09102044) Supported by the Key Project of the “Twelfth Five-year Plan”for Medical Science Development of China(20142X09102044)

謝良志電話：010- 51029808，電子郵件：liangzhi@yahoo.com

R373.9

A

1000- 503X(2016)04- 0404- 07

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.04.007

2016- 03- 04)