miR-497靶向Bcl-2調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的研究

張猛　張全　譚雨莎

miR-497靶向Bcl-2調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的研究

張猛張全譚雨莎

目的：探討miR-497靶向Bcl-2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控作用。方法：選取肝癌組織及相應(yīng)遠(yuǎn)癌正常組織，分別采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcriptton PCR，RT-PCR）、Western blot檢測(cè)組織中miR-497及Bcl-2蛋白表達(dá)；選取肝癌細(xì)胞系HepG2，分別轉(zhuǎn)染miR-497 mimics及對(duì)照寡核苷酸，采用RT-PCR、Western blot檢測(cè)組織中miR-497及Bcl-2蛋白表達(dá)，采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)細(xì)胞熒光酶活性。結(jié)果：1）與遠(yuǎn)癌正常組織相比，肝癌組織中miR-497表達(dá)明顯降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.05）；2）與轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸相比，轉(zhuǎn)染miR-497可使HepG2中miR-497表達(dá)增高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；3）與轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸相比，共轉(zhuǎn)染miR-497與Bcl-2-WT可使HepG2熒光素酶活性降低（P＜0.05）；4）轉(zhuǎn)染miR-497后，HepG2增殖活性較轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸明顯降低（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染miR-497+Bcl-2后，HepG2增殖活性較單純轉(zhuǎn)染miR-497明顯提高（P＜0.05）；5）轉(zhuǎn)染miR-497后，HepG2總凋亡比例較轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸明顯增高（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染miR-497+Bcl-2后，HepG2總凋亡比例較單純轉(zhuǎn)染miR-497明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：miR-497可通過(guò)靶向Bcl-2抑制肝癌細(xì)胞增殖同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

miR-497Bcl-2肝癌細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡

肝癌是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，致死率較高［1］。由于難以早期發(fā)現(xiàn)，故僅有少部分患者可行手術(shù)治療［2-3］。放化療是晚期肝癌常用的輔助治療手段，但不良反應(yīng)較大，且無(wú)法獲得長(zhǎng)期生存。因此，尋求更安全、高效的治療方案是臨床亟待解決的問(wèn)題。微小RNA（miRNA）屬于內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其可通過(guò)5'-種子區(qū)與調(diào)控一個(gè)或多個(gè)靶基因mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-untranslated region，3'-UTR）堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而調(diào)控靶基因表達(dá)，進(jìn)而起到類(lèi)似抑癌或促癌基因的作用［4］。miR-497定位于人類(lèi)17p13.1，是近年來(lái)研究較廣泛的miRNA［5］。有研究證實(shí)，miR-497可能在肝癌進(jìn)程中起到類(lèi)似抑癌基因的作用，而靶向Bcl-w可能是其調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖活性的主要機(jī)制［6］。但miR-497是否還可通過(guò)靶向其他下游靶基因參與肝癌的發(fā)生發(fā)展仍不明確。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-497及其下游潛在靶點(diǎn)Bcl-2在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系HepG2中的表達(dá)，分析miR-497靶向Bcl-2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用及分子機(jī)制，旨在為肝癌的臨床治療提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑RNA提取試劑盒、PCR試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（均購(gòu)于美國(guó)ABI公司）；miR-497 mimics、對(duì)照寡核苷酸、Bcl-2 3'-UTR質(zhì)粒（均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司）；MTT、鏈霉素、青霉素（均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司）；相關(guān)抗體（購(gòu)于大連Santa Cruz公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；miR-497、U6引物（由上海生工生物工程有限公司合成）；無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2細(xì)胞及標(biāo)本肝癌細(xì)胞系HepG2（購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）；選取河北大學(xué)附屬醫(yī)院50例肝癌組織及遠(yuǎn)癌正常組織，均為手術(shù)切除的新鮮樣本，并經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)化療。本研究獲得患者知情同意且得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇HepG2，用DMEM培養(yǎng)液（10%胎牛血清+1%雙抗）重懸浮細(xì)胞，并置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)，每天換液1次，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA及總蛋白待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染用DMEM培養(yǎng)液（10%胎牛血清+1%雙抗）將上述對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞密度調(diào)節(jié)至2× 105cells/well，并接種于6孔板中，1 mL/孔，將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)24 h；將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照寡核苷酸組、miR-497 mimics組及miR-497 mimics+Bcl-2組，利用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-497 mimics（50 nmol/L）、對(duì)照寡核苷酸（50 nmol/L）及Bcl-2表達(dá)質(zhì)粒（50 nmol/L）；轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)48 h；常規(guī)收集細(xì)胞總RNA及總蛋白待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分別構(gòu)建含有野生型Bcl-2 3'-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（Bcl-2-WT）和含有突變型Bcl-2 3'-UTR序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（Bcl-2-Mut）。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×105cells/well，并接種于24孔板中，將Bcl-2-WT質(zhì)粒、Bcl-2-Mut質(zhì)粒與miR-497 mimics或?qū)φ展押塑账峁厕D(zhuǎn)染至HepG2，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，將細(xì)胞置于置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)48 h；以海腎質(zhì)粒熒光值作為內(nèi)參，檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，800 r/min離心10 min，棄上清每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）培養(yǎng)4 h，后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入DMSO （100 μL/孔），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)測(cè)OD490nm吸光值。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染結(jié)束后將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用凋亡試劑盒（Annexin-V/PI）進(jìn)行避光染色，1 h后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞總凋亡=早期凋亡細(xì)胞（Annexin-V+/PI-）+晚期凋亡細(xì)胞（Annexin-V+/PI+）。

1.2.6實(shí)時(shí)定量熒光（Real-time PCR）檢測(cè)miR-497表達(dá)收集HepG2、肝癌組織標(biāo)本及遠(yuǎn)癌正常組織樣本，參照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞或組織中的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入SYBR Green法行RT-PCR，以U6為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列Table 1　Primer sequence

1.2.7Western blot法檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)常規(guī)提取細(xì)胞/組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度，取適量樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，5%封閉液4℃封閉4 h，后依次加入一抗（1:2 000）、二抗（1:500）孵育，按ECL試劑盒說(shuō)明書(shū)行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1肝癌組織及遠(yuǎn)癌正常組織中miR-497、Bcl-2表達(dá)及相關(guān)性分析

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-497表達(dá)顯著低于遠(yuǎn)癌正常組織（P＜0.05，圖1）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，肝癌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于遠(yuǎn)癌正常組織（P＜0.05，圖2）。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-497與Bcl-2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.315，P=0.018）。

圖1　肝癌組織及遠(yuǎn)癌正常組織中miR-497表達(dá)Figure 1　Expression of miR-497 in liver carcinoma tissue and para-carcinoma tissue

圖2　肝癌組織及遠(yuǎn)癌正常組織中Bcl-2蛋白表達(dá)Figure 2　Protein expression of Bcl-2 in liver carcinoma tissue and paracarcinoma tissue

2.2轉(zhuǎn)染miR-497 mimics對(duì)HepG2中miR-497、Bcl-2表達(dá)的影響

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸相比較，轉(zhuǎn)染miR-497 mimics可使HepG2中miR-497表達(dá)增高（P＜0.05，圖3）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸相比較，轉(zhuǎn)染miR-497 mimics可使HepG2中Bcl-2表達(dá)降低（P＜0.05，圖4）。

圖3　轉(zhuǎn)染miR-497mimics對(duì)HepG2中miR-497表達(dá)的影響Figure 3　Expression of miR-497 in HepG2 after transfection with miR-497 mimics

圖4　轉(zhuǎn)染miR-497mimics對(duì)HepG2中Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Figure 4　Protein expression of Bcl-2 in HepG2 after transfection with miR-497 mimics

2.3miR-497對(duì)Bcl-2 3'-UTR的靶向作用

雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics與Bcl-2 3'-UTR野生質(zhì)粒后，HepG2熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染control miRNA組顯著降低（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染miR-497mimics與Bcl-2 3'-UTR突變質(zhì)粒后，HepG2熒光素酶活性無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5　HepG2中miR-497與Bcl-2 3'-UTR結(jié)合情況Figure 5　Combination condition of miR-497 and Bcl-2 3′-UTR in HepG2

2.4轉(zhuǎn)染miR-497 mimics、Bcl-2對(duì)HepG2增殖活性的影響

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-497 mimics后24、48、72 h后HepG2增殖活性較轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸顯著降低（P＜0.05）；而共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics、Bcl-2后，HepG2增殖活性較單純轉(zhuǎn)染miR-497 mimics顯著提高（P＜0.05），但仍顯著低于轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸組（P＜0.05）（圖6）。

2.5轉(zhuǎn)染miR-497 mimics、Bcl-2對(duì)HepG2凋亡的影響

轉(zhuǎn)染miR-497 mimics后HepG2早期凋亡細(xì)胞比例、晚期凋亡細(xì)胞比較及總凋亡細(xì)胞比例均顯著高于轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸（P＜0.05）。而共轉(zhuǎn)染miR-497 mimics+Bcl-2后，HepG2早期凋亡細(xì)胞比例、晚期凋亡細(xì)胞比較及總凋亡細(xì)胞比例較單純轉(zhuǎn)染miR-497 mimics均顯著降低（P＜0.05），但仍顯著高于轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸組（P＜0.05）（表2）。

圖6　轉(zhuǎn)染miR-497、Bcl-2對(duì)HepG2增殖活性的影響Figure 6　Effect of transfection miR-497 and Bcl-2 on the proliferation of HepG2

表2　轉(zhuǎn)染miR-497、Bcl-2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 （%）Table 2　Effect of transfection miR-497 and Bcl-2 on cell apoptosis（%）

3　討論

miRNA屬于高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，并廣泛存在于真核生物中。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)miRNA表達(dá)遵守嚴(yán)格的組織、時(shí)序特異性；但在腫瘤環(huán)境下，不同miRNA則表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性，并起到類(lèi)似癌基因或抑癌基因的作用［7］。miR-497在多種惡性腫瘤中均表達(dá)缺失或下調(diào)，如結(jié)腸癌［8］、胃癌［9］、宮頸癌［10］、骨肉瘤［11］及腦膠質(zhì)瘤［12］等，而過(guò)表達(dá)miR-497則可使上述惡性腫瘤細(xì)胞增殖能力得到抑制，提示miR-497在惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著抑癌基因的功能。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-497表達(dá)顯著低于遠(yuǎn)癌正常組織（P＜0.05），與丁文周等［13］研究結(jié)果一致；而轉(zhuǎn)染miR-497 mimics可使肝癌細(xì)胞HepG2中miR-497表達(dá)上調(diào)，同時(shí)明顯抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖活性，提示miR-497在肝癌中同樣起著類(lèi)似抑癌基因的作用。

原癌基因Bcl-2定位于18q21，長(zhǎng)約230 kb，含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，主要存在于細(xì)胞核膜、線(xiàn)粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中。Bcl-2可通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度、與bax結(jié)合形成異構(gòu)二聚體、活化R-ras信號(hào)通路等多種途徑發(fā)揮抑凋亡作用，從而參與惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與演變。研究證實(shí)，Bcl-2在宮頸癌［14］、乳腺癌［15］等惡性腫瘤組織中高表達(dá)，且其高表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著高于遠(yuǎn)癌正常組織（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染miR-497 mimics可使HepG2中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)一步提示HepG2中miR-497表達(dá)與Bcl-2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而這種相關(guān)性很可能是由miR-497負(fù)向調(diào)控Bcl-2表達(dá)所致。雙熒光素酶活性檢測(cè)顯示，miR-497可與Bcl-2 3'-UTR特異性結(jié)合，從而降低細(xì)胞熒光酶活性，進(jìn)一步印證上述研究提出的miR-497靶向Bcl-2的觀點(diǎn)。

細(xì)胞增殖活性檢測(cè)及凋亡測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-497可使HepG2增殖活性降低、細(xì)胞凋亡比例增加，而共轉(zhuǎn)染miR-497及Bcl-2則可實(shí)現(xiàn)miR-497對(duì)HepG2增殖抑制作用及凋亡促進(jìn)作用的部分逆轉(zhuǎn)，提示miR-497可通過(guò)靶向Bcl-2調(diào)控HepG2增殖及凋亡。但值得注意的是，轉(zhuǎn)染Bcl-2無(wú)法完全逆轉(zhuǎn)miR-497對(duì)HepG2增殖及凋亡的調(diào)控作用。其原因可能與miR-497靶向基因眾多有關(guān)，目前已知的miR-497下游靶基因包括CCNEl、Bcl-w等，由于miR-497可能通過(guò)同時(shí)靶向多個(gè)下游靶基因發(fā)揮作用，故僅研究其Bcl-2靶向作用并無(wú)法完全闡述其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，miR-497與Bcl-2存在靶向關(guān)系，miR-497可通過(guò)靶向調(diào)控Bcl-2表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖，同時(shí)促進(jìn)其凋亡。此外，miR-497還可能通過(guò)靶向其他下游基因參與肝癌的發(fā)生與演變過(guò)程。

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（2016-04-05收稿）

（2016-08-11修回）

（編輯：武斌校對(duì)：楊紅欣）

張猛專(zhuān)業(yè)方向?yàn)楦文懸绕⒓膊〉闹委煛?/p>

E-mail：soulsinger@126.com

miR-497 regulates cell proliferation and apoptosis by targeting Bcl-2 in liver cancer cells

Meng ZHANG，Quan ZHANG，Yusha TAN

Correspondence to:Quan ZHANG；E-mail:soulsinger@126.com

Department of Hepatobiliary Surgery of Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China

Objective:To evaluate the effect of miR-497 on regulating cell proliferation and apoptosis by targeting Bcl-2 in liver cancer cells. Methods:We tested liver cancer tissue and para-carcinoma tissue and used RT-PCR or Western blot to detect the expression of miR-497and Bcl-2 protein.We also tested the liver cancer cell HepG2 transfected with miR-497 mimics and mimic control.The expressions of miR-497and Bcl-2 protein were detected by RT-PCR or Western blot.Cell proliferation activity was detected by the MTT method，cell apoptosis was detected by flow cytometry，and cell luciferase activity was detected by the dual-luciferase reporter gene experiment.Results:1）Compared with para-carcinoma tissue，the miR-497 expression of liver cancer tissue significantly decreased（P＜0.05），whereas the Bcl-2 protein expression of liver cancer tissue significantly increased（P＜0.05）.2）Compared with transfection mimic control，transfection miR-497 mimics couldincreasethemiR-497expressionof liver cancer cell HepG2（P＜0.05）anddecreasetheBcl-2proteinexpressionof liver cancer cell HepG2 （P＜0.05）.3）Compared with transfection mimic control，co-transfection with miR-497 mimics and Bcl-2-WT could significantly decrease the luciferase activity of liver cancer cell HepG2（P＜0.05）.4）Compared with transfection mimic control，the proliferative activity of liver cancer cell HepG2 significantly decreased after transfection with miR-497 mimics（P＜0.05）.Compared with transfection miR-497 mimics，the proliferative activity of liver cancer cell HepG2 significantly increased after transfection with miR-497 mimics+Bcl-2（P＜0.05）.5）Compared with transfection mimic control，the total apoptosis rate of liver cancer cell HepG2 significantly increased after transfection with miR-497 mimics（P＜0.05）.Compared with transfection miR-497 mimics，the total apoptosis rate of liver cancer cell HepG2 significantly decreased after transfection with miR-497 mimics+Bcl-2（P＜0.05）.Conclusion:In liver cancer cells，miR-497 could target Bcl-2 to inhibit cell proliferation and enhance cell apoptosis.

miR-497，Bcl-2，liver cancer，cell proliferation，cell apoptosis

10.3969/j.issn.1000-8179.2016.16.381

河北大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科（河北省保定市071000）

張全soulsinger@126.com