硫酸鎂對(duì)大鼠局灶性腦缺血后氧化應(yīng)激和NF-кB蛋白表達(dá)的影響

閔鶴鳴，賈玉潔，姜興千，包翠芬，閔連秋

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硫酸鎂對(duì)大鼠局灶性腦缺血后氧化應(yīng)激和NF-кB蛋白表達(dá)的影響

閔鶴鳴1，賈玉潔2，姜興千2，包翠芬1，閔連秋2

目的探討硫酸鎂(MgSO4)對(duì)大鼠腦缺血后氧化應(yīng)激和NF-кB蛋白表達(dá)的影響。方法60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及MgSO430 mg/kg、60 mg/kg和120 mg/kg組。采用線栓法制備大鼠永久性大腦中動(dòng)脈缺血模型(MCAO)。術(shù)后即刻假手術(shù)組與模型組腹腔注射生理鹽水1 ml，MgSO4各劑量組按上述劑量腹腔注射250 g/L MgSO4注射液(均用生理鹽水稀釋至1 ml)。24 h后檢測(cè)腦勻漿液中超氧化物岐化酶活性(SOD)、丙二醛(MDA)含量，應(yīng)用免疫組化技術(shù)觀察NF-кB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，MgSO460 mg/kg和MgSO4120 mg/kg兩組的SOD活性均顯著增高(P=0.000)，而MgSO430 mg/kg組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MgSO4各劑量組的MDA含量均顯著降低(P=0.000)；MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg組的NF-кB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P=0.000)，而MgSO430 mg/kg組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與MgSO430 mg/kg組比較，MgSO4120 mg/kg組的SOD活性顯著增高(P=0.015)，而MgSO460 mg/kg組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg組的MDA含量顯著降低(P=0.001和P=0.000)；MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg兩組的NF-кB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，差異具有顯著性(P=0.000)。結(jié)論MgSO4對(duì)大鼠局灶性腦缺血后氧化應(yīng)激損傷具有良好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除自由基、減輕氧化性損傷和抑制NF-кB蛋白的表達(dá)有關(guān)。

硫酸鎂；腦缺血；超氧化物岐化酶；丙二醛；NF-кB

腦血管病是嚴(yán)重威脅人類生命的三大主要死亡原因之一，有著很高的發(fā)病率、致殘率和病死率，其有效的治療方法相當(dāng)缺乏，尋找新的治療方法是當(dāng)今神經(jīng)學(xué)科領(lǐng)域的熱點(diǎn)。溶栓治療是20世紀(jì)90年代治療缺血性疾病突破性進(jìn)展。然而，由于溶栓治療的時(shí)窗很窄以及出血的并發(fā)癥，對(duì)于很多腦卒中患者來(lái)說(shuō)有著極大的局限性；而神經(jīng)保護(hù)治療是指保護(hù)腦實(shí)質(zhì)組織或腦細(xì)胞，而非血管的再通，可以適應(yīng)于各類腦血管病的治療。

有研究發(fā)現(xiàn)[1，2]，急性腦梗死患者血清中的鎂水平下降，應(yīng)用鎂劑治療具有一定的臨床療效，且發(fā)現(xiàn)硫酸鎂(magnesium sulfate，MgSO4)的神經(jīng)保護(hù)作用具有劑量依賴性；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究亦發(fā)現(xiàn)[3，4]，MgSO4對(duì)大鼠腦缺血具有腦保護(hù)作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)擬從氧化應(yīng)激和NF-кB的角度探討MgSO4的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1分組與給藥健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(280±20) g，遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2003-0007。隨機(jī)分為5組，每組12只，分為假手術(shù)組、模型組、MgSO4干預(yù)分別劑量30 mg/kg組、60 mg/kg組和120 mg/kg組。假手術(shù)組與模型組術(shù)后即刻腹腔注射生理鹽水1 ml，各治療劑量組按上述劑量腹腔注射250 g/L MgSO4注射液(均用生理鹽水稀釋至1 ml)，觀察24 h。

1.2藥品及試劑MgSO4由常州蘭陵制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0402231；超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒皆由南京建成生物工程研究所提供；核因子(nuclear factor kappa B，NF-кB)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物制品公司。

1.3大鼠局灶性腦缺血模型的制備參照Longa[5]和Nagasawa[6]報(bào)道的方法加以改進(jìn)制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血模型，各組均于24 h后斷頭處死。采用100 g/L水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，頸正中切口長(zhǎng)3.0 cm，分離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎其近端。于頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處剪一小口。用頭端燒成光滑杵狀的國(guó)產(chǎn)尼龍線(直徑0.25～0.30 mm，長(zhǎng)6 cm)作為栓線，并將制備好的栓線經(jīng)外套管引導(dǎo)下插入，緩慢推送入頸內(nèi)動(dòng)脈，至有阻力時(shí)停止，栓線頭端入大腦前動(dòng)脈近端，進(jìn)線長(zhǎng)度18～20 mm，使大腦中動(dòng)脈供血受到阻斷，固定栓線。模型成功的標(biāo)志是大鼠即刻出現(xiàn)右側(cè)Horner征，及清醒后出現(xiàn)左側(cè)前肢不同程度癱瘓[5]。假手術(shù)組僅分離動(dòng)脈而不插入栓線，于觀察24 h、進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后分別取腦制備檢測(cè)標(biāo)本。

1.4腦組織勻漿SOD活性和MDA含量測(cè)定每組8只大鼠用于測(cè)定SOD活性和MDA含量，術(shù)后24 h予以20%烏拉坦(0.5 ml/100 g)麻醉，快速斷頭取腦。去除低位腦干及嗅束，用生理鹽水沖洗腦表面血液，濾紙吸干表面水分，剝除軟腦膜，取右側(cè)大腦半球。以重量(g)/體積(ml)比1：9加入0.9%的冰生理鹽水用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)制成勻漿，冷凍離心機(jī)離心，以4000 r/min離心15 min后取上清液，即制成100 g/L的腦組織勻漿，分別采用黃嘌呤氧化法、硫代巴比妥酸法和考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法測(cè)定SOD活性、MDA和勻漿蛋白含量。嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。

1.5免疫組化檢測(cè)缺血區(qū)腦組織NF-κB蛋白表達(dá)每組4只大鼠用于測(cè)定NF-κB蛋白表達(dá)。將腦病理組織切片進(jìn)行免疫組化SABC法染色，嚴(yán)格參照武漢博士德生物試劑公司說(shuō)明書操作。每只大鼠取1張腦組織切片，顯微鏡下定位，取缺血側(cè)大腦的半暗帶區(qū)觀察，每張切片采集5個(gè)具有代表性的高倍視野，每組各20個(gè)視野。采用雙盲法計(jì)算每個(gè)高倍鏡(400倍)視野NF-кB陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。

2　結(jié)　果

2.1MgSO4對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦SOD活性與MDA含量的影響5組大鼠腦組織的SOD活性測(cè)定見附表，經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=10.592，P=0.000，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組和MgSO430 mg/kg組的SOD活性均顯著降低(P=0.000和P=0.004)，而MgSO460 mg/kg和MgSO4120 mg/kg兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，MgSO460 mg/kg和MgSO4120 mg/kg兩組的SOD活性均顯著增高(P=0.000)，而MgSO430mg/kg組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與MgSO430mg/kg組比較，MgSO4120 mg/kg組的SOD活性顯著增高(P=0.015)，而MgSO460mg/kg組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5組大鼠腦組織的MDA含量測(cè)定見附表，經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=36.878，P=0.000，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組和MgSO430 mg/kg組的MDA含量均顯著升高(P=0.000)，MgSO460mg/kg組亦升高(P=0.008)，而MgSO4120 mg/kg組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，MgSO4各劑量組的MDA含量均顯著降低(P=0.000)；與MgSO430 mg/kg組比較，MgSO460mg/kg組和MgSO4120 mg/kg組的MDA含量顯著降低(P=0.001和P=0.000)。

2.2MgSO4對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織NF-кB蛋白表達(dá)的影響5組均有不同程度的NF-кB表達(dá)，但假手術(shù)組僅有極少數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，其余4組梗死灶周圍的半暗區(qū)內(nèi)可見較多的NF-кB陽(yáng)性細(xì)胞，光鏡下胞核呈黃褐色，顆料狀，且蘇木素不能復(fù)染。

模型組可見大量的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)可見明顯的顆粒或團(tuán)塊狀表達(dá)。經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=36.878，P=0.000，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組、MgSO430 mg/kg組和MgSO460 mg/kg組的NF-кB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增加(P=0.000)，而MgSO4120 mg/kg組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg組的NF-кB蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P=0.000)，而MgSO430 mg/kg組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與MgSO430 mg/kg組相比，MgSO460 mg/kg組和MgSO4120 mg/kg兩組差異具有顯著性(P=0.000)，(見表1)。

表1　MgSO4對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織SOD活性、MDA含量和NF-кB蛋白表達(dá)的影響±s)

與假手術(shù)組比較▲▲P<0.01；與模型組比較★★P<0.01；與硫酸鎂30 mg/kg組比較#P<0.05，##P<0.01

A：假手術(shù)組NF-κB免疫組織化學(xué)染色 ×400

B：模型組NF-κB免疫組織化學(xué)染色×400

C：MgSO4 30 mg/kg組NF-κB免疫組織化學(xué)染色×400

D：MgSO4 60 mg/kg組NF-κB免疫組織化學(xué)染色×400

E：MgSO4 120 mg/kg組NF-κB免疫組織化學(xué)染色×400

3　討　論

腦缺血損傷是由多因素共同參與，其中能量代謝障礙、氧自由基、Ca2+超載等因素在腦缺血損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。腦組織神經(jīng)細(xì)胞對(duì)自由基損傷極其敏感，腦缺血時(shí)自由基的產(chǎn)生與內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)失衡，自由基蓄積會(huì)引起腦組織損傷。SOD對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化之間發(fā)揮平衡作用，能清除超氧陰離子自由基，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，是主要的自由基清除酶，測(cè)定此酶可間接反映機(jī)體清除自由基的能力[7～9]；MDA是氧自由基與生物膜多聚不飽和脂肪酸作用生成的代謝產(chǎn)物，間接反映組織中氧自由基含量的變化與細(xì)胞損傷的程度[7]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，MgSO4不僅可以降低腦組織中的MDA含量，而且還可以提高SOD活性，且呈劑量依賴關(guān)系。提示MgSO4對(duì)缺血腦組織的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

NF-кB是1986年由Sen和Bal-timore[10，11]發(fā)現(xiàn)的，是一種能與DNA結(jié)合的二聚體蛋白。NF-кB參與多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的基因調(diào)控，與腦缺血后炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[12]。本研究表明在正常腦組織中NF-кB僅有少量表達(dá)，缺血后表達(dá)急劇升高，提示腦缺血后NF-кB被激活，NF-кB通路參與了缺血性腦損傷過(guò)程；與模型組相比較，MgSO4各劑量組腦組織中NF-кB蛋白的表達(dá)明顯較少，推測(cè)MgSO4可能通過(guò)下調(diào)NF-кB蛋白的過(guò)度表達(dá)來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。

引起NF-кB激活的因素很多，紫外線、放射線、細(xì)菌、內(nèi)毒素、病毒、細(xì)胞因子、氧自由基等均可誘導(dǎo)NF-кB的產(chǎn)生[13]。在腦缺血及缺血后再灌注期間集體可以產(chǎn)生大量的自由基與反應(yīng)性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，如脂質(zhì)過(guò)氧化物、NO、過(guò)亞硝酸鹽和羥基基團(tuán)等，而ROS則是促進(jìn)NF-кB激活的最重要因素[14]。Huang等[15]將過(guò)度表達(dá)人銅鋅超氧化物歧化酶(SOD1)的轉(zhuǎn)基因小鼠MACO 1 h后進(jìn)行再灌注，免疫組化顯示SOD1的過(guò)度表達(dá)可使缺血誘導(dǎo)的p65免疫反應(yīng)活性降低，SOD1過(guò)度表達(dá)降低缺血誘導(dǎo)的NF-кB的DNA結(jié)合活性。本研究結(jié)果顯示MgSO4可有效抑制腦組織內(nèi)自由基的生成，表明MgSO4能有效清除組織內(nèi)的自由基；同時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，MgSO4能夠升高局灶性腦缺血大鼠腦組織SOD活性，下調(diào)NF-кB蛋白的表達(dá)，推斷MgSO4可能是通過(guò)上調(diào)缺血腦組織SOD的表達(dá)而抑制NF-кB蛋白的表達(dá)。

隨著對(duì)Mg2+作用機(jī)制的深入研究，鎂劑可能成為治療缺血性腦損傷具有潛力的藥物，有望為缺血性腦損傷的治療開辟新的途徑。

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The effects of magnesium sulfate on oxidative stress and expression of NF-кB after focal cerebral ischemia in rats

MINHeming，JIAYujie，JIANGXingqian，etal.

(DepartmentofCellBiology，CollegeofBasicMedicineofJinzhouMedicalUniversity，Jinzhou121001，China)

ObjectiveTo investigate the effects of different doses of magnesium sulfate(MgSO4) on oxidative stress and expression of NF-kappa after focal cerebral ischemia in rats. MethodsSixty SD rats were randomly divided into sham operation group，model group and Magnesium sulfatein group 30，60 and 120 mg/kg treatment groups. Using thread embolism method prepared rat permanent middle cerebral artery ischemia model(MCAO). the sham operation group and model group were given intraperitoneal injection of 1 ml normal saline postoperative immediately. By intraperitoneal injection of MgSO4each dose group according to the dose of 250 g/L MgSO4injection(were diluted with saline to 1ml). After 24 hours，the activity of superoxide dismutase(SOD) and the content of malondialdehyde(MDA) were measured in brain homogenate，meanwhile the histopathological changes of cerebral tissues were observed and at the same time the expression NF-kappa B protein positive cells were evaluated in each group by immunohistochemistry. ResultsCompared with the model group，the activity of SOD in magnesium sulfate 60 and 120 mg/kg groups were significantly higher than those in the model group (P=0.000)，while magnesium sulfate 30 mg/kg had not statistical significance；the MDA content of magnesium sulfate in each dose group were significantly lower than those of the model group (P=0.000)；Magnesium sulfate in magnesium sulfate 60 and 120 mg/kg groups of NF-kappa B protein positive cells decreased significantly (P=0.000)，while magnesium sulfate 30 mg/kg had not statistical significance. Compared with magnesium sulfate 30 mg/kg，the activity of SOD in magnesium sulfate 120 mg/kg increased significantly (P=0.015)，while magnesium sulfate 60 mg/kg had not statistical significance；the MDA content in magnesium sulfate 60 and 120 mg/kg groups were significantly lower than those in the model group (P=0.001andP=0.000)，the expression of NF-kappa B protein positive cells in magnesium sulfate 60 and 120 mg/kg groups decreased significantly，the differences had statistical significance(P=0.000). ConclusionMagnesium sulfate has protective effect on oxidative damage in rats after focal cerebral ischemia，and its mechanism may be related to free radical scavenging，reducing the expression of oxidative damage and inhibition of NF-kappa B protein.

Magnesium sulfate；Cerebral ischemia；Superoxide dismutase；Malondialdehyde；Nuclearfactor kappa B

1003-2754(2016)07-0588-04

2016-01-20；

2016-05-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(No. 81202783)

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州 121001)

包翠芬，E-mail：mianyizuhua@aliyun.com

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