KLF7聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞對小鼠坐骨神經(jīng)缺損后軸突再生的影響

李文媛，王　瑩，李智剛，閆　哲，楊春壯，李凱軍，趙　微

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KLF7聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞對小鼠坐骨神經(jīng)缺損后軸突再生的影響

李文媛1，王瑩1，李智剛2，閆哲1，楊春壯1，李凱軍1，趙微1

目的探討核轉(zhuǎn)錄因子KLF7與脂肪源性干細(xì)胞(ADSC)聯(lián)合應(yīng)用對小鼠脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)支架(ANA)移植坐骨神經(jīng)缺損后軸突再生和功能恢復(fù)的影響。方法成年C57BL/6小鼠隨機(jī)分為脫細(xì)胞神經(jīng)支架(ANA)組、ADSC組和KLF7+ADSC組，每組10只。坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)和電生理方法檢測神經(jīng)運(yùn)動功能的恢復(fù)，Western bolt檢測神經(jīng)移植體內(nèi)KLF7、TrkA和TrkB的蛋白表達(dá)。NF200免疫熒光法檢測神經(jīng)支架中軸突再生，并示蹤PKH26標(biāo)記的移植ADSC。結(jié)果與ADSC組比較，KLF7+ADSC組神經(jīng)移植體內(nèi)KLF7、TrkA和TrkB蛋白表達(dá)明顯增高，NF200表達(dá)增強(qiáng)，PKH-26標(biāo)記的ADSC數(shù)量顯著增高(P<0.05)。與ANA組比較，ADSC組和KLF7+ADSC組電生理波幅增高、神經(jīng)傳導(dǎo)速度增快、延遲期縮短，SFI功能指數(shù)增高，其中KLF7+ADSC組神經(jīng)恢復(fù)作用顯著優(yōu)于ADSC組(P<0.05)。結(jié)論KLF7聯(lián)合ADSC移植對小鼠ANA修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損后軸突再生和功能恢復(fù)的作用優(yōu)于ADSC組，其機(jī)制可能與KLF7高表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)移植體內(nèi)TrkA和TrkB表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)移植的ADSC存活有關(guān)。

KLF7；脂肪源性干細(xì)胞；脫細(xì)胞異體神經(jīng)；TrkA；TrkB

由各種原因所導(dǎo)致的周圍神經(jīng)損傷為臨床常見病，嚴(yán)重影響著人類的健康。近年來發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后許多病理生理改變提供廣泛的神經(jīng)保護(hù)和治療作用[1]。其中核轉(zhuǎn)錄因子KLF7(Krüppel-like Factor 7，KLF7)能夠調(diào)控多種細(xì)胞的發(fā)育、增殖和分化[2]。KLF7基因敲除可導(dǎo)致中樞神經(jīng)、視網(wǎng)膜和嗅覺神經(jīng)損傷后軸突再生障礙[3，4]，轉(zhuǎn)錄激活KLF7能夠促進(jìn)成人的皮質(zhì)脊髓束軸突再生[5]。有研究表明KLF7還能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子高親和力受體酪氨酸激酶受體A(Tyrosine Kinase Receptor A，TrkA)和酪氨酸激酶受體B(Tyrosine Kinase Receptor B，TrkB)等表達(dá)[6]，但其在周圍神經(jīng)再生的作用及其機(jī)制報(bào)道較少。

我們前期研究[7]已證實(shí)同種異體脫細(xì)胞異體神經(jīng)(acellular nerve allograft，ANA)能夠有效橋接坐骨神經(jīng)缺損，但單獨(dú)使用ANA運(yùn)動功能恢復(fù)效果并不理想。本研究擬將脂肪源性干細(xì)胞(Adipose-derived stem cell，ADSC)作為種子細(xì)胞植入ANA橋接坐骨神經(jīng)缺損，并聯(lián)合腺相關(guān)病毒2(adeno-associated virus 2，AAV2)介導(dǎo)將KLF7基因轉(zhuǎn)染至ANA治療，探討KLF7聯(lián)合ADSC對坐骨神經(jīng)缺損后軸突再生和功能恢復(fù)的影響，為坐骨神經(jīng)損傷提供新的治療方法。

1　材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)參照前期研究方法[8]取小鼠腹部脂肪組織進(jìn)行ADSC細(xì)胞分離、培養(yǎng)及傳代，2 w后茜草素紅染色鑒定ADSC向成骨誘導(dǎo)的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞鑒定后取第4代ADSC行PKH26(Sigma公司，美國)染色標(biāo)記[7]，進(jìn)行體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)。

1.2動物模型30只6～8 w C57BL/6小鼠(雄性15 只，雌性15 只)，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體質(zhì)量18～22 g，按體質(zhì)量隨機(jī)分為：(1)ANA組：采用化學(xué)萃取脫細(xì)胞方法[7，8]制備CD1小鼠ANA，注入100 μl PBS于ANA，橋接長5 mm坐骨神經(jīng)兩斷端間的缺損，n=10；(2)ADSC組：注入等劑量ADSC(1×106個/100 μl)于ANA橋接坐骨神經(jīng)缺損，n=10；(3)KLF7+ADSC組：同ADSC組方法進(jìn)行ANA橋接后，ANA給予微量注射器注射2 μl AAV2-KLF7(1×1011病毒顆粒，Vector BioLabs公司，美國)，n=10。3組術(shù)后28 d麻醉取材。

1.3坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(Sciatic functional index，SFI)參照前期研究方法行SFI檢測[6]，術(shù)后28 d，制備一個塑料通道(8.5 cm寬，50 cm長)，底部放置一張70 g白紙，黑色墨水蘸在小鼠雙側(cè)后足從通道一端行走至另一端，每個后足印在紙面3～4個足印，檢測足趾寬度(TS)、足趾長度(PL)及中間足趾寬度(ITS)。SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8。

1.4電生理檢測采用經(jīng)顱磁刺激MEP(transcranial magnetic motor-evoked potentials，tcMMEP)方法[1]，應(yīng)用Magstim Model 200 磁刺激器(Magstim 公司，英國)和誘發(fā)電位儀(NIHON KOHDEN公司，日本)經(jīng)顱磁刺激運(yùn)動誘發(fā)電位觀察小鼠坐骨神經(jīng)損傷后發(fā)生神經(jīng)傳導(dǎo)潛伏期、傳導(dǎo)速度及波幅改變，將電磁線圈置于顱骨激活皮質(zhì)下組織誘發(fā)tcMMEP反應(yīng)，探查電極置于腓腸肌肌腹，參考電極插入肌腱，接地電極插入尾巴。每只小鼠每側(cè)均檢測3次，每次間隔1 min，結(jié)果取平均值。

1.5Western blotting檢測術(shù)后28 d，小鼠麻醉取ANA沖洗，剝離硬膜放置干冰保存，電泳分離蛋白樣品(20 μg)后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗：兔抗KLF7抗體(1∶200，sigma公司，美國)、兔抗TrkA抗體(1∶200，sigma公司，美國)和兔抗TrkB抗體(1∶200，sigma公司，美國)，4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記種屬特異性二抗(1∶5000)孵育1 h，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(GE Healthcare公司，英國)觀察蛋白印跡。

1.6免疫熒光組化染色將快速分離的ANA置于含4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，冰凍切片，常規(guī)免疫組化染色，一抗為兔抗NF200(1∶200，sigma公司，美國)，二抗為羊抗兔FITC(1∶200，sigma公司，美國)，熒光顯微鏡下觀察并同時(shí)示蹤PKH26標(biāo)記的ADSC。每張切片400倍鏡下隨機(jī)選取4個視野檢測光密度(IOD)值。

2　結(jié)　果

2.1ADSC培養(yǎng)與分化原代培養(yǎng)ADSC 8 d后形成的細(xì)胞群落較為密集，ADSC呈多角形或梭形伸展，有鋪路石狀特征。ADSC分化誘導(dǎo)成骨28 d后，可見分化細(xì)胞內(nèi)的鈣沉積茜素紅染色 (見圖1)。

2.2Western bolt結(jié)果KLF7+ADSC組和ADSC組ANA中TrkA和TrkB蛋白表達(dá)較ANA組顯著增高，其中聯(lián)合組TrkA和TrkB蛋白表達(dá)高于ADSC對照組。ANA組和ADSC組KLF7蛋白表達(dá)極少，而KLF7+ADSC組KLF7表達(dá)顯著增高(KLF7：F2，12=125.9，P<0.001；TrkA：F2，12=85.15，P<0.001；TrkB：F2，12=77.10，P<0.001)(見圖2)。

2.3免疫熒光染色觀察熒光顯微鏡下可見KLF7+ADSC組和ADSC組在ANA中段有PKH26標(biāo)記的ADSC，而KLF7+ADSC組PKH26陽性表達(dá)顯著高于ADSC組 (t=3.56，P<0.05)。免疫熒光法染色NF200檢測神經(jīng)支架中段軸突生成情況，與ADSC組比較，KLF7+ADSC組NF200表達(dá)顯著增加(t=21.75，P<0.001)(見圖3)。

2.4SFI檢測結(jié)果術(shù)后28 d，與ANA組比較，ADSC組和KLF7+ADSC組SFI指數(shù)顯著增高，其中KLF7+ADSC組SFI指數(shù)高于ADSC組(F2，27=27.82，P<0.001)(見圖4)。

2.5神經(jīng)電生理檢測與ANA組比較，ADSC組和KLF7+ADSC組神經(jīng)傳導(dǎo)速度及波幅顯著增加，而延遲期縮短，其中聯(lián)合組改善神經(jīng)電生理參數(shù)優(yōu)于ADSC組 (神經(jīng)傳導(dǎo)速度：F2，12=57.11，P<0.05；延遲期：F2，12=19.24，P<0.05；波幅：F2，12=22.76，P<0.05)(見表1)。

表1　各組神經(jīng)電生理參數(shù)檢測

*與ANA組比較P<0.05；#與ADSC組比較P<0.05

圖1A：原代培養(yǎng)ADSC 8 d后呈鋪路石狀；B：ADSC分化誘導(dǎo)成骨，細(xì)胞內(nèi)的鈣沉積茜素紅染色

圖2Western bolt實(shí)驗(yàn)檢測各組再生神經(jīng)中KLF7、TrkA和TrkB 蛋白相對表達(dá)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖3術(shù)后4 w ADSC組和KLF7+ADSC組神經(jīng)移植體中段PKH26和NF200免疫組化熒光染色(A)，PKH26和NF200的IOD值(B)，標(biāo)尺=100 μm，n=10

圖4坐骨神經(jīng)功能指數(shù)實(shí)驗(yàn)(n=10)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

3　討　論

目前發(fā)現(xiàn)近端周圍神經(jīng)病變或完全橫斷的預(yù)后普遍較差，運(yùn)動功能恢復(fù)緩慢。其中主要原因是適宜神經(jīng)生長的微環(huán)境缺乏，軸突生長底物和神經(jīng)營養(yǎng)因子減少及受損軸突內(nèi)在生長速度太慢，導(dǎo)致再生軸突需較長時(shí)間連接遠(yuǎn)端失神經(jīng)支配的神經(jīng)、不能重新支配靶組織，其功能恢復(fù)并不理想[9]。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)[7，8]ANA由于脫去了周圍神經(jīng)的細(xì)胞成分，保存了神經(jīng)天然結(jié)構(gòu)，具有較好的組織相容性，能夠?yàn)樯窠?jīng)缺損提供良好的神經(jīng)生長微環(huán)境。而種子細(xì)胞ADSC可合成和分泌大量神經(jīng)營養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等，這些促進(jìn)神經(jīng)生長的因子表達(dá)變化提供軸突生長的營養(yǎng)。本研究電生理檢測結(jié)果也再次證實(shí)ADSC能夠促進(jìn)ANA橋接神經(jīng)缺損后功能恢復(fù)，但SFI指數(shù)結(jié)果表明ADSC組神經(jīng)功能恢復(fù)效果并不盡如人意，盡管其SFI指數(shù)有增高趨勢，大量研究證實(shí)[10～13]聯(lián)合治療能夠克服多種抑制神經(jīng)軸突再生的因素，較單一治療效果更為明顯。

Krüppel like Factor(KLF)家族[14]是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族，其典型結(jié)構(gòu)特征是在其羧基端具有3個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)。KLF家族廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化以及胚胎發(fā)育等多個生命活動的調(diào)控。其中，核轉(zhuǎn)錄因子KLF7[2～4]在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，其結(jié)構(gòu)與其家族一樣，含有一個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個激活結(jié)構(gòu)域，其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于C末端，通過羧基端三個連續(xù)鋅指構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶基因啟動子內(nèi)富含GC序列以調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。近幾年研究表明[4～6]KLF7調(diào)控多種細(xì)胞的發(fā)育、增殖和分化，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生、髓鞘形成和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果證實(shí)術(shù)后4 w與ADSC組比較，聯(lián)合組KLF7、TrkA和TrkB蛋白在神經(jīng)支架內(nèi)表達(dá)顯著增高，證實(shí)KLF7高表達(dá)能夠有效激活TrkA和TrkB細(xì)胞信號通路，這與以往研究結(jié)果相一致[6]。

另外本研究還發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組ANA中段PKH26標(biāo)記陽性細(xì)胞個數(shù)顯著高于ADSC組，而且NF200標(biāo)記的軸突數(shù)量也顯著高于ADSC組，因此我們推測KLF7可能通過激活TrkA和TrkB細(xì)胞信號通路，TrkA和TrkB是神經(jīng)營養(yǎng)因子的高親和力受體，通過與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子或神經(jīng)生長因子特異性配體結(jié)合[15]，促進(jìn)移植的ADSC增殖和存活，進(jìn)而促進(jìn)軸突的再生。研究還發(fā)現(xiàn)與ANA組相比，ADSC組和KLF7+ADSC組顯著改善電生理參數(shù)，說明ADSC組和聯(lián)合組均能夠促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)，但KLF7聯(lián)合ADSC治療效果明顯優(yōu)于ADSC組，其SFI指數(shù)也高于ANA組和ADSC組，證實(shí)了KLF7聯(lián)合ADSC能夠協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，本研究探討聯(lián)合應(yīng)用KLF7和ADSC治療坐骨神經(jīng)缺損，證實(shí)了聯(lián)合治療能夠促進(jìn)小鼠ANA移植后軸突再生和功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與KLF7激活TrkA和TrkB細(xì)胞信號通路，促進(jìn)移植的ADSC的存活有關(guān)。

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Effects of KLF7 and ADSC transplantation on expression of BDNF and its receptor TrkB after sciatic nerve injury in mice

LIWenyuan，WANGYing，LIZhigang，etal.

(DepartmentofAnatomy，MudanjiangMedicalCollege，Mudanjiang157011，China)

ObjectiveTo study the effect of KLF7 and adipose-derived stem cell (ADSC) transplantation on expression of axonal regeneration and function recovery after acellular nerve allograft (ANA)repair of the sciatic nerve gap in mice. MethodsAdult C57BL/6 mice were randomly divided into ANA group，ADSC group and KLF7+ADSC group. The sciatic functions index (SFI) and electrophysiology were used to evaluate functional recovery. KLF7，TrkA and TrkB protein were evaluated by Western bolt，the protein expression of NF200 and the fluorescence signal of ADSC labeled with PKH-26 in the nerve graft was observed by using immunofluorescence. ResultsCompared with ANA group，the expression of KLF7，TrkA，TrkB，NF200 and PKH-26 labeled ADSC in KLF7+ADSC group were increased (P<0.05). Compared with ANA group，nerve conduction velocity，wave amplitude and the SFI score were significantly increased in ADSC group and KLF7+ADSC group (P<0.05)，however，incubation period were significantly decreased in two treatment groups (P<0.05)，and the effect of KLF7+ADSC group was more powerful than ADSC group (P<0.05). ConclusionThe combined KLF7 and ADSC transplantation treatment promoted axon regeneration and function recovery much significantly than ADSC treatment，which may be related to KLF7 upregulating TrkA and TrkB expression in the ANA，and promoting ADSC survival.

KLF7；Adipose-derived stem cell；Acellular nerve allograft；TrkA；TrkB

1003-2754(2016)07-0580-04

2016-01-15；

2016-04-16

國家自然科學(xué)基金(No. 81371362)；黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. H201491)；黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委立項(xiàng)科研課題(No. 2014-211)；牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No. 2s201310)

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院普外科，黑龍江 牡丹江 157011)

王瑩，E-mail：yingwang770224@163.com

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