HP-NAP對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用*

王曉東，康巧珍，王小龍，李樹芳，王　婷，劉　鑫#,汲振余

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450001　2)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州 450052

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HP-NAP對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用*

王曉東1)，康巧珍1)，王小龍1)，李樹芳1)，王婷1)，劉鑫1)#,汲振余2)#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 4500012)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州 450052

幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白；肝癌；H22細(xì)胞；IFN-γ；小鼠

目的：研究幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(HP-NAP)對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤的生長抑制作用及可能機(jī)制。方法：構(gòu)建pET28a-NAP重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)菌株，IPTG誘導(dǎo)HP-NAP的表達(dá)，Ni柱親和層析法對(duì)其進(jìn)行分離純化。取BALB/c小鼠,皮下注射H22細(xì)胞(2×106個(gè)/只)構(gòu)建荷瘤模型，隨機(jī)分為PBS組和HP-NAP組，以皮下瘤旁注射的方式給予PBS或HP-NAP，監(jiān)測(cè)腫瘤體積和小鼠體重變化。1周后犧牲小鼠，取瘤體及各臟器稱重，以ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞IFN-γ分泌水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腫瘤組織中IFN-γ mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備了HP-NAP。HP-NAP可顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，對(duì)小鼠體重和臟器指數(shù)無明顯影響。與PBS組相比，HP-NAP組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ的分泌水平及腫瘤組織中IFN-γ mRNA的表達(dá)水平均升高(P<0.05)。結(jié)論：HP-NAP可能通過上調(diào)IFN-γ的表達(dá)抑制肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤的生長。

Toll樣受體 (Toll like receptor,TLR)激動(dòng)劑的抗腫瘤作用及機(jī)制已成為腫瘤治療研究的一個(gè)重要方向[1]。已有部分TLR激動(dòng)劑如卡介苗、單磷酰脂質(zhì)A與CpG被FDA批準(zhǔn)為抗腫瘤臨床用藥或已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[2-4]。幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白(Helicobacterpylorineutrophil-activating protein，HP-NAP)是幽門螺桿菌侵染胃黏膜時(shí)釋放的重要的毒力因子[5]，被證實(shí)是有效的TLR2激動(dòng)劑。研究[6-7]證實(shí)，HP-NAP可通過上調(diào)Th1型免疫反應(yīng)抑制膀胱癌的生長。重組溶瘤腺病毒毒株表達(dá)的分泌型HP-NAP也可通過誘導(dǎo)Th1型免疫極化發(fā)揮對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌瘤的治療作用[8]。該研究中，作者采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組蛋白 HP-NAP,并觀察了HP-NAP對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用及其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料H22肝癌細(xì)胞系由河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院惠贈(zèng)。6到8周齡、無特定病原體SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京) 2012-0001；飼養(yǎng)于河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院SPF級(jí)動(dòng)物室，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物自由飲食飲水，光照周期為12/12 h。ProteinIsoTMNi-NTA Resin購于北京全式金生物技術(shù)有限公司， BCA蛋白定量試劑盒和RPMI 1640培養(yǎng)基購于北京索萊寶生物科技有限公司，胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司，IFN-γ ELISA試劑盒購于Biolegend公司(San Diego, CA, USA)，Real-time PCR引物由Invitrogen公司(Grand Island, New York, USA)合成，Trizol、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ酶及熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連寶生物工程有限公司。

1.2pET28a-NAP重組質(zhì)粒的構(gòu)建、HP-NAP的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化以作者所在實(shí)驗(yàn)室已有的pMAL-c2x-NAP質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到HP-NAP基因片段，選取BamHⅠ和XhoⅠ為酶切位點(diǎn)，構(gòu)建pET28a-NAP重組質(zhì)粒。經(jīng)酶切驗(yàn)證及測(cè)序后，將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600 nm=0.5后，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG，37 ℃培養(yǎng)3 h。菌體經(jīng)超聲破碎后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清以ProteinIsoTMNi-NTA Resin進(jìn)行分離純化，得到HP-NAP，以BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.3小鼠腫瘤模型的建立及分組處理于BALB/c小鼠左前肢腋下注射H22細(xì)胞0.2 mL(2×106個(gè)/只)，1 d后隨機(jī)分為PBS組和HP-NAP組，PBS組每只注射0.2 mL PBS， HP-NAP組注射0.15 g/L的HP-NAP 0.2 mL，1次/d， 連續(xù)7 d。

1.4觀察指標(biāo)①2組小鼠給藥期間每天稱量小鼠體重并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(L)和寬(D)，利用公式：V=0.5×L×D2計(jì)算腫瘤體積。②小鼠體重及各臟器指數(shù)和腫瘤質(zhì)量：給藥1周后犧牲小鼠，取小鼠心、肝、肺、腎以及腫瘤組織稱重，依照臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)計(jì)算臟器指數(shù)。③脾細(xì)胞IFN-γ的分泌水平測(cè)定：無菌條件下取脾臟，制備成單個(gè)脾細(xì)胞懸液，以RPMI 1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×107mL-1，加入48孔板(500 μL/孔)中，分別加入PBS或終濃度為3 μmol/L的HP-NAP，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后分別收集上清。ELISA法檢測(cè)IFN-γ的水平。④腫瘤組織IFN-γ mRNA表達(dá)水平的測(cè)定：取約60 mg腫瘤組織，剪碎后加入Trizol，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Roche Light Cycler 480進(jìn)行Real-time PCR，檢測(cè)IFN-γ mRNA的表達(dá)水平。內(nèi)參β-actin(71 bp)上游引物：5’-GTGGCATCCATGAAAC TACAT-3’,下游引物：5’-GGCATAGAGCTCTT TACGG-3’；IFN-γ(92 bp)上游引物：5’-TCAAGTG GCATAGATGTGGAAGAA-3’,下游引物：5’-TG GCTCTGCAGGATTTTCATG-3’。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×SYBR Premix Ex TaqⅡ酶12.5 μL；上下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA模板2.0 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃梯度升溫至95 ℃，每度保持5 s。記錄Ct值，以2-ΔΔCt法計(jì)算IFN-γ mRNA的表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較2組小鼠體重、腫瘤質(zhì)量、臟器指數(shù)以及脾臟細(xì)胞IFN-γ分泌水平及腫瘤組織IFN-γ mRNA表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1pET28a-NAP重組質(zhì)粒的構(gòu)建、HP-NAP的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化經(jīng)酶切及PCR驗(yàn)證(圖1A)后，進(jìn)一步測(cè)序鑒定。分離純化蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果顯示在17 000處有目標(biāo)條帶(圖1B)。

2.22組小鼠腫瘤生長狀況的比較結(jié)果見圖2。由圖2可知，HP-NAP組和PBS組小鼠均于注射H22細(xì)胞3 d后開始出現(xiàn)腫瘤；荷瘤后4～7 d，相對(duì)于PBS組，HP-NAP組腫瘤生長減緩。荷瘤后第8天，HP-NAP組小鼠腫瘤質(zhì)量為(0.427±0.012) g，低于PBS組[(0.733±0.041) g](t=7.184,P=0.002)。

1：經(jīng)BamH Ⅰ單酶切的重組質(zhì)粒；2：經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的重組質(zhì)粒；3：HP-NAP的PCR產(chǎn)物；4：菌體經(jīng)超聲破碎離心后上清；5：經(jīng)ProteinIsoTM Ni-NTA Resin進(jìn)行分離純化后產(chǎn)物。圖1　重組質(zhì)粒pET28a-NAP(A)及HP-NAP(B)的鑒定

圖2　2組小鼠腫瘤體積的變化

2.32組小鼠體重及臟器指數(shù)比較結(jié)果見表1。由表1可知，HP-NAP 在實(shí)驗(yàn)給藥劑量(30 μg/只)下給藥1周對(duì)小鼠體重和臟器指數(shù)無明顯影響。

表1　2組小鼠體重及臟器指數(shù)比較

2.42組小鼠脾臟細(xì)胞IFN-γ分泌水平及腫瘤組織IFN-γ mRNA表達(dá)水平的比較結(jié)果見表2。由表2可知，與PBS組相比， HP-NAP組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ分泌水平及腫瘤組織IFN-γ mRNA的表達(dá)水平均升高。

表2　2組小鼠脾臟細(xì)胞IFN-γ分泌水平及腫瘤組織中IFN-γ mRNA表達(dá)水平的比較

3　討論

HP-NAP是幽門螺桿菌分泌的重要的毒力因子，被證實(shí)是有效的TLR2激動(dòng)劑。由于幽門螺桿菌是一種致病菌，以其直接制備HP-NAP具有潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)且過程復(fù)雜，得率較低[9]。作者利用大腸桿菌表達(dá)載體構(gòu)建His標(biāo)簽的重組HP-NAP，以親和層析法對(duì)其進(jìn)行分離純化。His標(biāo)簽僅在目標(biāo)蛋白前添加6個(gè)組氨酸，一般認(rèn)為對(duì)目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能不產(chǎn)生影響，且便于使用Ni柱純化，酶切及測(cè)序結(jié)果表明成功制備了HP-NAP。進(jìn)一步的研究表明HP-NAP組荷瘤小鼠腫瘤體積的增長較PBS組減緩，且HP-NAP組小鼠腫瘤質(zhì)量低于PBS組，表明HP-NAP可抑制荷瘤小鼠H22腫瘤的生長。

利用TLR激動(dòng)劑促進(jìn)Th1細(xì)胞極化發(fā)揮抗腫瘤作用是抗腫瘤免疫治療的一種重要策略[1]。Th1型細(xì)胞能夠有效分泌Th1型細(xì)胞因子IFN-γ, IFN-γ具有多重抗腫瘤作用[10]。IFN-γ可以通過上調(diào)某些特定基因的表達(dá)來延長抗原特異性T細(xì)胞的存活并促進(jìn)其增殖[11]；IFN-γ能增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的腫瘤殺傷活力[12]；IFN-γ可介導(dǎo)IL-12抑制腫瘤血管中血管生成因子受體3的表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[13]；此外，已有研究[14]證明通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中IFN-γ的水平或者瘤內(nèi)將IFN-γ與樹突疫苗聯(lián)用都能有效抑制腫瘤。該研究結(jié)果顯示，HP-NAP能夠有效刺激荷瘤小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ且顯著提升腫瘤組織IFN-γ mRNA的表達(dá)水平，提示HP-NAP可能通過刺激表達(dá)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ發(fā)揮多重抗腫瘤作用。

總之，HP-NAP能夠抑制荷瘤小鼠H22腫瘤的生長，并顯著提升脾細(xì)胞IFN-γ的分泌及腫瘤組織IFN-γ mRNA的表達(dá)水平，可作為基于上調(diào)Th1型免疫應(yīng)答并發(fā)揮肝癌治療作用的潛在的免疫調(diào)節(jié)劑。

[1]HUSSEIN WM,LIU TY,SKWARCZYNSKI M,et al.Toll-like receptor agonists: a patent review(2011-2013)[J].Expert Opin Ther Pat,2014,24(4):453

[2]VACCHELLI E,EGGERMONT A,SAUTS-FRIDMAN C,et al.Trial Watch: Toll-like receptor agonists for cancer therapy[J].Oncoimmunology,2013,2(8):e25238

[3]BEGNINI KR,BUSS JH,COLLARES T,et al.Recombinant mycobacterium bovis BCG for immunotherapy in nonmuscle invasive bladder cancer[J].Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(9):3741

[4]Jean-Francois Jeannin. Lipid A in cancer therapy[M]. France：University of Burgundy, 2009:667

[5]DOYLE JJ,DOLORES GE,TAKEMURA T, et al. Characterization of aHelicobacterpylorineutrophil-activating protein[J].Infect Immun,1995,63(6):2213

[6]AMEDEI A,CAPPON A,CODOLO G,et al.The neutrophil-activating protein ofHelicobacterpyloripromotes Th1 immune responses[J].J Clin Invest,2006,116(4):1092

[7]CODOLO G,FASSAN M,MUNARI F,et al.HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response[J].Cancer Immunol Immunother,2012,61(1):31

[8]IANKOV ID,ALLEN C,FEDERSPIEL MJ,et al.Expression of immunomodulatory neutrophil-activating protein ofHelicobacterpylorienhances the antitumor activity of oncolytic measles virus[J].Mol Ther,2012,20(6):1139

[9]IKEDA H,OLD LJ,SCHREIBER RD.The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting[J].Cytokine Growth Factor Rev,2002,13(2):95

[10]SHIH KS,LIN CC,HUNG HF,et al.One-step chromatographic purification ofHelicobacterpylorineutrophil-activating protein expressed in Bacillus subtilis[J].PLoS One,2013,8(4):e60786

[11]ZIMMERMAN M,YANG D,HU X,et al.IFN-γ upregulates survivin and Ifi202 expression to induce survival and proliferation of tumor-specific T cells[J].PLoS One,2010,5(11):e14076

[12]LACASSE CJ,JANIKASHVILI N,LARMONIER CB,et al.Th-1 lymphocytes induce dendritic cell tumor killing activity by an IFN-γ-dependent mechanism[J].J Immunol,2011,187(12):6310

[13]SORENSEN EW,GERBER SA,FRELINGER JG, et al.IL-12 suppresses vascular endothelial growth factor receptor 3 expression on tumor vessels by two distinct IFN-gamma-dependent mechanisms[J].J Immunol,2010,184(4):1858

[14]MITO K,SUGIURA K,UEDA K, et al. IFN{gamma} markedly cooperates with intratumoral dendritic cell vaccine in dog tumor models[J].Cancer Res,2010,70(18):7093

(2015-11-27收稿責(zé)任編輯徐春燕)

Inhibitive effect of HP-NAP on tumor growth in mice bearing hepatoma H22 tumor

WANGXiaodong1)，KANGQiaozhen1)，WANGXiaolong1)，LIShufang1)，WANGTing1)，LIUXin1),JIZhenyu2)

1)LaboratoryofMolecularImmunology,SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)HenanAcademyofMedical&PharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Helicobacterpylorineutrophil-activating protein;hepatoma；H22 cell;IFN-γ;mouse

Aim: To investigate the inhibitive effect of theHelicobacterpylorineutrophil-activating protein(HP-NAP) on mice bearing hepatoma H22 tumor and the potential mechanism. Methods: The recombined plasmid pET28a-NAP was constructed and transformed intoE.coliBL21 to induce the expression of HP-NAP by IPTG, and then HP-NAP was purified using ProteinIsoTM Ni-NTA Resin. H22 hepatoma cells(2×106per mouse) were injected subcutaneously into the flank of BALB/c mice and then the mice were allocated into 2 groups and treated with HP-NAP(HP-NAP group) and PBS(PBS group), respectively. The body weight and tumor size were monitored every day. The mice were sacrificed after being treated with HP-NAP or PBS for one week.The weight of tumor and visceral organs was measured, the level of IFN-γ secreted from splenocytes was assayed by ELISA, and the mRNA expression level of IFN-γ in tumor tissue was evaluated by Real-time PCR. Results: HP-NAP was successful prepared usingE.coliexpression system. HP-NAP could significantly inhibit the tumor growth in mice bearing H22 tumor without influence of the body weight or organ indexes. HP-NAP could significantly improve the IFN-γ secretion from splenocytes and enhance the production of IFN-γ in tumor tissue(P<0.05). Conclusion: HP-NAP could inhibit the tumor growth in mice bearing H22 tumor by up-regulating the expression of IFN-γ.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.010

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目U1204817，81373119，81571526；河南省教育廳基金資助項(xiàng)目16A180019

，劉鑫，女，1981年7月生，博士，副教授，研究方向：免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制及治療，E-mail：liux@zzu.edu.cn；

汲振余，男，1965年8月生，博士，研究員，研究方向：腫瘤免疫學(xué)，E-mail：jizhenyu@zzu.edu.cn

R730.59