人退行性變髓核細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定*

羅栩偉　李艷　劉康　馮剛　陳竹

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所， 四川 南充 637000)

?

·論著·

人退行性變髓核細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及鑒定*

羅栩偉李艷劉康馮剛陳竹

(南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所， 四川 南充 637000)

目的觀察體外分離培養(yǎng)的人退行性變髓核細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，并分析其生物學(xué)特性。方法收集人退變髓核組織，胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化分離出髓核細(xì)胞行平面培養(yǎng)并傳代，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，并分別在1w、2w、3w三個時間點通過硫酸化的糖胺聚糖含量測定、免疫組化染色、Safranin-O染色、Real-time PCR對髓核細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性分析及鑒定。結(jié)果髓核細(xì)胞呈星形、多角形、梭形，部分胞漿突起，伸出偽足，與軟骨樣細(xì)胞形態(tài)相近，傳代后細(xì)胞形態(tài)體積較原代大。髓核細(xì)胞能合成大量硫酸化的糖胺聚糖，細(xì)胞中富含蛋白多糖、Ⅱ型膠原，免疫染色呈陽性，隨著培養(yǎng)周數(shù)的增加，其著色深度無明顯強化。Safranin-O染色將細(xì)胞核染成紅色，胞漿淡染，隨著培養(yǎng)日期的延長，其紅色強度無明顯加深。Real-time PCR檢測到Aggrecan、CollagenⅡ兩基因在1w、2w、3w均持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，各觀察點間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化法操作簡單，培養(yǎng)效率高，傳代培養(yǎng)的髓核細(xì)胞增殖速度快，經(jīng)鑒定具有典型的類軟骨細(xì)胞表征及良好的生物學(xué)特性，能持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)蛋白多糖及Ⅱ型膠原。

髓核；細(xì)胞；培養(yǎng)；生物學(xué)特性

髓核(Nucleus pulposus，NP)為半透明膠凍狀組織，是椎間盤中心構(gòu)成部分，它富含蛋白多糖、Ⅱ型膠原及大量水分等細(xì)胞外基質(zhì)成分，具有高彈力及抗張力特性，對維持脊柱穩(wěn)定及生理彎曲有著極為重要的意義[1-2]。髓核細(xì)胞的衰老凋亡、外基質(zhì)降解、蛋白多糖及Ⅱ型膠原含量減少、水分丟失等一系列生化改變是椎間盤退行性變(Intervertebral disc degeneration，IDD)發(fā)生發(fā)展的重要原因[3-5]?；蚋深A(yù)、細(xì)胞移植、髓核組織工程構(gòu)建等是椎間盤退變髓核生物治療的主要手段[6-7]。因此，為了能更好模擬髓核生物學(xué)性能，對髓核細(xì)胞生物學(xué)特性的研究顯得尤為重要。本研究擬通過體外分離培養(yǎng)人退行性變髓核細(xì)胞，從多角度觀察并分析其類軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表型及生物學(xué)特性，為進(jìn)一步拓展椎間盤退行性變髓核生物治療研究提供一種新的細(xì)胞培養(yǎng)模式及詳實可靠的細(xì)胞形態(tài)生物學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1髓核組織來源收集的5例退行性變髓核組織，為2015年7～12月期間在南充市中心醫(yī)院行腰椎間盤突出癥經(jīng)后路椎板開窗髓核摘除術(shù)所切除的髓核組織，術(shù)前經(jīng)CT、MRI確診，術(shù)后經(jīng)病檢證實為髓核組織退行性變，Thompson 分級屬Ⅳ、Ⅴ級[8]?；颊吣挲g均在45～60歲之間，L4/5 3例，L5/S1 2例。

1.1.2主要試劑FBS、DMEM(Hyclon)；0.25%胰酶-EDTA(Invitrogen)；II型膠原酶、牛睪丸透明質(zhì)酸酶、木瓜蛋白酶、HoeChst 33258、Safranin-O、Fast Green、DMMB(Sigma)；Collagen II免疫組化試劑盒(Chondrex)；Aggrecan抗體(Santa Cruz)；BSA(TaKaRa)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)；iQ SYBR Green(Bio-Rad)；DAB顯色液(武漢博士德生物有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1髓核的分離培養(yǎng)從手術(shù)摘除椎間盤中仔細(xì)分離出髓核組織，PBS沖洗3遍，用眼科剪將髓核組織剪碎至1 mm3大小，將組織混合液轉(zhuǎn)入15 mL的離心管中，1 500 rpm離心5min，去上清，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 ℃恒溫水浴消化20 min，1 500rpm離心5 min，去上清，加入0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫水浴消化2 h，1 500 rpm離心5 min，去上清，重復(fù)Ⅱ型膠原酶消化步驟再次消化離心后，用適量20%FBS的DMEM培養(yǎng)液漂洗，1 500rpm離心5 min，去上清，重復(fù)漂洗步驟 3次。最后用20%FBS的DMEM培養(yǎng)液1 mL吹散細(xì)胞，計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按2×105/mL接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，用20%FBS的DMEM培養(yǎng)液10 mL重懸，將培養(yǎng)瓶置于含95%空氣、5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d換培養(yǎng)液1次，倒置顯微鏡逐日觀察細(xì)胞貼壁及生長情況并拍照，當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2髓核細(xì)胞生長曲線的測定取第2代髓核細(xì)胞，按細(xì)胞密度為4×105/mL接種于6個75 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在接種后的第3、7、10、14、21、28 d， 各取1個培養(yǎng)瓶用胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，算出每mL的細(xì)胞數(shù)，并繪制細(xì)胞生長曲線圖。

1.2.3硫酸化的糖胺聚糖(Sulfated Glycosaminoglycan，sGAG)/DNA測定

1.2.3.1sGAG含量測定取第2代髓核細(xì)胞，按細(xì)胞密度為8×104/mL接種于6孔板，設(shè)置1w，2w，3w，3個觀察時間點，每組3個孔，用2%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別于每個觀察點取出1個6孔板，用PBS洗凈后每孔加入木瓜蛋白酶2 mL，置于56℃恒溫水浴鍋中消化24小時。取0.5 mL混合液轉(zhuǎn)移到15 mL離心管，依次加入100 mM碘乙酸0.5 mL、 0.5M Tris-HCl 0.5 mL、50 mM Tris-HCl(PH8.0)3 mL、DMMB顯色液2.5 mL，混勻反應(yīng)15 s，于525 nm處測定吸光度值。配制1～100 μg/mL硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)液并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中sGAG含量。

1.2.3.2DNA測定按照Hoechst 33258說明書稀釋1 mg/mL小牛胸腺DNA、1 mg/mL Hoechst 33258，并配制1～100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)液，打開熒光分光光度計開關(guān)，預(yù)熱15 min，設(shè)置激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長460 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。清洗比色杯，加入500 μL經(jīng)木瓜蛋白酶消化后待測樣品和1.5 mL染液，混勻，上機讀數(shù)記錄，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中DNA含量。

1.2.4Aggrecan免疫熒光檢測按1.2.3.1準(zhǔn)備細(xì)胞，分別于每個觀察點取出1個6孔板，PBS洗3次，甲醇固定10 min，PBS洗3次，5%BSA封閉液室溫封閉1小時，將一抗用5%BSA封閉液按一定比例稀釋后加入到6孔板，1 mL/孔，4℃冰箱孵育過夜；次日復(fù)溫30 min，去一抗，PBS洗3次，加二抗，置于37 ℃恒溫水浴鍋孵育1小時，去二抗，PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.5CollagenⅡ免疫組化檢測按1.2.3.1準(zhǔn)備細(xì)胞，分別于每個觀察點取出1個6孔板，PBS洗3次，用預(yù)冷的2.5%戊二醛固定10 min，PBS洗3次，2%牛睪丸透明質(zhì)酸酶室溫封閉30 min，PBS洗3次，加入適量0.1%～1%過氧化氫室溫下放置10 min，PBS洗3次，加入Blocking Buffer放置30 min，PBS洗3次，加一抗，按1∶250用Antiboby Dilution液稀釋，4 ℃冰箱孵育過夜，次日鍋，復(fù)溫30 min，去一抗，PBS洗3次，添加Streptavidin Peroxidase，按1∶5用Streptavidin Peroxidase Dilution Buffer稀釋，室溫下孵育1小時，去Streptavidin Peroxidase，PBS洗3次，加入DAB顯色液，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.6Safranin-O染色按1.2.3.1準(zhǔn)備細(xì)胞，分別于每個觀察點取出1個6孔板， ddH2O洗3次，蘇木素染色6 min，ddH2O洗10 min，2% Fast Green染色3 min，1%鹽酸-酒精脫色5 min，0.1% Safranin-O染色5～10 min，ddH2O洗2次，顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。

1.2.7Aggrecan、CollagenⅡmRNA表達(dá)情況按1.2.3.1準(zhǔn)備細(xì)胞，分別于每個觀察點取出1個6孔板，抽提髓核細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以Human β-action為內(nèi)參基因，作Real-time PCR擴增并進(jìn)行分析，引物序列見表1。

1.2.8統(tǒng)計學(xué)分析本實驗所有數(shù)據(jù)將采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用獨立樣本t檢驗，以P<0.05定義為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　Aggrecan、Collagen II及內(nèi)對照β-action基因的引物序列

2　結(jié)果

2.1髓核細(xì)胞生長曲線傳代后的髓核細(xì)胞24小時大部分貼壁，生長較原代迅速，7天后進(jìn)入對數(shù)生長期，2～3w鋪滿瓶壁，3～4w部分細(xì)胞生長、增殖停止，少許細(xì)胞衰老或死亡，見圖1。

2.2sGAG/DNA髓核細(xì)胞合成大量sGAG，并能持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。雖隨培養(yǎng)周數(shù)sGAG含量有所增加，但三組間比較差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖1傳代髓核細(xì)胞生長曲線

Figure1Growth curve of the second passage of NP cells

圖2髓核細(xì)胞sGAG/DNA

Figure2Levels of sGAG normalized to DNA content in NP cells

2.3髓核的培養(yǎng)退變髓核組織中細(xì)胞含量較少，原代消化后，較少細(xì)胞貼壁，細(xì)胞生長增殖很緩慢。7天后貼壁細(xì)胞增多，生長迅速，細(xì)胞呈星形、多角形、梭形，部分胞漿突起，并伸出偽足，與軟骨樣細(xì)胞形態(tài)相近。10天后部分細(xì)胞融合成片，堆積生長，開始進(jìn)入對數(shù)生長期。3～4w鋪滿瓶壁，進(jìn)行傳代。傳代后的髓核細(xì)胞形態(tài)體積較原代大，貼壁時間短，生長較迅速，余無明顯變化，見圖3。

2.4Aggrecan免疫熒光檢測髓核細(xì)胞中富含蛋白多糖，三個觀察點均能檢測到大量蛋白多糖合成，免疫熒光染色均呈陽性，陽性染色主要出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，胞核幾乎不著色，隨著培養(yǎng)周數(shù)的增加，其著色深度無明顯強化，見圖4。

2.5CollagenⅡ免疫組化檢測髓核細(xì)胞在培養(yǎng)1w、2w、3w均有大量Ⅱ型膠原合成，免疫組化染色呈陽性，胞漿被染成棕黃色，隨著培養(yǎng)時間的延長，各個觀察點著色深度基本一致，見圖5。

2.6Safranin-O染色三個時間點髓核細(xì)胞蛋白聚糖Safranin-O染色均呈陽性表達(dá)，細(xì)胞核被染成紅色，胞漿淡染，隨著培養(yǎng)日期的增加，其紅色強度并無明顯加深，見圖6。

2.7Aggrecan、CollagenⅡ mRNA表達(dá)水平Real-time PCR檢測到Aggrecan、CollagenⅡ基因在1w、2w、3w均能持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，兩基因在各觀察點表達(dá)水平相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖7)。

圖3髓核細(xì)胞的形態(tài)孢子(×100)

Figure3Morphology of NP cells

注：A、B、C為原代培養(yǎng)髓核細(xì)胞，D、E、F為傳代培養(yǎng)髓核細(xì)胞，A、D為1w，B、E為2w，C、F為3w

圖4髓核細(xì)胞免疫熒光染色檢測蛋白多糖的表達(dá)(×200)

Figure4Immunofluorescent staining of NP cells for aggrecan

注：A、D為1w，B、E為2w，C、F為3w

3　討論

椎間盤退行性變疾病為臨床常見病和多發(fā)病，是引起下腰痛的主要病因。其主要生化改變?yōu)榈鞍锥嗵呛廷蛐湍z原生成減少、水分含量丟失、細(xì)胞衰老凋亡等呈“瀑布”樣反應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)降解征象[9-11]。隨著現(xiàn)代生物治療技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，椎間盤退變生物治療成為了當(dāng)今眾多學(xué)者的研究課題，髓核作為椎間盤的中心構(gòu)件也因此成為了科學(xué)研究的熱點。有相關(guān)研究證實，椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展最先是從髓核的退變開始[5]。髓核為富含髓核細(xì)胞、蛋白多糖、Ⅱ型膠原及大量水分的半流體膠凍狀組織，它起著彈性緩沖外力的作用，能將所受壓力傳遞至纖維環(huán)以及椎骨，從而維持脊柱的穩(wěn)定性及生理彎曲[12]。髓核細(xì)胞本質(zhì)上是類軟骨細(xì)胞，它能合成大量的蛋白多糖、Ⅱ型膠原等物質(zhì)，在維持椎間盤生物學(xué)及力學(xué)特性方面起著主導(dǎo)作用。基因干預(yù)、細(xì)胞移植、髓核組織工程構(gòu)建等作為椎間盤退變髓核生物治療的主要手段，其研究基礎(chǔ)在于充分了解并掌握髓核細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征、生物學(xué)特性，才能更好地模擬符合人體生理的髓核生物學(xué)性能。

圖5髓核細(xì)胞免疫組化檢測Ⅱ型膠原的表達(dá)(×200)

Figure5Immunostaining of NP cells for type-Ⅱ collagen

注：A、D為1w，B、E為2w，C、F為3w

圖6髓核細(xì)胞Safranin-O染色檢測蛋白聚糖的表達(dá)(×200)

Figure6Safranin-O staining of NP cells for proteoglycan

注：A、D為1w，B、E為2w，C、F為3w

圖7髓核細(xì)胞Aggrecan (A)、Collagen Ⅱ (B) mRNA的表達(dá)

Figure7Gene expression patterns in NP cells

注： (A) Aggrecan mRNA levels; (B) Collagen Ⅱ mRNA levels

通常成人的椎間盤髓核細(xì)胞主要是由脊索細(xì)胞演化而來，屬于終末細(xì)胞。其增殖能力較弱，體外培養(yǎng)難度較大，對培養(yǎng)條件的要求較高，培養(yǎng)的時間較長。Grubar等用20%FBS培養(yǎng)椎間盤細(xì)胞，結(jié)果表明髓核細(xì)胞約需1個月時間才能從最初組織塊中長至P1代[13]。傳統(tǒng)組織塊培養(yǎng)法，細(xì)胞游離出髓核組織塊的時間較長，一般為2周，雖然該方法操作簡便，但貼壁的細(xì)胞較少，培養(yǎng)時間較長；單純胰酶消化法獲得的細(xì)胞貼壁時間較短，但由于退變的髓核組織中含有大量的膠原成分，尤其是Ⅱ型膠原，因此消化物中殘留大量膠原，會影響細(xì)胞的生長，培養(yǎng)的髓核細(xì)胞中將含有大量雜細(xì)胞，且胰酶消化時間的長短難以準(zhǔn)確掌握；單純用低濃度膠原酶消化可以特異性水解膠原蛋白的超螺旋結(jié)構(gòu)，但此方法消化的時間較長，且獲得的髓核細(xì)胞較少，若用較高濃度的膠原酶消化耗費較高[11]。本研究綜合胰酶和膠原酶消化的方法，獲得髓核細(xì)胞數(shù)量大且純正，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度快，細(xì)胞呈星形、多角形、梭形，部分胞漿突起，伸出偽足，與軟骨樣細(xì)胞形態(tài)相近。

在髓核細(xì)胞生物學(xué)特性的研究中，目前尚未明確特異性的標(biāo)志物[14]，學(xué)者們普遍默認(rèn)將蛋白多糖及Ⅱ型膠原視為髓核細(xì)胞的特征性產(chǎn)物進(jìn)行鑒別。本研究中，我們在傳代培養(yǎng)的1w、2w、3w三個時間點利用免疫組化染色、Real-time PCR分別從蛋白水平、基因水平觀察到髓核細(xì)胞中有大量蛋白多糖、Ⅱ型膠原表達(dá)。此外，sGAG含量的測定常被用于評估細(xì)胞內(nèi)糖胺聚糖水平，本研究中我們將sGAG總量比上細(xì)胞總DNA，消除了細(xì)胞數(shù)不同對測定值的影響，檢測到不同時間點sGAG的含量，并進(jìn)一步通過Safranine-O染色檢測到髓核細(xì)胞內(nèi)蛋白聚糖合成情況。因此，本研究從多角度形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特性評價證實所培養(yǎng)細(xì)胞系人髓核細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)體系中持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)自身細(xì)胞特性，合成大量的蛋白多糖及Ⅱ型膠原。本研究中我們還發(fā)現(xiàn)，最初的傳代髓核細(xì)胞基本保持了原代髓核細(xì)胞的生物活性，但隨著傳代次數(shù)的增加，不可避免的出現(xiàn)了細(xì)胞纖維化變性，導(dǎo)致細(xì)胞生殖、增長、活性大幅度下降。因此，如何提供一個使細(xì)胞保持原始形態(tài)生物學(xué)活性不變的生長環(huán)境將是我們下一步研究的課題。

4　結(jié)論

本研究采用胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶消化法成功分離培養(yǎng)出人退行性變髓核細(xì)胞，該法操作簡單，培養(yǎng)效率高，傳代培養(yǎng)的髓核細(xì)胞增殖速度快，經(jīng)鑒定具有典型的類軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)表征和良好的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步拓展椎間盤退行性變髓核生物治療，提供了一種新的細(xì)胞培養(yǎng)模式和詳實可靠的細(xì)胞形態(tài)生物學(xué)依據(jù)。

[1]Melrose J, Shu C, Young C,etal. Mechanical destabilization induced by controlled annular incision of the intervertebral disc dysregulates metalloproteinase expression and induces disc degeneration [J]. Spine, 2012; 37:18-25.

[2]羅栩偉, 馮剛. 椎間盤退行性變的基因治療進(jìn)展 [J]. 西部醫(yī)學(xué), 2010， 22(8): 1529-1531.

[3]Freemont AJ. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain [J]. Rheumatology, 2009, 48(1):5-10.

[4]Luo XW,Liu K,Chen Z,etal. Adenovirus-mediated GDF-5 promotes the extracellular matrix expression in degenerative nucleus pulposus cells [J]. J Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol), 2016, 17(1):30-42.

[5]Sebastine IM, Williams DJ. Current developments in tissue engineering of nucleus pulposus for the treatment of intervertebral disc degeneration [J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2007, 2007:6401-6406.

[6]韓小偉, 馮剛. 椎間盤退行性變的生物學(xué)治療進(jìn)展 [J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2012, 41(21): 2204-2206.

[7]馮剛. 椎間盤組織工程研究的挑戰(zhàn)與對策 [J]. 西部醫(yī)學(xué), 2010, 22(8): 1377-1379.

[8]Thompson JP, Pearce RH, Schechter MT,etal. Preliminary evaluation of a scheme for grading the gross morphology of the human intervertebral disc [J]. Spine, 1990, 15(5): 411-415.

[9]Freemont AJ. The cellular pathobiology of the degenerate intervertebral disc and discogenic back pain [J]. Rheumatology, 2009, 48(1): 5-10.

[10] Smith LJ, Nerurkar NL, Choi KS,etal. Degeneration and regeneration of the intervertebral disc: lessons from development [J]. Dis Model Mech, 2011, 4(1): 31-41.

[11] 羅栩偉. 腺病毒介導(dǎo)的GDF-5促進(jìn)退行性變椎間盤髓核細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的實驗研究 [D]. 川北醫(yī)學(xué)院, 2012.

[12] Roberts S，Evans H，Trivedi J，etal. Histology and pathology of the human intervertebral disc [J].J Bone Joint Surg Am, 2006, 88(2):10-14.

[13] Gruber HE, Fisher EC Jr, Desai B,etal. Human intervertebral disc cells from the annulus: three-dimensional culture in agarose or alginate and responsiveness to TGF-beta1 [J]. Exp Cell Res, 1997, 235(1):13-21.

[14] Sakai D. Future perspectives of cell-based therapy for intervertebral disc disease [J]. Eur Spine J, 2008, 17(S4):452-458.

Isolation, culture and identification of human degenerative nucleus pulposus cells in vitro

LUO Xuwei, LI Yan, LIU Kang, et al

(ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCells,NanchongCentralHospital·TheSecondClinicalInstituteofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

ObjectiveTo observe the morphological features and analyze the biological characteristics of human degenerative nucleus pulposus (NP) cells isolated in vitro. MethodsNP tissues were separated and collected from human degenerated intervertebral disc samples. After sequential enzymatic digestion of collagen II and trypsin, cells from the NP tissues were isolated and cultured in monolayer. The morphological features and growth of NP cells were observed by an inverted microscope after subculture. The biological characteristics of NP cells was analyzed and identified by the measurement of sulfated glycosaminoglycan (sGAG), Immunohistochemical staining, Safranine-O staining and real-time PCR at three time points. ResultsNP cells were star-shaped, polygonal and spindle-shaped, which were similar to the cartilage-like cells. After passage, the cell volume was larger than that of primary generation. We clearly observed that human NP cells can produce a large content of sGAG. Immunostaining of NP cells showed that type-II collagen was stained dark brown, and aggrecan showed red fluorescence. Safranin-O staining created a red appearance in all cell culture lines. The mRNA levels of collagen II and aggrecan were determined in NP cells using real-time PCR performed with the SYBR Green PCR kit. These researches confirmed that no significant effect was observed among each point. ConclusionThe sequential enzymatic digestion of collagen II and trypsin can simplify the isolation process of NP cells which can improve the culture efficiency. We observed that NP cells had a fast multiplication rate, typical exosyndrome of chondrocyte, and satisfactory biological characteristics. The expression of proteoglycans and collagen II were identified by a sustained and steady modality in NP cells.

Nucleus pulposus; Cell; Culture; Biological characteristics

國家自然科學(xué)基金資助項目(81201407、81171472、81071270、30872614)；四川省杰出青年學(xué)科帶頭人資助計劃(09ZQ026-005)；四川省科技支撐計劃項目(2010SZ0048)；南充市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)資金項目(11A0115)；川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計劃重點培育項目(CBY11-A-ZP01)

馮剛，教授，本刊副主編，E-mail: genecloner@163.com

Q 813.1

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.004

2016-04-22； 編輯： 張文秀)