番茄紅素提純工藝條件的研究

楊　陽(yáng)，劉　蕊，王英明，張玉丹，李　巖，陳寶瑾，任　航

（1.新疆紅帆生物科技有限公司，新疆 庫(kù)爾勒 841100；2.中國(guó)專利技術(shù)開發(fā)公司，北京 100088；3.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院，上海 200125；4.哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 哈爾濱 150025）

番茄紅素提純工藝條件的研究

楊陽(yáng)1，劉蕊1，王英明1，張玉丹1，李巖2，陳寶瑾3，任航4

（1.新疆紅帆生物科技有限公司，新疆 庫(kù)爾勒 841100；2.中國(guó)專利技術(shù)開發(fā)公司，北京 100088；3.上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院，上海 200125；4.哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江 哈爾濱 150025）

以番茄紅素油樹脂為原料，利用皂化法和重結(jié)晶法作為主要提純工藝，純化得出高含量的番茄紅素晶體。通過單因素及正交試驗(yàn)，確定番茄紅素提純工藝的最佳提取條件為番茄紅素油樹脂∶丙三醇∶氫氧化鉀∶無水乙醇比例4∶3∶1∶1（V/V），皂化溫度70℃，皂化時(shí)間2.5 h，重結(jié)晶時(shí)間48 h，在此條件下番茄紅素純度達(dá)到61.64%。

番茄紅素油樹脂；皂化法；重結(jié)晶法；提純工藝

番茄紅素（lycopene）的分子式為C40H56，分子質(zhì)量為536.88，屬于異戊二烯類化合物，是一種脂溶性色素，它被認(rèn)為是目前市場(chǎng)最具商業(yè)價(jià)值及健康價(jià)值的保健產(chǎn)品之一，并且番茄紅素是天然產(chǎn)物中很少能夠獨(dú)立起作用的化學(xué)物質(zhì)［1-3］。最近這些年，關(guān)于天然提取物與患病率之間作用的研究已非常受關(guān)注［4-5］。天然提取物作為功能性食品或藥物的成分，與其他各種化學(xué)物質(zhì)的相互作用成為調(diào)節(jié)人體生物機(jī)能的重要過程［6-7］。番茄紅素的提取方法主要有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法及超臨界二氧化碳提取法等［8-9］。由于目前番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品售價(jià)相當(dāng)高，所以怎樣將得到的番茄紅素油樹脂提純得到純度更高的番茄紅素是值得研究的一個(gè)課題［10］。本試驗(yàn)首先利用氫氧化鉀對(duì)番茄紅素油樹脂進(jìn)行皂化反應(yīng)，除去油樹脂中的游離脂肪酸及大部分脂肪酸甘油酯，再加入有機(jī)溶劑對(duì)粗提物進(jìn)行初步提取，然后進(jìn)行第二次皂化反應(yīng)，形成水溶性皂化物，最后用重結(jié)晶法得到純度較高的番茄紅素晶體［11-14］。本方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，成本較低，并且還不需要貴重復(fù)雜的儀器，可為番茄紅素純品的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)［15］。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

3%番茄紅素油樹脂（超臨界CO2方法萃取得到）：新疆紅帆生物科技有限公司。

氫氧化鉀、無水乙醇、丙三醇、乙酸乙酯、鹽酸均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

B-260恒溫水浴鍋：北京泰克儀器有限公司；DZF-6090真空干燥箱：上海雷韻試驗(yàn)儀器制造有限公司；722s紫外可見光分光光度計(jì)：北京泰克儀器有限公司；BCD-248WBJV冰箱：海爾集團(tuán)。

1.3方法

1.3.1番茄紅素油樹脂的皂化

將番茄紅素油樹脂、丙三醇、氫氧化鉀及無水乙醇按照一定的皂化比例，在一定皂化時(shí)間及溫度條件下進(jìn)行皂化反應(yīng)，經(jīng)充分反應(yīng)后加蒸餾水混勻，靜置分層，然后用分液漏斗萃取分離，過濾得到的番茄紅素晶體用弱鹽酸進(jìn)行中和，并用大量的蒸餾水沖洗至中性，真空干燥得到皂化后的番茄紅素產(chǎn)品。

1.3.2番茄紅素油樹脂的重結(jié)晶純化

以乙酸乙酯為重結(jié)晶溶劑，稱取適量皂化后的番茄紅素油樹脂，溶于70℃的乙酸乙酯中溶解達(dá)到飽和，濾去不溶物，再在水浴中勻速降溫至晶體大量析出，采用在0℃條件下對(duì)番茄紅素進(jìn)行純化，純化后的番茄紅素在4℃條件下避光保存。

1.3.3單因素試驗(yàn)

皂化比例（體積比）的確定：番茄紅素油樹脂、丙三醇、氫氧化鉀及無水乙醇按照2∶2∶1∶1、3∶2∶1∶1、3∶3∶1∶1、4∶3∶1∶1、4∶4∶1∶1的比例，在溫度為70℃水浴條件下皂化反應(yīng)1 h，皂化反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行重結(jié)晶，重結(jié)晶時(shí)間為24 h，然后測(cè)定提純后的番茄紅素純度。

皂化溫度的確定：將番茄紅素油樹脂、丙三醇、氫氧化鉀及無水乙醇按照4∶3∶1∶1的比例分別在溫度為55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴條件下皂化反應(yīng)1 h，皂化反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行重結(jié)晶，重結(jié)晶時(shí)間為24 h，然后測(cè)定提純后的番茄紅素純度。

皂化時(shí)間的確定：將番茄紅素油樹脂、丙三醇、氫氧化鉀及無水乙醇按照4∶3∶1∶1的比例，在溫度為70℃水浴條件下分別進(jìn)行皂化反應(yīng)1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，皂化反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行重結(jié)晶，重結(jié)晶時(shí)間為24 h，然后測(cè)定提純后的番茄紅素純度。

重結(jié)晶時(shí)間的確定：將番茄紅素油樹脂、丙三醇、氫氧化鉀及無水乙醇按照4∶3∶1∶1的比例，在溫度為70℃水浴條件下皂化反應(yīng)1 h，皂化反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行重結(jié)晶，重結(jié)晶時(shí)間分別為12 h、18 h、24 h、36 h、48 h，然后測(cè)定提純后的番茄紅素純度。

1.3.4正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以皂化比例、皂化溫度、皂化時(shí)間和重結(jié)晶時(shí)間為4個(gè)影響因素，番茄紅素純度為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（43）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　番茄紅素提純工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for lycopene purification technology optimization

1.3.5測(cè)定方法

準(zhǔn)確稱50mg左右的樣品于100mL容量瓶中，加入2 mL二氯甲烷使樣品充分溶解，然后加入石油醚中分散定容，過濾后取濾液在波長(zhǎng)502 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)。番茄紅素的純度計(jì)算公式：

式中：C為番茄紅素的純度，%；A為濾液吸光度值；N為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量，g；3078為1%番茄紅素在含2%二氯甲烷的正己烷中的消光系數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1皂化比例對(duì)番茄紅素提純工藝的影響

表2　皂化比例對(duì)番茄紅素提純工藝的影響Table 2 Effect of saponification ratio on the purification technology of lycopene

從表2可知，當(dāng)皂化比例為2∶2∶1∶1（V/V）時(shí)，番茄紅素純度最低，僅為29.25%，提純效果最差；當(dāng)皂化比例為4∶3∶1∶1（V/V）時(shí)番茄紅素純度最高，達(dá)到55.97%，提純效果最好。發(fā)現(xiàn)隨著皂化比例的增加，番茄紅素提純濃度增加，當(dāng)皂化比例超過4∶3∶1∶1（V/V）時(shí)，番茄紅素純度反而下降，原因可能是皂化作用可以除去原料中的一些雜質(zhì)，有利于溶劑提取番茄紅素，但番茄紅素對(duì)堿不穩(wěn)定，堿性過強(qiáng)容易發(fā)生氧化而損耗，因此，堿的比例增加反而濃度會(huì)下降。因此，選擇最佳皂化比例為4∶3∶1∶1（V/V）。

2.1.2皂化溫度對(duì)番茄紅素提純工藝的影響

表3　皂化溫度對(duì)番茄紅素提純工藝的影響Table 3 Effect of saponification temperature on the purification technology of lycopene

從表3可知，當(dāng)皂化溫度為55℃時(shí)，番茄紅素純度最低，僅為30.78%，提純效果最差；當(dāng)皂化溫度為70℃時(shí)，番茄紅素純度最高，達(dá)到58.77%，提純效果最好。溫度＞70℃以后，提純效果下降，原因可能是由于番茄紅素對(duì)熱很不穩(wěn)定，在溫度較高時(shí)會(huì)發(fā)生氧化降解反應(yīng)及順反異構(gòu)，從而造成番茄紅素提純濃度的下降。因此，選擇最佳皂化溫度為70℃。

2.1.3皂化時(shí)間對(duì)番茄紅素提純工藝的影響

表4　皂化時(shí)間對(duì)番茄紅素提純工藝的影響Table 4 Effect of saponification time on the purification technology of lycopene

從表4可知，當(dāng)皂化時(shí)間為1 h時(shí)，番茄紅素純度最低，僅為45.78%，提純效果最差；當(dāng)皂化時(shí)間為2.0 h時(shí)，番茄紅素純度最高，達(dá)到59.63%，提純效果最好。皂化時(shí)間＞2.0 h之后，提純效果下降，原因可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，原料溫度快速上升，使得番茄紅素發(fā)生氧化降解反應(yīng)及順反異構(gòu)，從而造成番茄紅素提純濃度的下降。因此，選擇最佳皂化時(shí)間為2.0 h。

2.1.4重結(jié)晶時(shí)間對(duì)番茄紅素提純工藝的影響

表5　重結(jié)晶時(shí)間對(duì)番茄紅素提純工藝的影響Table 5 Effect of recrystallization time on the purification technology of lycopene

從表5可知，當(dāng)重結(jié)晶時(shí)間為12 h時(shí)，番茄紅素純度最低，僅為46.66%，提純效果最差；當(dāng)重結(jié)晶時(shí)間為36 h時(shí)，番茄紅素純度最高，達(dá)到60.07%，提純效果最好。理論上，重結(jié)晶時(shí)間越長(zhǎng)，番茄紅素提純濃度自然也越高，但由于番茄紅素的穩(wěn)定性比較差，隨著重結(jié)晶時(shí)間的延長(zhǎng)，番茄紅素也在逐漸氧化降解和異構(gòu)化，那么純度就必然會(huì)降低。從晶體剛出現(xiàn)時(shí)到重結(jié)晶時(shí)間為36 h時(shí)番茄紅素晶體的顏色逐漸加深，但是當(dāng)重結(jié)晶時(shí)間達(dá)到48 h時(shí)，晶體的顏色變淺，其原因可能與番茄紅素的氧化分解和異構(gòu)化有關(guān)。因此，選擇最佳重結(jié)晶時(shí)間為36 h。

2.2正交試驗(yàn)

表6　番茄紅素提純工藝優(yōu)化L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of L9（34）orthogonal experiments for lycopene purification technology optimization

根據(jù)表6的正交試驗(yàn)結(jié)果可見，本試驗(yàn)研究的4個(gè)因素對(duì)番茄紅素的提純效果均有影響，其影響程度順序?yàn)樵砘壤驹砘瘻囟龋局亟Y(jié)晶時(shí)間＞皂化時(shí)間。通過極差分析可知，最佳工藝組合為A2B2C3D3，即皂化比例為4∶3∶1∶1（V/V），皂化溫度為70℃，皂化時(shí)間為2.5 h，重結(jié)晶時(shí)間為48h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，番茄紅素的純度為61.64%。

3　結(jié)論

以3%番茄紅素油樹脂為原料，研究了皂化比例、皂化溫度、皂化時(shí)間、重結(jié)晶時(shí)間對(duì)番茄紅素提純工藝的影響。結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)番茄紅素純度影響的顯著程度依次為皂化比例＞皂化溫度＞重結(jié)晶時(shí)間＞皂化時(shí)間。最佳的提純工藝條件為皂化比例為4∶3∶1∶1（V/V）、皂化溫度為70℃、皂化時(shí)間為2.5 h、重結(jié)晶時(shí)間為48 h時(shí)，在此條件下，番茄紅素純度可達(dá)61.64%。

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Research of purification technology of lycopene

YANG Yang1，LIU Rui1，WANG Yingming1，ZHANG Yudan1，LI Yan2，CHEN Baojin3，REN Hang4
（1.Xinjiang Tomato Red Co.，Ltd.，of Biological Science and Technology，Korla 841100，China；2.China Patent Technology Development Corporation，Beijing 100088，China；3.Shanghai Punan Hospital of Pudong New District，Shanghai 200125，China；4.Harbin Food and Drug Inspection Center，Haerbin 150025，China）

Using the lycopene oleoresin as raw material，the lycopene crystal with high content was obtained by saponification and recrystallization method which were the main purification technology.By single factor and orthogonal experiments，the optimum extraction conditions of lycopene were determined as lycopene oleoresin：glycerol：potassium hydroxide：absolute ethyl alcohol ratio 4∶3∶1∶1（V/V），saponification temperature 70℃，saponification time 2.5 h and recrystallization time 48 h.Under the conditions，the purity of lycopene was up to 61.64%.

lycopene oleorisine；saponification method；recrystallization method；purification technology

TS264.2

0254-5071（2016）03-0111-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.025

2016-01-18

楊陽(yáng)（1987-），男，助理工程師，碩士，主要從事保健品開發(fā)利用的工作。