芪桂益脈靈對大鼠急性心肌缺血模型P38及ERK 1/2蛋白表達(dá)的影響

徐京育， 張超越， 趙 龍

芪桂益脈靈對大鼠急性心肌缺血模型P38及ERK 1/2蛋白表達(dá)的影響

徐京育1， 張超越2， 趙 龍2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管病四科， 黑龍江 哈爾濱 150040 2.黑 龍 江 中 醫(yī) 藥 大 學(xué) 研 究 生 學(xué) 院， 黑龍江 哈爾濱 150040）

目的：觀察芪桂益脈靈對大鼠急性心肌缺血模型心肌組織中P38及ERK1/2蛋白表達(dá)的影響。方法：取SD大鼠50只，隨機(jī)分為5組，空白對照組灌服生理鹽水后不做任何處理，假手術(shù)組灌服生理鹽水后，開胸暴露左冠狀動(dòng)脈，穿線但不作結(jié)扎，其余大鼠分別分成單純?nèi)毖俟嘧⒔M、芪桂益脈靈低劑量組和芪桂益脈靈高劑量組，分別給生理鹽水、芪桂益脈靈（大、小劑量），連續(xù)灌服7d，并且結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支造成急性心肌梗死模型，造模成功后，取其心臟組織用中性福爾馬林固定。用免疫組化法檢測心肌組織P38和ERK1/2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：單純?nèi)毖俟嘧⒔MP-P38和P-ERK1/2與假手術(shù)術(shù)組比較蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；灌藥組與單純?nèi)毖俟嘧⒔M比較，P-P38表達(dá)明顯降低，PERK1/2表達(dá)升高顯著（P＜0.05），高劑量組效果更佳。結(jié)論：芪桂益脈靈能夠抑制P38通路，減輕其磷酸化，并且能夠升高ERK1/2磷酸化水平，減輕炎癥因子的產(chǎn)生，減少心肌細(xì)胞的凋亡，能夠協(xié)同減輕缺血再灌注損傷。

芪桂益脈靈； 心肌缺血再灌注； P38絲裂原活化蛋白激酶； ERK1/2細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶

P38絲裂原活化蛋白激酶家族是體內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一［1，2］，ERK1/2細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶也是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和生存信號通路的重要部分。目前已發(fā)現(xiàn)的MAPK信號通路至少有3條，即EAK通路、JNK通路以及P38MAPK通路。EAK主要是由有絲分裂刺激源激活，而P38主要由應(yīng)激刺激及炎癥因子刺激下激活［3］。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，芪桂益脈靈能抑制急性缺血再灌注損傷大鼠模型血管細(xì)胞粘附分子-1和微血管細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)，減輕由炎癥導(dǎo)致的血管損傷，保護(hù)心臟功能。本研究，將進(jìn)一步探討，芪桂益脈靈對心肌缺血再灌注損傷P38和ERK1/2信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與分組：健康雄性SD大鼠50只，體重200～250g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號：SCXK（黑）2013-004］。將大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，最終入組8只?？瞻捉M每天清晨空腹灌服2mL生理鹽水、假手術(shù)組每天清晨空腹灌服生理鹽水2mL、單純?nèi)毖俟嘧⒔M每天清晨空腹灌服生理鹽水2mL、芪桂益脈靈低劑量組每天清晨空腹灌服芪桂益脈靈0.6g/kg 2 mL、芪桂益脈靈高劑量組每天清晨空腹灌服芪桂益脈靈1.2 g/kg 2 mL。

1.2 主要試劑：芪桂益脈靈中藥復(fù)方，由黨參，黃芪，黃連，三七，苦參，龍齒，桂枝，麥冬，五味子，炒棗仁組成，藥物來自江陰天江藥業(yè)有限公司，每毫升相當(dāng)于生藥1.25mg；Sc-7149（兔一抗）試劑盒，sc-101759（兔一抗）試劑盒，pv-9001（兔二抗）試劑，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。BS-3016R HPR（兔一抗）試劑、BS-0022R HPR（兔二抗）試劑，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要設(shè)備及儀器：①小動(dòng)物呼吸機(jī)（DH-150浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn)）；②心電機(jī)（ECG-1150型，上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司）；③低溫冰箱（日本三洋公司）；④電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；⑤NiKon E200光學(xué)顯微鏡（日本）；⑥冰凍切片機(jī)。

1.4 模型制備：SD大鼠飼用20%烏拉坦（1g/kg）腹腔麻醉固定于手術(shù)臺上并監(jiān)測心電，氣管切開，連小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量為12ml，呼吸頻率為90次/min，呼吸比為1：1。從胸骨左緣3、4肋間開胸，鈍性分離打開心包膜，充分的暴露心臟；于左心耳和肺動(dòng)脈圓錐之間，經(jīng)左冠狀動(dòng)脈前降支下淺層心肌穿過一條絲線，兩端穿一條聚乙烯塑料管，末端用小動(dòng)脈夾固定，最后將心臟送回胸腔。通過夾緊、打開小動(dòng)脈夾造成冠狀動(dòng)脈的缺血和再通。記錄冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎前后及再通后心電圖。空白組：只開胸，不穿線，不結(jié)扎；假手術(shù)組：開胸、只穿線但不結(jié)扎；單純?nèi)毖俟嘧⒔M：末次灌藥后1h行左主冠狀動(dòng)脈結(jié)扎60min，再灌注180min；芪桂益脈靈高、低劑量組造模方法與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相同。造模成功評判標(biāo)準(zhǔn)：心電圖示：S-T段拱背向上抬高；反復(fù)灌注后出現(xiàn)心律失常。

1.5 p38、ERK1/2的檢測：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取大鼠心臟，采用0.9%的氯化鈉溶液沖洗，用4%中性福爾馬林固定，采用免疫組化法檢測。檢測步驟如下：①脫蠟、水化組織切片；②根據(jù)應(yīng)用的一抗的特殊要求，對組織切片進(jìn)行預(yù)處理；③3%H2O2去離水孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；④PBS沖洗，2min3次；⑤滴加一抗，室溫或37度孵育1～2h，PBS沖洗，3次/2min。⑥滴加試劑1，37度孵育10～20min，2min PBS沖洗3次；⑦滴加試劑2，37度孵育10～20min，PBS 2min沖洗3次；⑧應(yīng)用DAB溶液顯色⑨用生理鹽水，進(jìn)行充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。見圖1、圖2。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，所有資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）的形式表示，多組間比較用單因素方差分析，組間差異比較用SNK -q檢驗(yàn)，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 P38和P-P38實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)各組大鼠心肌組織中P38蛋白表達(dá)較穩(wěn)定，無顯著差異，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；假手術(shù)組與空白組相比，大鼠心肌病理情況并無明顯差異，肌纖維排列相對規(guī)則，細(xì)胞核橢圓形，間質(zhì)未見明顯異常，P-P38蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明不結(jié)扎不引起P38MAPK信號通路的激活；缺血再灌注組與空白組和假手術(shù)組比較，心肌纖維出現(xiàn)斷裂溶解，間質(zhì)出現(xiàn)水腫且增大，P-P38蛋白表達(dá)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05），說明心肌缺血再灌注能夠使P38MAPK信號通路激活，使其磷酸化，也進(jìn)一步表明造模的成功；芪桂益脈靈組與單純?nèi)毖俟嘧⑾啾?，心肌間質(zhì)水腫減輕，心肌纖維排列較為規(guī)則，P-P38蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高低劑量組比較，高劑量組心肌組織水腫現(xiàn)象減輕的更加明顯，P-P38降低更明顯（P＜0.05），說明芪桂益脈靈能夠抑制P38MAPK磷酸化水平，對缺血心肌具有保護(hù)作用，高劑量組效果更佳。

2.2 ERK1/2和P-ERK1/2實(shí)驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)各組大鼠心肌組織中ERK1/2蛋白表達(dá)較穩(wěn)定，無顯著差異，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；假手術(shù)組與空白組相比，大鼠心肌病理情況并無明顯差異，肌纖維排列相對規(guī)則，細(xì)胞核橢圓形，間質(zhì)未見明顯異常，P-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明不結(jié)扎不能激活ERK1/2信號通路。

2.3 缺血再灌注組與空白組和假手術(shù)組比較，心肌纖維出現(xiàn)斷裂溶解，間質(zhì)出現(xiàn)水腫且增大，P-ERK1/2蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明心肌急性缺血再灌注損傷能夠激活ERK1/2信號通路，提高其磷酸化水平，也表明造模的成功；芪桂益脈靈組與單純?nèi)毖俟嘧⑾啾?，心肌間質(zhì)水腫減輕，PERK1/2蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05）；高低劑量組比較，高劑量組心肌組織水腫現(xiàn)象減輕的更加明顯，P-ERK1/2升高更顯著（P＜0.05），說明芪桂益脈靈能夠提高P38MAPK磷酸化水平，對缺血心肌具有保護(hù)作用，高劑量組效果更佳。

表1 各組大鼠心肌組織P38 P-P38 ERK1 /2 P-ERK1 /2 蛋白水平的比較s）

表1 各組大鼠心肌組織P38 P-P38 ERK1 /2 P-ERK1 /2 蛋白水平的比較s）

注：灌藥組與單純?nèi)毖俟嘧⒔M比較均P＜0.05，高劑量組與低劑量組比較P＜0.05

組別　n　P38　P-p38　ERK1/2　P-ERK1/2空白組　8　0.80±0.25　1.23±1.12　0.75±0.05　0.32±0.03假手術(shù)組　8　0.82±0.09　2.55±1.43　0.75±0.05　0.38±0.02單純?nèi)毖俟嘧⒔M　8　0.84±0.30　13.69±3.65#　0.82±0.12　0.78±0.13◇芪桂益脈靈低劑量組　8　0.82±0.14　7.90±2.09#△○　0.81±0.14　2.12±0.11◇☆★芪桂益脈靈高劑量組　8　0.78±0.21　5.16±1.63#△○　0.82±0.21　2.31±.0.21◇☆★

圖1 P-P38組圖

圖2 P-ERK1/2組圖

3 討 論

近年來，血運(yùn)重建術(shù)迅速發(fā)展和推廣應(yīng)用，已經(jīng)成為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病治療的重要手段之一，該法能夠迅速讓缺血心肌恢復(fù)血流供應(yīng)，但在此同時(shí)，又會(huì)造成相關(guān)損傷［4］。目前中藥對缺血再灌注損傷心肌影響效應(yīng)及機(jī)制研究主要有以下幾個(gè)方面：①調(diào)控凋亡基因，拮抗細(xì)胞凋亡；②減少白細(xì)胞聚集，拮抗粘附分子表達(dá)；③改善心血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)血管活性因子活性；④保護(hù)細(xì)胞線粒體，改善細(xì)胞能量代謝；⑤抑制心肌細(xì)胞氧自由基、抗氧化；⑥抑制心肌細(xì)胞鈣超載；⑦干預(yù)MIRI期間的炎癥反應(yīng)。中藥能多靶點(diǎn)，多途徑對缺血再灌注損傷的發(fā)揮護(hù)作用［5］。有研究表明，內(nèi)皮損傷是心肌缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素，粘附分子是介導(dǎo)內(nèi)皮損傷的重要環(huán)節(jié)，而P38MAPK信號通路在調(diào)控粘附分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)過程中起到重要作用，缺氧等應(yīng)急刺激、炎性因子等作用于內(nèi)皮細(xì)胞使P38MAPK磷酸化激活，損傷內(nèi)皮細(xì)胞，可見，抑制P38信號通路，能對心肌細(xì)胞起保護(hù)作用［6］。

ERK1/2是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及生存信號通路的重要部分，該通路的激活對缺血心肌保護(hù)有重要的作用，它可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡、防止心肌細(xì)胞的壞死。有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2通路的激活，可參與蛋白質(zhì)和糖原的合成、葡萄糖的攝取和細(xì)胞的存活等多個(gè)細(xì)胞過程，心肌缺血后可引起 ERK1/2活性降低，所以提高ERK1/2活性，可以抑制細(xì)胞凋亡，起到心肌保護(hù)作用［7］。故本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞凋亡入手，探討芪桂益脈靈對缺血再灌注損傷P38通路和ERK1/2通路的影響。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，芪桂益脈靈不增加P38和ERK1/2的總表達(dá)，而是通過降低P38磷酸化水平，提高ERK1/2磷酸化水平抑制細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)。由此表明，芪桂益脈靈具有很好的改善急性心肌缺血再灌注損傷，減輕心肌的壞死灶，改善心肌的病理學(xué)改變，保護(hù)損傷心肌。

芪桂益脈靈本方由黃芪、桂枝、三七、黨參、麥冬、五味子等藥物組成，方中黃芪補(bǔ)氣諸藥之最，可補(bǔ)全身之氣，桂枝溫通經(jīng)脈，二藥相互配伍，為補(bǔ)氣通脈的主藥；黨參助黃芪增強(qiáng)補(bǔ)氣行氣作用；三七活血化瘀，養(yǎng)血行血通脈。諸藥相互配伍，實(shí)現(xiàn)益氣活血化瘀通脈之功效。此外，現(xiàn)在藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能清除自由基，促進(jìn)血清蛋白質(zhì)的更新，促進(jìn)機(jī)體代謝，擴(kuò)張冠脈血管和外周血管，黨參、麥冬、五味子能增加冠脈血流量，降低心肌耗氧，改善微循環(huán)。芪桂益脈靈能夠下調(diào)缺心肌組織P-P38蛋白表達(dá)，升高P-ERK1/2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，具有抗心肌缺血損傷的作用。

［1］ 金世云，何淑芳，吳昊，等.MAPK通路在瑞芬太尼預(yù)處理減輕心衰大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷中的作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2014，11：1590～1595.

［2］ 鄭曉丹，嚴(yán)世蕓，秦仲君.通心脈方對大鼠心肌缺血再灌注損傷AKt及p38αMAPK蛋白表達(dá)的影響［J］.中醫(yī)研究，2011，6：14～17.

［3］ 武敏.ERK1/2在不同年齡大鼠離體心臟缺血后適應(yīng)中的保護(hù)作用［D］.河北醫(yī)科大學(xué)，2014.

［4］ 王峰，李建生，高劍峰.川芎嗪、參附注射液及聯(lián)合應(yīng)用預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護(hù)作用［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，16：147～151.

［5］ 蔡麗.大鼠腦缺血再灌注損傷Cathepsin D介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與ERK1/2信號通路的關(guān)系［D］.南華大學(xué)，2014.

［6］ 田明慧.厄貝沙坦對大鼠心肌缺血再灌注細(xì)胞凋亡與ERK1/2通路的影響［D］.遼寧醫(yī)學(xué)院，2012.

［7］ 李焰，劉鳳麗，田艷霞，等.依達(dá)拉奉對腦缺血再灌注損傷后p-ERK1/2表達(dá)的影響［J］.天津醫(yī)藥，2010，4：310～312，355.

黑龍江省自然科學(xué)基金，（編號：H201326）

趙 龍

1006-6233（2016）08-1302-04

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.08.027