骨肉瘤中CD133和ALDH1免疫組織化學(xué)表達(dá)和血管生成增加

錢太保俞 嵐張長春周建生

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科；2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，蚌埠 233003）

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骨肉瘤中CD133和ALDH1免疫組織化學(xué)表達(dá)和血管生成增加

錢太保1*俞 嵐2張長春1周建生1

（1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科；2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，蚌埠 233003）

目的 檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和ALDH1在骨肉瘤（osteosarcoma，OS）中的免疫組織化學(xué)表達(dá)及其與微血管密度（microvessel density，MVD）的關(guān)系，并分析它們與骨肉瘤患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。方法 通過免疫組織化學(xué)ElivisionTMplus法檢測100例人骨肉瘤標(biāo)本和20例骨軟骨瘤標(biāo)本（作為對照組）中CD133、ALDH1和CD34蛋白（微血管標(biāo)志物）的表達(dá)。結(jié)果 在OS組織中CD133和ALDH1的免疫組織化學(xué)染色陽性率明顯高于骨軟骨瘤組織。CD133和ALDH1的陽性表達(dá)率與OS患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)與否、肺部轉(zhuǎn)移與否、Enneking分期高低均呈正相關(guān)；與OS患者的性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小及組織學(xué)類型等無關(guān)。MVD計數(shù)與OS患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)與否、肺部轉(zhuǎn)移與否及Enneking分期均呈正相關(guān)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，CD133和ALDH1的陽性率及MVD計數(shù)之間均呈正相關(guān)。結(jié)論 CD133和ALDH1的表達(dá)升高參與OS的浸潤、局部復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移過程，并可能促進(jìn)OS組織中的血管生成。

骨肉瘤；CD133；ALDH1；微血管密度；腫瘤干細(xì)胞

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是臨床常見的、主要發(fā)生于青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤，也是導(dǎo)致青少年死亡的常見惡性腫瘤［1］。目前，骨肉瘤的治療方式主要是綜合治療，即術(shù)前化療，手術(shù)治療，術(shù)后化療的模式，可以改善患者的預(yù)后［2］，但仍有部分患者因?qū)熕幃a(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致局部復(fù)發(fā)或肺轉(zhuǎn)移。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和放、化療失敗的主要原因［3］。所謂腫瘤干細(xì)胞是指腫瘤組織內(nèi)少量擁有自我更新、促進(jìn)分化、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞群。CD133是最常見的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物之一，最早是作為造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物被發(fā)現(xiàn)的，后來在許多惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有其反常表達(dá)。乙醛脫氫酶1（Aldehyde dehydrogenase 1，AL-DH1）是乙醛脫氫酶家族成員之一，其主要作用是促進(jìn)視黃醛向視黃酸轉(zhuǎn)化，而后者可以引起維生素A代謝相關(guān)的細(xì)胞增殖與分化，其反常表達(dá)，可以促進(jìn)惡性腫瘤的增殖與侵襲［4-7］。腫瘤干細(xì)胞生存的微環(huán)境需要大量的微血管和淋巴管［8］，而反映血管生成活性最常用的指標(biāo)是微血管密度（microvessel density，MVD），其數(shù)量的多少與惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］。盡管TNM分期作為設(shè)計OS患者的治療策略已被廣泛接受，但其不能精確地反應(yīng)OS的生物學(xué)行為，因此迫切需要尋找一些新的且能夠反映OS生物學(xué)行為的生物標(biāo)記。本研究主要通過免疫組織化學(xué)方法檢測100例OS組織中CD133、ALDH1和CD34蛋白的表達(dá)，分析它們之間的相互關(guān)系以及在OS患者中臨床意義，旨在找到能夠預(yù)測OS患者轉(zhuǎn)移與預(yù)后的指標(biāo)。

材料和方法

1 材料

收集安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科2007年1月-2010年12月間存檔石蠟包埋OS組織標(biāo)本100例（活檢前未行放療、化療等抗腫瘤治療，病理確診后再行術(shù)前新輔助化療、手術(shù)、術(shù)后化療等綜合治療）和骨軟骨瘤組織標(biāo)本20例，所有病例均經(jīng)過本院病理科復(fù)查為原發(fā)性骨肉瘤。其中男性77例，女性23例；年齡11～48歲，中位年齡19歲。普通型骨肉瘤72例，非普通型骨肉瘤8例；位于下肢有73例，上肢21例，軀干6例；Enneking外科分期：Ⅱ期73例，Ⅲ期27例。腫瘤長徑＜5.0cm有45例，≥5.0cm有55例。

2 試劑

鼠抗人單克隆抗體CD133和ALDH1均購自美國Abcam公司；鼠抗人單克隆抗體CD34購自美國Santa Cruz公司；ElivisionTMplus試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

3 免疫組織化學(xué)染色

所有的OS標(biāo)本和對照組標(biāo)本均經(jīng)4%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，然后于二甲苯溶液及濃度梯度的乙醇溶液中脫蠟至水洗。免疫組織化學(xué)染色方法按ElivisionTMplus試劑盒說明書進(jìn)行。DAB顯色后水洗，然后經(jīng)蘇木素染細(xì)胞核、分化、返藍(lán)、脫水透明和樹膠封片等。采用PBS液替代一抗作陰性對照，陽性對照為已知的CD133、ALDH1和CD34切片。

4 統(tǒng)計分析

CD133和ALDH1的免疫組織化學(xué)結(jié)果主要通過著色的強(qiáng)度和范圍綜合計分得出，即0分為不著色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分為棕黃色；隨機(jī)選取10個高倍視野，計數(shù)陽性腫瘤細(xì)胞所占百分比，＜10%為0分，11%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。兩者相乘，得出積分結(jié)果，若積分＜3分為陰性，若積分≥3分則為陽性。免疫組化標(biāo)記結(jié)果則由兩位病理醫(yī)師采用獨立雙盲法來判定。

MVD通過計數(shù)10個低倍視野中熱點區(qū)域的CD34標(biāo)記陽性小管狀結(jié)構(gòu)獲得［10］。

所有數(shù)據(jù)均通過SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。在OS組中，CD133和ALDH1蛋白的表達(dá)以及MVD計數(shù)的高低與對照組及各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性采用χ2、Spearman等級相關(guān)及t檢驗等，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 OS組織中高表達(dá)CD133與OS復(fù)發(fā)及肺轉(zhuǎn)移正相關(guān)

圖1　CD133免疫反應(yīng)性。A，OS組織；B，骨軟骨瘤組織；比例尺，50μmFig.1 Immunoreactivity of CD133.A，OS tissue；B，osteochondroma tissue；scale bar，50μm

CD133在對照組中的陽性率為 5.0%（1/20），在OS組中的陽性率為47.0%（47/100）（圖1），表達(dá)顯著升高。CD133蛋白的陽性率與OS患者的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小及腫瘤類型等均無相關(guān)性，但與OS患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)與否、肺轉(zhuǎn)移與否及Enneking外科分期等均呈正相關(guān)，與腫瘤壞死率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即CD133的陽性率越高，越易于局部復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移、Enneking分期和腫瘤壞死率越低（表1）。

表1　OS組織中CD133、ALDH1蛋白的表達(dá)和MVD計數(shù)與臨床各病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1 Correlation between the expression of CD133、ALDH1 and the scores of MVD and clinicopathological characteristics in OS

2 OS組織中ALDH1表達(dá)與OS復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移正相關(guān)

ALDH1蛋白在OS組和對照組中的陽性率分別為52.0%（52/100）和5.0%（1/20）（圖2），表達(dá)顯著高于其在對照組中的表達(dá)。隨著ALDH1蛋白表達(dá)的陽性率越高，OS越容易發(fā)生局部復(fù)發(fā)、肺轉(zhuǎn)移、Enneking分期越高和化療后腫瘤越難發(fā)生壞死。ALDH1蛋白的陽性率與OS患者的年齡、性別、腫瘤位置等均無相關(guān)性，與腫瘤大小及腫瘤類型等有關(guān)。

圖2　ALDH1免疫反應(yīng)性。A，OS組織；B，骨軟骨瘤組織；比例尺，50μmFig.2 Immunoreactivity of ALDH1.A，OS tissue；B，osteochondroma tissue；scale bar，50μm

3 OS組織中MVD計數(shù)與其復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移正相關(guān)MVD計數(shù)（圖3）與OS患者術(shù)后局部復(fù)發(fā)與否、肺部轉(zhuǎn)移與否、Enneking外科分期高低及腫瘤壞死率等均呈正相關(guān)關(guān)系，與患者的性別、年齡、腫瘤位置等無關(guān)，與OS腫瘤大小及腫瘤類型等相關(guān)（表1）。

圖3　CD34免疫反應(yīng)陽性微血管。A，OS組織；B，骨軟骨瘤組織；比例尺，50μmFig.3 CD34 positive immunoreactive microvessels.A，OS tissue；B，osteochondroma tissue；scale bar，50μm

4 OS組織中CD133、ALDH1的表達(dá)和MVD計數(shù)之間的關(guān)系

Spearman等級相關(guān)分析顯示CD133蛋白的表達(dá)與ALDH1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系；CD133蛋白的陽性率與MVD計數(shù)之間呈正相關(guān)關(guān)系（因MVD的均數(shù)為21.2±6.8，故取MVD計數(shù)＜21為陰性，≥21時為陽性）；ALDH1蛋白的陽性率與MVD計數(shù)之間呈正相關(guān)關(guān)系（表2）。

表2　OS中CD133、ALDH1和MVD計數(shù)之間的相互關(guān)系Table 2 The relationship of CD133 and ALDH1 expression and MVD scores in OS

討 論

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）是近年來腫瘤學(xué)研究中的熱門話題，典型的腫瘤干細(xì)胞具有自我更新能力、多向分化潛能、可塑性和耐藥性。因此，目前的常規(guī)放、化療等均難以徹底根除腫瘤干細(xì)胞，是腫瘤治療失敗的常見原因。在乳腺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤中均已成功分離出腫瘤干細(xì)胞［11］。CD133是最常見的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，又名prominin-1，其分子量為120kDa，是一個擁有5次跨膜結(jié)構(gòu)的糖蛋白。近年來的研究表明，CD133陽性的骨肉瘤細(xì)胞具有干性，因此可以作為骨肉瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物之一［12］。本研究發(fā)現(xiàn)CD133在OS組織的陽性率顯著高于其在對照組中的陽性率，且CD133的表達(dá)與Enneking分期高有關(guān)，意味著CD133陽性表達(dá)的OS患者預(yù)后可能更差，可能與其CD133陽性的OS細(xì)胞較多相關(guān)。由于CD133陽性率越高，常規(guī)放化療等治療后，其殘留的干細(xì)胞就越多，越易于導(dǎo)致OS患者的局部復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移。此外，與其他研究相比，本研究還發(fā)現(xiàn)，CD133陽性率與腫瘤壞死率呈負(fù)相關(guān)，說明CD133陽性表達(dá)的OS細(xì)胞很難被化療藥物殺死。

乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）是一個位于細(xì)胞核、細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)酶家族，不僅可以解除細(xì)胞醛或藥物的毒性，同時也是一個重要的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物［13-15］。ALDH1是ALDH家族重要成員之一，其位于9號常染色體，有13個外顯子。ALDH1可以作為參與氧化視黃醇為視黃酸的酶，也可以促進(jìn)維生素A相關(guān)的細(xì)胞增殖與代謝［4-5］。ALDH1過表達(dá)能夠增加乙醇相關(guān)的癌的發(fā)病風(fēng)險［16］。越來越多的證據(jù)表明，ALDH1表達(dá)反常增高的患者往往意味著其易于轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良。目前關(guān)于ALDH1在OS組織中表達(dá)的研究不是很多。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在OS組織中ALDH1的陽性表達(dá)率顯著高于其在對照組中的陽性率；且隨著ALDH1的陽性率增高，OS患者越易于發(fā)生局部復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移，Enneking分期也越高，與國內(nèi)外文獻(xiàn)在其它腫瘤組織中報道的結(jié)果相一致［17-18］。ALDH1在OS中的表達(dá)意義可能與CD133一樣，發(fā)揮著其干細(xì)胞標(biāo)記物的作用。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移都離不開營養(yǎng)和氧。為了滿足其生長和轉(zhuǎn)移的需要，腫瘤會通過各種方式來誘導(dǎo)血管形成。當(dāng)宿主所能提供的營養(yǎng)和氧不能滿足其需要時，就會導(dǎo)致腫瘤組織的壞死。MVD是判斷血管生成活性最常用指標(biāo)［19］。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)有局部復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移OS患者其MVD計數(shù)顯著高于未發(fā)生局部復(fù)發(fā)和肺轉(zhuǎn)移的患者，且MVD計數(shù)越高，Enneking分期越高，即MVD計數(shù)高的OS患者易于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，且預(yù)后差。

術(shù)前化療后腫瘤壞死率是目前預(yù)測OS患者對化療敏感性的最可靠指標(biāo)，壞死率高的OS患者其預(yù)后較好［20］。本研究還發(fā)現(xiàn)100例OS患者中，65例術(shù)前化療后腫瘤壞死率＜90%，35例術(shù)前化療后腫瘤壞死率≥90%。CD133和ALDH1在腫瘤壞死率＜90%組中陽性率分別是60.0%（39/65）和70.8%（46/65），在壞死率≥90%組中陽性率分別為22.8%（8/35）和17.1%，說明腫瘤壞死率高的OS組織CD133和ALDH1的陽性率顯著低于其在腫瘤壞死率低的OS組織中的陽性率；而MVD計數(shù)在壞死率＜90%組和≥90%組中分別為22.3±6.5和19.1±6.8，也說明壞死率高的OS組織MVD計數(shù)顯著低于其在壞死率低的OS組織中的計數(shù)，提示高表達(dá)的CD133和ALDH1及高計數(shù)的MVD均有可能會降低化療的有效率。這可能與CSCs主要居于細(xì)胞周期中的G0期（靜止期），常規(guī)的放、化療很難有效的殺滅CSCs，所以其壞死率低，從另外一個角度說明CSCs具有天然的抵抗放、化療特性；而高計數(shù)的MVD則進(jìn)一步加大了殺滅OS細(xì)胞的難度。

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在OS組織中，CD133和ALDH1蛋白的表達(dá)與MVD計數(shù)之間均呈正相關(guān)關(guān)系。已有的研究表明，腫瘤干細(xì)胞生存的微環(huán)境中具有大量的微血管和微淋巴管。腫瘤干細(xì)胞的存在，可以促進(jìn)OS逐漸生長。當(dāng)生長到一定大小時，腫瘤干細(xì)胞就會通過各種方式來誘導(dǎo)血管生成，以滿足其快速生長所需。由于新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞不完善，因此腫瘤細(xì)胞很容易通過這些不完善的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，最終導(dǎo)致腫瘤的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來的研究也表明，腫瘤干細(xì)胞本身也可以形成血管結(jié)構(gòu)［21］。

本研究表明，腫瘤干細(xì)胞的存在可能是OS發(fā)生的根源，CD133和ALDH1表達(dá)的反常增高可能會促進(jìn)OS的快速增殖，大量新生血管的形成則進(jìn)一步促進(jìn)OS的局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，CD133、ALDH1的陽性表達(dá)和MVD計數(shù)可以預(yù)測OS的浸潤和轉(zhuǎn)移。

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Increase in immunohistochemical expression of CD133 and ALDH1 and angiogenesis in osteosarcoma

Qian Taibao1*，Yu Lan2，Zhang Changchun1，Zhou Jiansheng1
（1Department of Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College；2Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003，China）

Objective Objective To explore the expression of CD133 and ALDH1 and the scores of microvessl density（MVD）in osteosarcoma（OS）and their relationship to clinic pathological parameters.MethodsImmunostaining of CD133，ALDH1 and CD34 was performed in 100 cases of osteosarcoma.20 cases of osteochondroma were used as controls.Results The positive rates of CD133 and ALDH1 expression in OS and controls were 47.0%，52.0%vs.5.0%，5.0%，respectively，with significant differences between the two groups.The expression of CD133 and ALDH1 was significantly related with local recurrence，lung metastasis，and Enneking stage of OS patients.There was no significant association between the expression of CD133 or ALDH1 and such characteristics as gender，age，tumor location，tumor diameter，and histological type.The scores of MVD were significantly related with local recurrence，lung metastasis，and Enneking stage of OS patients.Spearman analysis showed that there was a positive association among the expression of CD133，ALDH1 and the scores of MVD.Conclusion High expression of CD133 and ALDH1 is involved in the process of invasion，local recurrence，and metastasis of OS，and may promote angiogenesis.

osteosarcoma；CD133；ALDH1；microvessel density；cancer stem cells

R738.1

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-02-06 〔修回日期〕2016-03-20

錢太保，男（1976年），漢族，副主任醫(yī)師

（To whom correspondence should be addressed）：tb197686@126.com