乳腺癌中高水平乙酰肝素酶促進腫瘤微血管和微淋巴管生成

岳喜成李　靖安程程李德群胡仲翔

（1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科三病區(qū)；2安徽省立醫(yī)院，蚌埠 233000）

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乳腺癌中高水平乙酰肝素酶促進腫瘤微血管和微淋巴管生成

岳喜成1*李靖1安程程1李德群1胡仲翔2

（1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科三病區(qū)；2安徽省立醫(yī)院，蚌埠 233000）

目的 分析乳腺癌組織中乙酰肝素酶（heparinase，HPA）的表達與臨床病理指標、微血管密度（micro vessel density，MVD）和微淋巴管（micro lymphatic density，MLD）之間的相關(guān)性及與預后的關(guān)系，探討HPA在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用。方法 應用免疫組織化學方法檢測浸潤性乳腺癌組織中HPA水平及CD34和D2-40分別標記的微血管和微淋巴管，觀察乳腺癌組織中HPA水平與MVD及MLD的關(guān)系，并與患者年齡、腫瘤大小、組織學分級、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期進行相關(guān)分析。結(jié)果 在乳腺癌組織中，HPA免疫反應性明顯增強，陽性率明顯高于癌旁組織，以陽性CD34為標志的MVD增高，以陽性D2-40為標志的MLD降低；HPA陽性乳腺癌組織中MVD和MLD明顯高于HPA陰性乳腺癌組織；乳腺癌中HPA水平與腫瘤大小、組織學病理學級別和臨床分期呈正相關(guān)。結(jié)論 HPA與乳腺癌的微血管和微淋巴管生成密切相關(guān)，HPA可以作為評價乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移情況的重要指標。

乳腺癌；乙酰肝素酶；微血管密度；微淋巴管密度

乳腺癌是威脅全世界女性健康第一位惡性腫瘤，發(fā)病率每年約以2%的速度遞增，全世界每年約有140萬婦女發(fā)生乳腺癌，50萬婦女死于乳腺癌。我國目前乳腺癌的發(fā)病率也較前明顯升高，發(fā)病率增速居世界第一，發(fā)病年齡較前提前，其中遠處轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療失敗的關(guān)鍵。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個涉及多個步驟的復雜過程，必須完成兩個關(guān)鍵步驟：一是突破由基底膜（basement membrane，BM）和細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）構(gòu)成的組織屏障，二是新生血管、淋巴管的形成，一些臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微血管密度（micro vessel density，MVD）與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預后密切相關(guān)；隨著腫瘤微血管密度的增大，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等惡性潛能也明顯增強［1］。此外腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的癌周組織微淋巴管密度（micro lymphatic density，MLD）明顯高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者［2］。HPA被證明是唯一一種可降解哺乳動物ECM和BM中硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteogycans，HSPGs）中硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的內(nèi)源性糖苷內(nèi)切酶，由于在腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用，以其作為腫瘤治療靶點成為新的研究熱點。CD34是一種比較特異的血管內(nèi)皮標記物，而D2-40是相對特異的淋巴管內(nèi)皮標記物［3］。本研究通過檢測乳腺癌組織及癌旁組織中HPA的表達狀況，并結(jié)合MVD和MLD，探討肝素酶與乳腺癌轉(zhuǎn)移和浸潤的關(guān)系。

材料和方法

1 病例資料

選取蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2006年1月-2010年12月獲得隨訪資料的浸潤性乳腺癌患者200例，找出相應的石蠟包埋的腫瘤組織和癌旁組織，所有病理診斷為乳腺浸潤性導管癌?；颊吣挲g29～80歲，中位年齡51.4歲。均行乳腺癌改良根治術(shù)，術(shù)前未接受化療、放療及其他抗癌治療，并且術(shù)前相關(guān)檢查未見肝、肺以及骨轉(zhuǎn)移。臨床分期采用TNM分期法進行分期，其中Ⅰ期71例，Ⅱ期69例，Ⅲ期70例。組織學分級Ⅰ級57例，Ⅱ級82例，Ⅲ級61例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者104例，無轉(zhuǎn)移96例。腫瘤直徑≤2cm者91例，＞2cm者109例。同時選取相應的癌旁組織。

2 試劑

HPA山羊多克隆抗體、HPA（SC.14900）及SABC試劑盒購自Santa Cruz公司，CD34及D2-40單克隆抗體購于武漢博士德公司，通用型二步法PowerVisionTM試劑盒（IgG抗體HRP多聚體，PV-6002）購自北京中山公司。

3 免疫組織化學染色

HPA檢測采用SABC法，操作步驟按說明書進行；CD34、D2-40檢測采用通用型二步法進行，切片常規(guī)脫蠟，水化，用3%過氧化氫去除內(nèi)源性酶，微波抗原修復。滴加一抗（小鼠抗人CD34單克隆抗體）4℃過夜，PBS沖洗后滴加二抗（山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體）PowerVisionTM孵育30min，DAB顯色。用已知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

4 結(jié)果判定

HPA陽性判斷標準：胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性細胞。高倍鏡下取4個視野各計數(shù)200個細胞，按陽性細胞所占百分比分為：-，無腫瘤細胞染色；+，5%～20%的腫瘤細胞染色；++，21%～50%的腫瘤細胞染色；+++，＞50%的腫瘤細胞染色。

微血管密度計數(shù)：于低倍鏡下（4倍物鏡）觀察整張切片血管分布情況后，選擇癌灶周圍間質(zhì)血管密集區(qū)，中倍鏡下（20倍物鏡）視野下計算5個不同區(qū)域的微血管數(shù)，取其平均值為MVD（微血管數(shù)/中倍視野）。計數(shù)時管腔直徑≤50um者判斷為微血管，＞50um或管壁含肌層者不作為微血管計算。另單個染色細胞或成群無管腔染色細胞也作為單個微血管計數(shù)。

微淋巴管密度計數(shù)：于低倍鏡下觀察整張切片血管分布情況后，選擇癌灶周圍間質(zhì)血管密集區(qū)，200倍視野下計算5個不同區(qū)域的微淋巴管數(shù)，取其平均值為MLD（微淋巴管數(shù)/中倍視野）。計數(shù)時，管腔直徑≤50μm者判斷為微淋巴管，＞50μm不作為微淋巴管計算。

5 統(tǒng)計分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所得MVD和MLD數(shù)據(jù)用x±s表示，資料采用χ2檢驗及校正χ2檢驗或Fisher精確概率法，HPA與MVD、MLD的關(guān)系采用t檢驗。P＜0.05為具有明顯統(tǒng)計學差異。

結(jié) 果

1 乳腺癌組織中HPA免疫組織化學表達增強

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，HPA主要在腺細胞胞質(zhì)內(nèi)表達，部分血管內(nèi)皮細胞內(nèi)也有表達。在200例癌周正常組織中，HPA免疫反應呈強陽性（+++）、中度陽性（++）、弱陽性（+）和陰性者（-）分別為3例（1.5%）、3例（1.5%）、17例（8.5%）和 177例（88.5%）；在乳腺癌組織中，HPA免疫反應性較癌旁組明顯增強（圖1，表1）：在200例患者的癌組織中，HPA免疫反應呈強陽性（++ +）、中度陽性（++）、弱陽性（+）和陰性者（-）分別為43例（21.5%）、48例（24.0%）、40例（20.0%）和69例（34.5%）。

圖1　乳腺癌組織及癌旁組織中HPA免疫組織化學染色。A，乳腺癌組織，箭示HPA陽性細胞；B，癌旁組織H，箭示HPA陽性細胞；比例尺，100μmFig.1 Immunohistochemical stain for HPA in the breast cancer tissues and the paracancerous tissue.A，breast cancer tissue，arrow indicating HPA positive cell；B，paracancerous tissue，arrow indicating HPA positive cell；scale bar，100μm

表1　乳腺癌與癌旁組織HPA陽性率比較Table 1 Comparison of HPA positive rates in the breast cancer and paracarcinoma tissues

2 乳腺癌組織中MVD增高MLD降低

免疫組織化學染色顯示，在乳腺癌組織間質(zhì)中，CD34陽性反應產(chǎn)物位于內(nèi)皮細胞胞質(zhì)，D2-40陽性產(chǎn)物定位于內(nèi)皮細胞胞質(zhì)和胞膜；癌旁組織中CD34、D2-40免疫反應性較弱（圖2）。對分別被CD34和D2-40陽性標記微血管進行計數(shù)統(tǒng)計顯示，在乳腺癌組織中，MVD明顯高于癌旁組織，而MLD低于癌旁組織（表2）。

圖2　乳腺癌組織及癌旁組織間質(zhì)微血管CD34及D2-40免疫組織化學表達。A1，乳腺癌組織，箭示CD34染色；A2，癌旁組織，箭示CD34染色；B1，乳腺癌組織，箭示D2-40染色；B2，癌旁組織，箭示D2-40染色；比例尺，100μmFig.2 Immunohistichemical expression of CD34 and D2-40 in the breast cancer tissues and paracancerous tissue.A1，breast cancer tissue，arrow showing CD34 positive staining；A2，paracancerous tissue，arrow showing CD34 positive staining；B1，breast cancer tissue，arrow showing D2-40 positive staining；B2，paracancerous tissue，arrow shows D2-40 positive staining；scale bar，100，μm

表2　乳腺癌組織與癌旁組織MVD和MLD數(shù)比較Table 2 Comparison of MLD and MVD in breast cancer and paracarcinoma tissues

3 乳腺癌組織中MVD和MLD與HPA免疫反應性呈正相關(guān)

在200例乳腺癌組織中，131例HPA陽性者MVD為63.30±10.21，MLD為10.05±1.66，69例HPA陰性者MVD為33.18±13.45，MLD為2.16± 1.21，HPA陽性者MVD和MLD明顯高于HPA陰性者，相關(guān)分析顯示兩者呈顯著正相關(guān)（表3）。由此提示乙酰肝素酶的水平與腫瘤微血管和微淋巴管生成關(guān)系密切。

表3　乳腺癌組織中HPA水平與MVD和MLD的關(guān)系Table 3 Relationship between HPA level and MVD and MLD in the breast cancer

4 乳腺癌中HPA水平與腫瘤大小、組織學級別和臨床分期呈正相關(guān)

癌組織中HAP免疫反應性強弱與乳腺癌臨床特征的關(guān)系分析顯示，乳腺癌患者的腫瘤直徑、組織學分級、腋淋巴結(jié)狀況、臨床分期有關(guān)，與患者年齡無關(guān)。腫瘤越大、組織學級別越高、臨床分期越晚，HPA陽性率就越高；腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HPA的陽性率顯著高于腋淋巴結(jié)陰性組（表4）。

討 論

人類HPA是一種哺乳動物的β-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，有2種基因亞型，即HPA-1和HPA-2，HPA-1和HPA-2在正常和異常組織中的表達有顯著差異，生理情況下，HPA-1的表達被嚴格限制在胎盤滋養(yǎng)層、血道細胞及角質(zhì)形成細胞，而在幾乎所有的人類惡性腫瘤中均有表達［4］，HPA-2主要在正常的腦、乳腺、前列腺、睪丸和子宮組織中有較高的表達，而在異常組織中目前僅發(fā)現(xiàn)在胰腺癌組織中有較高的表達［4，5］。我們通常所說的HPA主要是指HPA-l基因表達的酶蛋白，其在炎癥、損傷、以及惡性腫瘤生長與轉(zhuǎn)移等多種病理改變中普遍存在。

表4　乳腺癌組織中HPA免疫反應性與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 4 Relationship between HPA immunoreactivity and clinical pathological parameters in the breast cancer

HPA主要通過以下幾個途徑促進腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移：①HPA可直接降解ECM和BM的HSPGs而破壞ECM及BM的完整性；②HPA裂解HSPGs后產(chǎn)生的HS片段可激活HS的受體CD44v3（CD44 variantexon3），發(fā)出細胞內(nèi)遷移信號，促使細胞變形、運動，從而促進腫瘤細胞的擴散與轉(zhuǎn)移［6］；③HPA促進內(nèi)皮下尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator，u-PA）及組織型纖溶酶原激活物（tissue type plasminogen activator，t-PA）的釋放，使纖溶酶原激活，從而促進ECM及BM的降解［7］；④HPA降解HSPGs后的產(chǎn)物可以抑制激活的T淋巴細胞，降低機體對腫瘤的免疫監(jiān)視，使腫瘤細胞更易侵襲與轉(zhuǎn)移；⑤介導細胞黏附：表達于細胞表面的HPA可介導細胞對ECM及BM的黏附，引起細胞在基質(zhì)中擴散以及促進BM的重建，幫助細胞侵入血管和淋巴管［8］。此外，Vlodoansky等［9］發(fā)現(xiàn)，在體外將EBT淋巴瘤細胞傳染HPA基因后，其血管和淋巴管生成能力均明顯提高。

近年來，乳腺癌的發(fā)病率逐漸升高，而轉(zhuǎn)移則是患者死亡的主要因素，因此探討乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制以及尋找控制轉(zhuǎn)移的相關(guān)靶點治療乳腺癌的重要途徑。目前腫瘤源性的血管和淋巴管生成成為研究熱點，而其與HPA之間的相關(guān)性也越來越受到重視。

本實驗采用CD34、D2-40抗體研究乳腺惡性腫瘤及癌旁組織中的MVD、MLD變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺惡性腫瘤中及癌旁組織中的MVD、MLD存在顯著差異，乳腺浸潤性導管癌中MVD明顯高于癌旁組織，癌旁組織中MLD明顯高于乳腺癌組織。我們分析認為腫瘤細胞自身能夠分泌促血管生長因子，一方面為自身生長提高養(yǎng)分，另一方面促使腫瘤細胞通過血液轉(zhuǎn)移至其他器官；而乳腺癌組織中的淋巴管系統(tǒng)在腫瘤發(fā)展過程中因浸潤受阻，可能是由于該區(qū)域內(nèi)癌細胞增殖過快、細胞間產(chǎn)生高壓作用，導致淋巴系統(tǒng)無法延伸，新生淋巴管受壓塌陷、萎縮，成為無功能淋巴管；而同一階段在癌巢周邊區(qū)域，新生淋巴管數(shù)目明顯增多，且多為擴張狀，預示淋巴系統(tǒng)增生活躍，為腫瘤細胞周邊轉(zhuǎn)移等提供著有利條件。同時通過研究HPA免疫組織化學表達水平與MVD、MLD之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在HPA陽性乳腺浸潤性導管癌中，MVD和MLD明顯高于HPA陰性者，表明HPA對乳腺癌血管和淋巴管生成有重要的作用。我們的實驗結(jié)果也顯示，在乳腺浸潤性導管癌中HPA的陽性表達率明顯高于癌旁正常乳腺組織；同時，腫瘤的分期越晚、癌分化程度越低、直徑越大其HPA的陽性表達率就越高。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的陽性表達率也高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，提示HPA的表達與乳腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此根據(jù)本實驗結(jié)果，我們認為HPA與乳腺癌的血管、淋巴管生成和浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；HPA可以作為判斷乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移的一個重要指標。

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High level of heparinase promotes the formation of tumor microvascular and lymphatic vessels in breast cancer

Yue Xicheng1*，Li Jing1，An Chengcheng1，Li Dequn1，Hu Zhongxiang2
（1Third Department of Tumor Surgery，F(xiàn)irst Affilicated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu；2Anhui Provincial Hospital，Bengbu 233000，China）

Objective To explore the connection among clinical pathological indicators，microvessel density（MVD），micro lymphatic density（MLD）and the expression of heparinase（HPA）in breast cancer tissue，we analyze the relationship between HPA and prognosis，and explore the role of HPA in breast cancer occurrence，development and metastasis.Methods Immunohistochemical markers HPA，CD34 and D2-40 were applied to observe the relationship between the expression of MVD，MLD and HPA in breast cancer tissue.Their relationships with the age of patients，tumor size，histological grade，axillary lymph node metastasis，and clinical stage were analyzed.Results In the breast cancer tissues，the level of HPA increased significantly，and the positive rate was significantly higher than that in the adjacent tissues，with MVD as the sign of CD34 increased and MLD as the sign of D2-40 decreased. MVD and MLD in HPA positive breast cancer tissues were significantly higher than those in HPA negative breast cancer tissues.The level of HPA in breast cancer was positively correlated with tumor size，histological grade and clinical stage.Conclusion HPA is closely related to MVD and MLD in breast cancer；HPA can be used as an important index for evaluating the infiltration and metastasis of breast cancer.

breast cancer；heparinase；microvascular density；microlymphatic vessel density

R737.9

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2015-05-05 〔修回日期〕2016-2-27

岳喜成，男（1972年），漢族，副主任醫(yī)師

（To whom correspondence should be addressed）：yuexicheng@163.com