丹參含藥血清抑制瘦素及Hh信號通路激活誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞中EVC2和Gli2表達上調(diào)

韓仕慶曹文富*馮藜　櫪

（重慶醫(yī)科大學(xué)1中醫(yī)藥學(xué)院，2中醫(yī)藥研究室，3附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016）

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丹參含藥血清抑制瘦素及Hh信號通路激活誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細胞中EVC2和Gli2表達上調(diào)

韓仕慶1，2曹文富1，2*馮藜櫪3

（重慶醫(yī)科大學(xué)1中醫(yī)藥學(xué)院，2中醫(yī)藥研究室，3附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016）

目的 觀察丹參含藥血清是否可以通過抑制瘦素誘導(dǎo)的刺猬（Hedgehog，Hh）信號通路中纖毛蛋白（Ellis-van creveld syndrome protein 2，EVC2）和鋅指轉(zhuǎn)錄因子2（GLI family zinc finger protein 2，Gli2）的表達從而抑制大鼠肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）的增殖。方法 丹參水煎劑、生理鹽水灌胃大鼠10天后收集各組血清。應(yīng)用高效液相色譜儀檢測丹參含藥血清中有效成分（丹參素、丹參酮IIA）的含量。將處于對數(shù)生長期的HSCs傳代于6孔板，分為6組（空白對照組、瘦素組、瘦素+抑制劑組、瘦素+丹參組、瘦素+激動劑組、瘦素+激動劑+丹參組），每組分別培養(yǎng)在相應(yīng)含藥血清中，24h后收集細胞。采用MTT檢測細胞增殖情況，免疫熒光檢測EVC2在各組HSCs中的表達，Western blot測定EVC2和Gli2蛋白水平，RT-PCR法檢測EVC2和Gli2 mRNA水平。結(jié)果 瘦素能刺激HSCs的活化增殖，使EVC2和Gli2表達量顯著升高；Hh通路抑制劑和丹參能抑制瘦素對HSCs增殖的活化作用和對EVC2、Gli2表達的上調(diào)作用；丹參對Hh通路激動劑與瘦素共同作用所致的HSCs增殖極強活化和EVC2、Gli2表達極強上調(diào)也具有明顯抑制作用。結(jié)論 丹參可以通過抑制Hh信號通路中EVC2、Gli2的表達，從而對活化的HSCs產(chǎn)生抑制作用。

Hh信號通路；肝星狀細胞；EVC2；Gli2；肝纖維化

肝纖維化是肝臟對各種原因引起的肝組織損傷的一種慢性持續(xù)性修復(fù)反應(yīng)，其形成是細胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）合成大于降解的病理過程。肝內(nèi)ECM的合成主要來源于活化的肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSCs）。近年實驗表明，刺猬（Hedgehog，Hh）信號通路的異常激活可使HSCs活化增強從而促進肝纖維化。在胚胎發(fā)育期間，Hh信號通路是調(diào)控祖細胞的生長和分化及各組織、器官生長的一條相對保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在肝臟受到損傷后，這條信號通路被激活，活化的Hh信號通路參與肝損傷修復(fù)反應(yīng)的多個方面，包括肝祖細胞的增殖，肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化與生成，肝臟多種細胞的凋亡等［1］。目前認為，Hh信號通路由Hh配體、膜蛋白受體復(fù)合物、核轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因4部分組成［2］。纖毛蛋白（Ellis-van creveld syndrome protein 2，EVC2）在Hh信號傳導(dǎo)中作為正向調(diào)節(jié)因子在膜蛋白受體復(fù)合物（主要為7次跨膜蛋白Smo）下游傳遞信號因子并激活鋅指因子相關(guān)蛋白［3］，使鋅指因子蛋白復(fù)合物（如：Gli2/3A）從抑制復(fù)合物上解離下來。當(dāng)Gli2/3A蛋白復(fù)合物從微管上解離后，經(jīng)酶磷酸化使鋅指轉(zhuǎn)錄因子2（GLI family zinc finger protein 2，Gli2）得到釋放［4］。隨后Gli2在核中聚集，轉(zhuǎn)為較強的轉(zhuǎn)錄活性形式（Gli2-A），激活下游靶基因并促進HSCs的不斷活化增殖，由此可能促進肝纖維化發(fā)展。缺失Evc2不影響Smo被激活，但能抑制Smo激活下游Hh信號，由此說明Evc2是激活Gli成為活性狀態(tài)的關(guān)鍵因子。Gli2的表達可直接反映Hh信號通路的活性狀態(tài)，是Hh信號通路的主要轉(zhuǎn)錄激活子［5］。激活的Hh信號通路促使HSCs不斷活化與增殖，分泌大量ECM，使得ECM不斷沉積，加重肝纖維化。有實驗表明［6］，瘦素可通過上調(diào)Hh信號通路中Gli的表達激活Hh信號通路；瘦素激活Hh信號通路后Gli2是參與HSCs增殖和肝纖維化發(fā)展的重要因子［7］；瘦素可通過多途徑（如：JAK，P38，ERK/12信號通路）誘導(dǎo)HSCs不斷活化增殖［8-11］?；罨腍SCs自表達Hh配體，激活Hh信號通路，使HSCs增殖形成惡性循環(huán)，形成肝纖維化［12］。本研究應(yīng)用瘦素誘導(dǎo)HSCs不斷活化增殖，建立肝纖維化模型，選擇Hh信號通路中起關(guān)鍵作用的Evc2和Gli2作為觀察對象，采用丹參和抑制劑（cyclopamine）干預(yù)被活化的HSCs，觀察上述藥物對EVC2和Gli2是否產(chǎn)生抑制作用，并且比較丹參與抑制劑的抑制程度；同時，以Hh信號通路特異性激動劑（purmorphamine）充分活化Hh信號通路，使HSCs不斷增殖，模擬重度肝纖維化，并在此基礎(chǔ)上觀察丹參是否仍具有干預(yù)作用。

材料和方法

1 材料

180g～200g SD大鼠40只（雌雄各半），購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。HSCs購自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化科，丹參購自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。Hh通路激動劑（purmorphamine）和抑制劑（cyclopamine）購自Selleck公司，兔抗鼠EVC2抗體購自Santa Cruz，兔抗鼠Gli2購自北京博奧森公司，羊抗兔HRP二抗購自北京中杉公司，羊抗兔FITC熒光二抗購自北京冠星宇科技有限公司，四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，瘦素購自PeproTech。島津高效液相色譜儀（島津LC-20A），PCR儀（Applied Biosy Stems），核酸蛋白分析儀（BECKMAN DU640），凝膠成像系統(tǒng)（Blo-RAO Gel Doc 2000），激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2，德國）。

2 含藥血清制備

體重140～160g清潔級大鼠40只（雌雄各半），隨機平均分為丹參水煎劑、生理鹽水2組，動物房正常飼養(yǎng)1周，至體重在180～200g時，分別以丹參水煎劑、生理鹽水灌胃，每日8：00 am定時灌胃一次，連續(xù)給藥10d。丹參水煎劑組以高劑量6.25g/kg/d灌胃（丹參灌胃低劑量為1.5625g/kg，依據(jù)“動物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表”所得，2倍、4倍劑量作為中、高劑量）。空白組給予生理鹽水10ml/kg/d。末次給藥后1h，每只大鼠用不加抗凝劑無菌取血管心臟采血5～7 ml，4℃靜置過夜后，1000 r/min離心5min，取上清液即為含藥血清，經(jīng)56℃水浴滅活，0.22μm微孔過濾器過濾除菌后分裝于1.5 ml凍存管，標記后置于-80℃冰箱備用。

3 高效液相色譜法檢測丹參含藥血清中丹參有效成分

將丹參高劑量血清稀釋2倍和4倍，得到丹參低、中、高劑量血清。為了解大鼠進行丹參溶液灌胃后所得血清中丹參有效成分（如丹參素、丹參酮IIA）的吸收情況及合理的干預(yù)細胞丹參含藥血清濃度，用高效液相色譜法測定大鼠丹參含藥血清中丹參素和丹參酮IIA的含量。首先考察了以下流動相對給藥后血漿樣品測定的影響，流動相A：乙腈-0.1%甲酸水；流動相B：乙腈-1%醋酸水。結(jié)果表明，只有流動相B使丹參素、丹參酮IIA和內(nèi)標達到了基線分離，且極性較小的酚酸類成分基本不干擾樣品中丹參素和丹參酮IIA的測定。色譜條件為4.6mm× 250mm（Hypersil ODS25μm，型號：E2117074，批號：10643大連伊利特）；以乙腈-1%醋酸水為流動相，進行梯度洗脫；檢測波長為270nm，流速1.0 ml/min，進樣20μl，柱溫為室溫。丹參素線性關(guān)系考察y=2053.4x+789.94（R2=1），線性范圍為0.020813-0.666μg/ml。丹參酮IIA的線性關(guān)系考察y= 77647x+1046.6（R2=0.9995）。線性范圍為0.003125-0.1μg/ml。所得丹參含藥血清中仍然含有丹參素和丹參酮IIA等有效成分，且丹參高劑量含藥血清中丹參有效成分丹參素和丹參酮的含量顯著高于丹參中、低劑量血清。所以實驗選擇丹參高劑量含藥血清干預(yù)HSCs。

4 細胞培養(yǎng)

將HSCs置于含10%胎牛血清培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每天8：00 am換液，當(dāng)處于對數(shù)生長期時，加入0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例傳代。將處于對數(shù)生長期的HSCs細胞以5×105/ml密度接種于6孔板，分成空白對照組、瘦素組、瘦素+抑制劑組、瘦素+丹參組、瘦素+激動劑組、瘦素+激動劑+丹參組共6組進行分組處理。除空白對照組外，其余各組均加入100μg/L瘦素。其中空白對照組以10%空白鼠血清培養(yǎng)，瘦素組以10%空白鼠血清+瘦素培養(yǎng)，瘦素+抑制劑組以10%空白鼠血清+瘦素+抑制劑（20μmol/L）培養(yǎng)，瘦素+丹參組以10%丹參鼠血清+瘦素培養(yǎng)，瘦素+激動劑組以10% 空白鼠血清+瘦素+激動劑（1μmol/L）培養(yǎng)，瘦素+激動劑+丹參組以10%丹參鼠血清培養(yǎng)+瘦素+激動劑（1μmol/L）。

5 MTT檢測各種含藥血清對HSCs增殖的影響

取對數(shù)生長期細胞，常溫下1000r/min離心5min，棄上清液，加入10ml培養(yǎng)基混勻制成細胞懸液，倒置顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)。將細胞懸液按1×105/ml接種于96孔板中，每孔100μl，分為上述6個組，每組5個復(fù)孔，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，按實驗分組加入相應(yīng)含藥血清，培養(yǎng)1h后加入瘦素。培養(yǎng)24h后每孔加入 MTT溶液（5g/L）20μl，37℃孵育4h后終止培養(yǎng)，棄上清后每孔加入150μl二甲基亞砜，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀取490nm波長下，測定各孔吸光度，檢測細胞活力。

6 EVC2免疫熒光檢測

將生長于玻片上的細胞用0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4）浸洗3次，每次3min。各組細胞用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液（PB，pH7.4）固定15min，PBS浸洗3次（每次3min）后，用0.5%Triton X-100室溫通透20min；PBS浸洗3次（每次3min）后用正常山羊血清室溫封閉30min；吸水紙吸掉封閉液，滴加兔抗EVC2抗體（1：1000），4℃孵育過夜；PBS浸洗玻片3次（每次3min）后，滴加FITC標記的羊抗兔IgG（1：200），濕盒中37℃孵育1h，PBS浸洗玻片3次（每次3min）后，復(fù)染核、封片；激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

7 EVC2和Gli2 Western blot檢測

收集細胞加入含蛋白酶抑制劑的蛋白提取液提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度計算上樣量。蛋白定量：定量稱取10mg標準蛋白，加蒸餾水，溶解定溶到100ml。取6支試管，編號為0-5，分別加入標準蛋白溶液0、20、40、60、80、100ul；用蒸餾水補充體積至100ul。各試管加入工作液2ml；混勻，37℃水浴30min。以分光光度計上0為參比；檢測各樣品562nm的吸光度值。蛋白濃度為橫座標、吸光度為縱座標繪制標準曲線，取100ul樣品溶液；按步驟1-4檢測；將吸光度值填入標準曲線；計算蛋白濃度。配制10%的分離膠和5%濃縮膠，蛋白樣品加入SDS上樣緩沖液，100℃變性5min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（PIERCE膜），5%牛奶封閉2h，一抗（1：1000）孵育4h，PBS洗15min×3次。加HRP標記羊抗兔IgG（1：1000，用PBS配制），室溫下1～2h，4℃過夜，PBS洗15min×3次。顯影：將膜置于發(fā)光盤中，發(fā)光1～2min；將膜取出，放于曝光夾中，曝光夾中應(yīng)預(yù)先鋪有一層薄膜，將薄膜對折壓于膜上（膜的正面向上），在黑暗中取出膠片，鋪于膜上，將曝光夾關(guān)上，曝光2～3min。將膠片從暴光夾中取出，放入顯影液中顯影。將膠片從顯影液中取出，放入水中快速洗一下，然后定影，并掃入凝膠成象系統(tǒng)進行圖象分析（Blo-RAO Gel Doc 2000），計算光密度值（OD值=目的蛋白光密度值/內(nèi)參蛋白光密度值）。重復(fù)3次。

8 EVC2和Gli2 mRNA RT-PCR檢測

細胞培養(yǎng)達到對數(shù)生長期時，收集細胞于1.5ml EP管中進行RNA提取，紫外分光光度計測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR反應(yīng)，加樣完全后，充分混勻，簡短離心。根據(jù)GenBank上所查mRNA序列，采用軟件設(shè)計引物，以GAPDH作為內(nèi)參對照，EVC2、Gli2和GAPDH引物序列見表2。PCR儀反應(yīng)條件：94℃，5min→（94℃，30s→57℃，30s→72℃，30s）×30 cycles→72℃，10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描拍照，灰度值用Image J軟件進行分析。

表1　EVC2、Gli2與內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物大小

9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較為單因素方差分析，P＜0.01有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，應(yīng)用Prism 5軟件作圖。

結(jié) 果

1 丹參抑制瘦素與Hh通路激活誘導(dǎo)的HSCs活化增殖

瘦素與各種藥物干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠HSCs 24h后，應(yīng)用MTT法檢測HSCs的活化增殖。結(jié)果顯示，瘦素處理后，HSCs活力明顯增加；在瘦素處理的同時，加入Hh通路抑制劑和丹參均可抑制瘦素對HSCs活力的增強作用。在瘦素和Hh通路激動劑共同作用下，HSCs的活力較單純瘦素作用后活力的增加更為明顯，丹參對這種增加作用也具有極強的抑制作用（圖1）。由此表明，丹參對瘦素對Hh通路激活誘導(dǎo)的HSCs活化增殖具有明顯的抑制作用。

圖1　MTT法檢測丹參含藥血清對瘦素及Hh通路激活增強HSCs活力的影響。a，與空白對照組比較，P＜0.01；b，與瘦素組比較，P＜0.01；c，與瘦素+激動劑組比較，P＜0.01Fig.1 MTT detection for the effect of Danshen-containing serum on the viability elevation of HSCs by leptin and Hh pathway activation.a，P＜0.01，compared with blank control group；b，P＜0.01；compared with leptin group；c，P＜0.01，compared with leptin plus agonist group

2 丹參抑制瘦素與Hh通路激活所致的HSCs中EVC2和Gli2表達上調(diào)

圖2　丹參抑制瘦素與Hh通路激活所致的HSCs中EVC2上調(diào)的免疫熒光檢測。A，空白對照組；B，瘦素組；C，瘦素+抑制劑組；D，瘦素+丹參組；E，瘦素+激動劑組；F，瘦素+激動劑+丹參組；G，各組EVC2熒光強度的統(tǒng)計分析；比例尺，40μm；a，與空白對照組比較，P＜0.01；b，與瘦素組比較，P＜0.01；c，瘦素+激動劑組相比，P＜0.01；d，與瘦素+抑制劑組比較，P＞0.05Fig.2 Immunofluorescence detection for inhibition of Danshen-containing serum on the upregulation of EVC2 induced by leptin and Hh pathway activation in HSCs.A，Blank control group；B，Leptin group；C，Leptin plus inhibitor group；D，leptin plus Danshen group；E，Leptin plus agonist group；F，group leptin plus agonist and Danshen；G，Stastistic anlysis of EVC2 fluovescence intensity in the indicated groups；a，P＜0.01，compared with blank control group；b，P＜0.01，compared with leptin group；c，compared with leptin plus agonist group，P＜0.01；d，P＞0.05，compared with leptin plus inhibitor group

免疫熒光染色顯示，瘦素可使HSCs內(nèi)EVC2免疫反應(yīng)性明顯增強（圖2B），Hh通路抑制劑和丹參均可明顯抑制瘦素對HSCs內(nèi)EVC2免疫反應(yīng)性的增強作用（圖2C、2D）；在瘦素和Hh通路激動劑共同處理的HSCs中，EVC2免疫反應(yīng)性增強最為明顯（圖2E），丹參可顯著抑制這種增強作用（圖2F）。

Western blot檢測顯示，瘦素可明顯上調(diào)HSCs內(nèi)EVC2和Gli2蛋白水平，Hh通路抑制劑丹參均可明顯抑制瘦素對HSCs內(nèi)EVC2和Gli2蛋白水平的上調(diào)作用；用瘦素處理的HSCs同時給予Hh通路激動劑處理，EVC2和Gli2蛋白水平的上調(diào)作用更加明顯，但可被丹參明顯抑制（圖3）。

圖3　丹參含藥血清下調(diào)Hh信號通路中Gli2蛋白和EVC2蛋白在HSCs中的表達。A，丹參含藥血清下調(diào)Hh通路中EVC2蛋白和Gli2蛋白在HSCs中表達的Western blot檢測；B，丹參含藥血清下調(diào)Hh通路中EVC2蛋白在HSCs中統(tǒng)計學(xué)分析；C，丹參含藥血清下調(diào)Gli2蛋白的統(tǒng)計學(xué)分析；a，與空白對照組相比，P＜0.01；b，與瘦素組相比，P＜0.01；c，與瘦素+激動劑組相比，P＜0.01；d，與瘦素+丹參組相比，0.01＜P＜0.05Fig.3 The down-regulation of the expression of EVC2 and Gli2 in the Hh signaling pathway of HSCs by Danshen-containing serum.A，Western blot detection for inhibition of Danshen-containing serum on the the expression of EVC2 protein and Gli2 protein in HSCs；B，Stastic Danshen-containing serum inhibits the expression of EVC2 protein；C，anlysis shows Danshen-containing serum inhibits the expression of Gli2 protein；a，P＜0.01，compared with blank control group；b，P＜0.01，compared with leptin group；c，P＜0.01，compared with leptin plus agonist group；d，0.01＜P＜0.05，compared with leptin plus Danshen group

進一步的RT-PCR檢測顯示，HSCs內(nèi)EVC2和Gli2 mRNA表達可被瘦素上調(diào)，Hh通路抑制劑和丹參均可明顯抑制瘦素對HSCs內(nèi)EVC2和Gli2 mRNA表達的上調(diào)作用；當(dāng)用瘦素處理的HSCs同時用Hh信號通路激動劑處理后，其EVC2和Gli2 mRNA表達的上調(diào)極其顯著，丹參對這種極強的上調(diào)作用也具有明顯抑制效果（圖4）。

討 論

1 肝纖維化與HSCs的關(guān)系

圖4　丹參含藥血清抑制Hh信號通路中EVC2mRNA、Gli2mRNA在HSCs中的表達。A，丹參含藥血清抑制Hh通路中EVC2 mRNA在HSCs中表達的RT-PCR檢測；B，丹參含藥血清抑制Hh通路中EVC2 mRNA在HSCs中的表達；C，丹參含藥血清抑制Hh通路中Gli2 mRNA在HSCs中表達的RT-PCR檢測；D，丹參含藥血清抑制Hh通路中Gli2 mRNA在HSCs中的表達；a與空白對照組相比，P＜0.01；b與瘦素組相比，P＜0.01；c與瘦素+激動劑組相比，P＜0.01；d與瘦素+抑制劑組比較，P＞0.05Fig.4 The inhibition of the expression of EVC2mRNA，Gli2mRNA in the Hh signal pathway in HSCs by Danshen-containing serum.A，RT-PCR detection for inhibition of Danshen-containing serum on the the expression of EVC2mRNA in HSCsB，Danshen-containing serum inhibits the expression of EVC2 mRNA in HSCsC，RT-PCR detection for inhibition of Danshen-containing serum on the the expression of Gli2mRNA in HSCsD，Danshen-containing serum inhibits the expression of Gli2 mRNA in HSCs；a，compared with blank control group，P＜0.01；b，P＜0.01，compared with leptin group；c，P＜0.01，compared with leptin plus agonist group；d，P＞0.05，compared with leptin plus inhibitor group

肝纖維化是慢性肝損傷進展為肝硬化的重要階段。HSCs的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)［13］。本實驗對研究尚少的Hh信號通路中EVC2和Gli2進行干預(yù)，觀察丹參含藥血清是否可以通過抑制EVC2和Gli2的表達從而抑制Hh信號通路的激活，使HSCs增殖受到抑制，從而抑制肝纖維化。

2 Hh信號通路在HSCs中的表達

Hh基因最早于1980年在果蠅中發(fā)現(xiàn)，之后在多種脊椎動物和人體中均發(fā)現(xiàn)其同源基因［14］。近年研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog（Hh）信號通路在不同組織中的過度表達可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［15］。Hh信號通路在肝臟受到損傷后被激活。活化的Hh信號通路參與肝損傷修復(fù)反應(yīng)的多個方面。Guy［16］等的研究表明，肝臟損傷的嚴重性與Hh信號通路的活化水平相關(guān)。在肝纖維化中，經(jīng)典的Hh信號通路的活化依賴于Hh配體激活的Hh-Ptch-Smo-Gli。當(dāng)Hh配體與Ptch結(jié)合時，解除Ptch對Smo的抑制。此時Evc2分子在初級纖毛上聚集表達，Evc2作用于Smo膜蛋白的下游，幫助Smo傳遞Hh信號并激活Gli，使Gli2解離［17］，并在核中聚集，轉(zhuǎn)為較強的轉(zhuǎn)錄活性形式，從而促進 Hh信號通路下游 PDGF、bcl-2、VEGF、c-myc等靶標基因的異常表達并使HSCs被大量激活［18］。Evc2被證明是激活Gli成為活性狀態(tài)的關(guān)鍵因子。Gli2是Hh信號通路的主要活化物［19］。Hh信號通路的激活可以促進大量的HSC活化增殖，使ECM過度沉積，形成肝纖維化。

3 丹參、抑制劑、秋水仙堿在Hh信號通路中的作用

本實驗應(yīng)用中藥丹參、Hh信號通路抑制劑（環(huán)巴胺）干預(yù)瘦素組。丹參為唇形科植物丹參的根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，可活血祛瘀、養(yǎng)心除煩、調(diào)經(jīng)止痛。實驗結(jié)果證明抑制劑、丹參都可抑制瘦素組Hh信號通路EVC2和Gli2的表達。同時應(yīng)用丹參干預(yù)經(jīng)激動劑刺激下充分活化的HSCs，仍然能有效抑制HSCs的增殖和EVC2和Gli2的表達。證明丹參可以對不同活化程度的Hh信號通路產(chǎn)生抑制作用。對比丹參與抑制劑對EVC2、Gli2表達的影響發(fā)現(xiàn)，EVC2mRNA和Gli2mRNA表達上，兩者無明顯差異，在EVC2蛋白、Gli2蛋白的表達上，抑制劑優(yōu)于丹參。由此說明丹參具有類似抑制劑的抑制作用。但抑制劑與丹參相比，仍然具有劣勢。抑制劑（環(huán)巴胺）是以Hh信號通路中Smo為靶點從而產(chǎn)生抑制作用［20］，但由于其具有致畸作用，其應(yīng)用受到限制。雖然有由抑制劑（環(huán)巴胺）衍生出來的Smo小分子抑制劑IPI-926，但是由于未能得到預(yù)期效果，Infinity制藥公司宣布暫時中止IPI-926的II期臨床試驗［21］。中藥丹參不僅能針對肝纖維化中“瘀”的特點進行針對性治療，同時具有價格低廉、安全、有效的特點。實驗結(jié)果表明，丹參可以通過抑制EVC2和Gli2的表達從而抑制Hh信號通路表達和HSCs的活化增殖?？赡転橹委煾卫w維化提供新的思路。但仍需大量實驗探索作用廣泛、安全有效的中藥在多靶點、多環(huán)節(jié)上對Hh信號通路的作用。

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Danshen-containing serum inhibits leptin-and hedgehog signaling pathway activation-induced upregulation of EVC2-and Gli2-expression in rat hepatic stellate cells

Han Shiqing1.2，Cao Wenfu1.2*，F(xiàn)eng Lili3
（1College of Traditional Chinese Medicine，2Laboratory of traditional Chinese medicine，3The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To observe the effect of the Danshen-containing serum on expressions of Ellis-van creveld syndrome protein 2（EVC2）and GLI family zinc finger protein 2（Gli2）in Hedgehog signaling pathways of hepatic stellate cells（HSCs）induced by leptin.Methods 40 SD rats were divided into 2 groups of 20，and the blood was collected after gastric perfusion for 10 days with Danshen water decoction or normal saline.The main components of tanshinol and tanshinone IIA in the Danshen-containing serum were determined by HPLC.The HSCs in the logarithmic growth phase were passaged into six-well cluster dishes，and then divided into six groups:blank control，leptin，leptin+inhibitor，leptin+Danshen，leptin+agonist，and leptin+agonist+Danshen.Each group was cultured in the medicated serum，and the cells were collected after 24 hours.Then MTT was used to test Danshen-containing serum’s effect on the proliferation of HSCs，immunofluorescence to test the expression of EVC2，Western blot to detect the expression of EVC2 and Gli2 proteins，and RT-PCR to test the expression of EVC2 mRNA and Gli2 mRNA in each group.Results Leptin and agonist stimulated the activation and proliferation of HSCs，and significantly increased the expression of EVC2 mRNA，Gli2 mRNA，EVC2 protein and Gli2 protein in HSCs.Inhibitor and Danshen inhibited the proliferation of HSCs，and significantly decreased EVC2 and Gli2 expressions，and such expressions decreased evidently when the agonist was intervened by the Danshen-containing serum.Conclusion The Danshen-containing serum can inhibit the activated HSCs by regulating the expressions of EVC2 and Gli2 in HSCs.

Hedgehog；HSCs；EVC2；Gli2；liver fibrosis

R285

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2015-12-25 〔修回日期〕2016-03-16

國家自然科學(xué)基金項目（81573860）

韓仕慶，女（1989年），漢族，碩士研究生

（To whom correspondence should be addressed）：caowenfu9316@163.com