miR-505-3p對GT1-7細(xì)胞株基因表達(dá)譜的影響

仝 莉李 雨王茂春周宇荀肖君華*

（1東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，2東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

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miR-505-3p對GT1-7細(xì)胞株基因表達(dá)譜的影響

仝 莉1李 雨2王茂春2周宇荀2肖君華2*

（1東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，2東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

目的 了解微小RNA 505-3p（miR-505-3p）對下丘腦GnRH神經(jīng)元GT1-7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株表達(dá)譜的影響。方法 用慢病毒轉(zhuǎn)染GT1-7細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)miR-505-3p的細(xì)胞株，感染實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對照組（未經(jīng)處理的GT1-7細(xì)胞），陰性對照組（感染pLenti6.3-nc空病毒），實(shí)驗(yàn)組（感染pLenti6.3-miR-505-3p病毒）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)檢測穩(wěn)定細(xì)胞株中miR-505-3p的表達(dá)豐度，并進(jìn)一步利用芯片檢測對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的表達(dá)譜結(jié)合生物信息學(xué)方法探尋差異表達(dá)基因。采用GO分析和Pathway分析差異表達(dá)基因，解析miR-505-3p的功能。結(jié)果 在穩(wěn)定表達(dá)miR-505-3p的GT1-7細(xì)胞中，165個(gè)基因的表達(dá)量變化在2倍以上，這些基因主要參與細(xì)胞粘附、GTP分解代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生物過程。結(jié)論 miR-505-3p可能通過影響下丘腦GnRH神經(jīng)元中相應(yīng)靶基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞粘附、GTP分解代謝、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生物過程，和間隙連接、軸突導(dǎo)向和胃酸分泌等信號(hào)通路。

miR-505-3p，GT1-7細(xì)胞，表達(dá)譜，GO分析，KEGG分析

微小RNA（miRNA）是一類平均長度19-24bp的保守非編碼RNA，是一種重要的調(diào)控因子，可通過結(jié)合靶基因的3'非編碼區(qū)影響mRNA的翻譯和穩(wěn)定性［1］。每一個(gè) miRNA可以調(diào)節(jié)幾十甚至上百個(gè)基因，最終可以有效調(diào)控多個(gè)細(xì)胞通路。通過協(xié)調(diào)多個(gè)基因的表達(dá)，miRNA參與各種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長、增殖、分化和胚胎發(fā)育。因此，miRNA表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致許多病理生理學(xué)的反應(yīng)，比如免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、衰老、癌癥和心血管疾?。?，3］。

小鼠miR-505位于X染色體小鼠miR-505基因位于X染色體（物理位置60392403-60396492），其初級體90bp，前體56bp。成熟體的miR-505分為miR -505-3p（圖1）和miR-505-5p。成熟體包括miR-505-3p（圖1）和miR-505-5p。已知miR-505-3p可以誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的衰老和凋亡［4］，同時(shí)是人類原發(fā)性膽汁肝硬化［5］和高血壓［6］的生物學(xué)標(biāo)記。另外，作為一種腫瘤抑制因子，miR-505-3p通過抑制人乳腺癌上皮細(xì)胞的增殖實(shí)現(xiàn)腫瘤的抑制［7］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-505-3p可以顯著抑制小鼠性發(fā)育的啟動(dòng)，提示miR-505-3p可能對性發(fā)育啟動(dòng)的關(guān)鍵神經(jīng)元——促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）神經(jīng)元中的基因起到重要調(diào)控作用。

GnRH神經(jīng)元是控制性發(fā)育啟動(dòng)的主要神經(jīng)元，下丘腦GnRH神經(jīng)元適時(shí)激活決定性發(fā)育和成年個(gè)體的繁殖能力。但由于GnRH神經(jīng)元在動(dòng)物體內(nèi)數(shù)量很少，且分布散在，所以GnRH神經(jīng)元的研究變得十分困難［8］。1990年，Pamela L.Mellon等從轉(zhuǎn)基因小鼠下丘腦腫瘤細(xì)胞中分離出能穩(wěn)定分泌促性腺激素釋放激素（GnRH）的細(xì)胞株，并命名為GT1-7細(xì)胞。GT1-7細(xì)胞具有高度分化的GnRH神經(jīng)元的特征，其表型形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)以及激素儲(chǔ)存和分泌方式與GnRH細(xì)胞完全一致，且能在體外分裂傳代［9-10］，因此GT1-7細(xì)胞是研究GnRH神經(jīng)元的理想細(xì)胞模型。

本研究擬通過構(gòu)建miRNA-505-3p的GT1-7細(xì)胞的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，探討miR-505-3p對GT1-7細(xì)胞表達(dá)譜的影響，并通過后續(xù)的生物信息學(xué)分析找到miR-505-3p調(diào)控的生物學(xué)過程和信號(hào)通路，為后期解析miR-505-3p的功能，建立動(dòng)物模型奠定細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

圖1　小鼠miR-505-3p初級體發(fā)夾結(jié)構(gòu)。紅色部分為成熟的miR-505-3pFig.1 Stem-loop structure of mouse primary miR-505-3p.The red part represents the sequence of mature miR-505-3p

材料和方法

1 細(xì)胞株

小鼠GT1-7細(xì)胞株，由復(fù)旦大學(xué)吳曉暉教授惠贈(zèng)。

2 主要試劑

Trizol（TaKaRa公司，大連）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First strand cDNA synthesis kit，（Thermo，美國）；DNaseI（Thermo，美國）；DMEM高糖培養(yǎng)基（HyClone，美國）、胎牛血清（Gibco，美國）；PBS、胰酶、青霉素鏈霉素混合液（上海寧盛生物科技有限公司）；殺稻瘟菌素（Invitrogen，美國）；聚凝胺（Sigma，美國）。

3 實(shí)驗(yàn)儀器

PCR儀、CO2恒溫培養(yǎng)箱BB15型（Thermo，美國）；NanoDrop微量紫外分光光度計(jì)2000型（Thermo，美國）；Real-Time PCR儀7500型（Applied Biosystems Inc.，美國）；倒置相差顯微鏡I×70型（OLYMPUS，日本）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Thermo，美國）。

4 篩選建立穩(wěn)定過表達(dá)miR-505-3p的GT1-7細(xì)胞株

4.1 感染目的細(xì)胞

慢病毒干擾載體由上海英濰捷基公司（Invitrogen）構(gòu)建。慢病毒載體為pLenti6.3/V5-DEST，插入的綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）和miR-505-3p在CMV啟動(dòng)子的控制下可以普遍表達(dá)，并且該慢病毒具有殺稻瘟菌素抗性基因。得到慢病毒干擾載體后，由和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司進(jìn)行病毒包裝，得到的病毒顆粒滴度為2.83E+08。

感染前2d，胰酶消化GT1-7細(xì)胞并計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，按照4×104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種至24孔板，加入DMEM完全培養(yǎng)液，10%FBS，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)48 h，融合度達(dá)到50%～70%后，在含有病毒的培養(yǎng)液中加入聚凝胺（工作液濃度為6μg/ml），促進(jìn)病毒感染細(xì)胞；感染實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對照組（Blank，未經(jīng)處理的GT1-7細(xì)胞），陰性對照組（pLenti，轉(zhuǎn)染pLenti6.3空病毒），miR-505-3p過表達(dá)組（pLanti-miR，轉(zhuǎn)染pLenti6.3-miR-505-3p病毒）；吸去細(xì)胞的培養(yǎng)液后，加入含有不同濃度病毒的完全培養(yǎng)液500 μL，病毒的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）從10～100。培養(yǎng)18h后，吸去細(xì)胞中含有病毒的培養(yǎng)液，加入1ml新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.2 篩選GT1-7細(xì)胞

GT1-7細(xì)胞分別在含有0、1、1.5、2.5、3.5、5和6μg/ml殺稻瘟菌素（blasticidin）的DMEM，10%FBS培養(yǎng)10-14d，隔天更換一次篩選培養(yǎng)基，以最低細(xì)胞全部死亡濃度為殺稻瘟菌素最佳篩選濃度。培養(yǎng)10d后將殺稻瘟菌素濃度減半，維持篩選壓力。篩選約14d后可見有抗性克隆出現(xiàn)。將克隆放大培養(yǎng)后，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞都表達(dá)綠色熒光蛋白，則篩選結(jié)束。得到的細(xì)胞用來提取總RNA來進(jìn)行miR-505-3p的檢測。

5 miR-505-3p表達(dá)量檢測

5.1 RNA抽提

細(xì)胞按1×106密度接種于六孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后吸去上清，用預(yù)冷的PBS洗3次后，每孔加入1ml Trizol，抽提細(xì)胞總RNA。取2μl至分光光度計(jì)檢測純度和濃度，1μl進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測其完整性，余下部分立即保存于-80℃超低溫冰箱中，或立即用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

5.2 DNaseI處理

用DNaseI消化抽提的RNA中的痕量基因組DNA污染。DNaseI消化反應(yīng)體系為RNA 1μg、10× Reaction Buffer 1μl、DNaseI（1U/μl）1μl，補(bǔ)水至10μl。反應(yīng)過程為20℃15min，然后加1μl EDTA（25mmol/L），65℃ 10min使DNase I失活。

5.3 莖環(huán)引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

總RNA中包含miR-505-3p的初級體、前體和成熟體，其內(nèi)在的同源性增加了對miR-505-3p的成熟體檢測的復(fù)雜性。本實(shí)驗(yàn)室采用莖環(huán)引物對成熟的微小RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并結(jié)合SYBR-Green qRTPCR技術(shù)對其進(jìn)行定量分析，研究結(jié)果已發(fā)表在Molecular Biotechnology雜志上［11］。除此之外，本研究選取miR-16-5p為看家基因。逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物序列見表1。

表1　qRT-PCR中所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in qRT-PCR

5.4 qRT-PCR反應(yīng)體系和條件

用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列見表1。RT-PCR反應(yīng)終體系20μl包括：10μl2×SYBR Green PCR master mix，0.4μlROX，2.5μLcDNA模板，3μlPCR上下游引物（2μmol/L），4.1μl水，同時(shí)設(shè)陰性對照。PCR循環(huán)條件為95℃預(yù)變性2min，95℃變性15s，62℃延伸32s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)的特異性通過產(chǎn)物溶解曲線以及1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測進(jìn)行確認(rèn)。經(jīng)SDS2.2軟件分析循環(huán)域值（CT值）。

5.5 qRT-PCR數(shù)據(jù)分析

6 GeneChip Mouse Transcriptome Assay 1.0檢測及數(shù)據(jù)分析

6.1 基因芯片檢測

同上法抽提RNA后，將標(biāo)本委托上海其明信息技術(shù)有限公司進(jìn)行基因表達(dá)譜的檢測，結(jié)果用Affymetrix公司的Transcriptome Analysis Console（TAC） Software進(jìn)行分析。

6.2 GO分析

將兩組之間的差異基因基于GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋，得到基因參與的所有功能，而后利用Fisher精確檢驗(yàn)和多重比較檢驗(yàn)計(jì)算每個(gè)功能的顯著性水平（P-value）和誤判率（FDR）。從而篩選出差異基因所體現(xiàn)的顯著性功能，顯著性篩選的標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05。

6.3 Pathway分析

基于KEGG數(shù)據(jù)庫，對差異基因利用Fisher精確檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)，把目標(biāo)基因參與的Pathway進(jìn)行顯著性分析，按照P＜0.05進(jìn)行篩選，得到顯著性的Pathway。

結(jié) 果

1 穩(wěn)定表達(dá)miR-505-3p的GT1-7細(xì)胞差異表達(dá)基因

將GT1-7感染病毒后經(jīng)殺稻瘟菌素篩選，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)miR-505-3p的GT1-7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。由于慢病毒載體中含有綠色熒光蛋白基因，因此，陰性對照組和過表達(dá)miR-505-3p的GT1-7細(xì)胞在顯微鏡下發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光（圖2）；野生型GT1-7細(xì)胞呈現(xiàn)典型的GnRH神經(jīng)元形態(tài)，在熒光顯微鏡下沒有熒光；在陰性對照組和miR-505-3p過表達(dá)組中，雖然細(xì)胞形態(tài)和野生型GT1-7保持一致，但每個(gè)細(xì)胞都發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光。實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示，過表達(dá)miR-505-3p的GT1-7穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞中miR-505-3p的表達(dá)量顯著高于空白對照和陰性對照細(xì)胞（圖3）。

圖2　穩(wěn)定表達(dá)miR-505-3p的GT1-7細(xì)胞株。Blank，空白對照組；pLenti，陰性對照組；pLenti-miR-505-3p，過表達(dá)miR-505-3p組；Phase，倒置相差顯微鏡圖像，熒光顯微鏡圖像；比例尺，25μmFig.2 Stable transfected miR-505-3p in GT1-7 cell line.Blank，control group（untreatment），pLenti，negative control group，pLenti-miR-505-3p，miR-505-3p-over-expression group.Phase，inverted phase microscopic images；Flu，fluorescence microscopic images；scale bar，25μm

圖3　穩(wěn)定表達(dá)miR-505-3p的GT1-7細(xì)胞株中miR-505-3p表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。Blank，空白對照組；pLenti，陰性對照組；pLenti-miR-505-3p，過表達(dá)miR-505-3p組；*，P＜0.01Fig.3 Expression level of miR-505-3p in miR-505-3p stably transfected GT1-7 with qRT-PCR.Blank，control group；pLenti，negative control group；pLenti-miR-505-3p，miR-505-3p-over-expression group；*P＜0.01

為了明確miR-505-3p對GT1-7細(xì)胞的表達(dá)譜產(chǎn)生的影響，我們對pLenti-nc和pLenti-miR505-3p兩組細(xì)胞的RNA樣本進(jìn)行表達(dá)譜芯片的檢測。在研究兩組樣本基因表達(dá)差異時(shí)，選擇表達(dá)量相差2倍以上的基因?yàn)椴町惢颍▓D4）。當(dāng)在GT1-7細(xì)胞中過量表達(dá)miR-505-3p時(shí)，有165個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)生差異。其中，下調(diào)倍數(shù)較大的基因有Stag3、Cga、Ctse和Vmn1r1，分別下調(diào)10.5、5.5、5.5和5.3倍；上調(diào)倍數(shù)較大的基因有Rgs7bp、Capsl和Mr1，分別上調(diào)了6.1、4.3和4.3倍；其他大多數(shù)基因的表達(dá)量變化都為2～3倍。

圖4　穩(wěn)定表達(dá)miR-505-3p的GT1-7細(xì)胞差異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組芯片檢測。pLenti，陰性對照組；pLenti-miR-505-3p，過表達(dá)miR-505-3p組Fig.4 Transcriptome assay test of differential expression genes in miR-505-3p stably transfected GT1-7 cell line.pLenti，negative control group；pLenti-miR-505-3p，miR-505-3p-over-expression group

2 穩(wěn)定表達(dá)miR-505-3p的GT1-7細(xì)胞差異表達(dá)基因的功能

為了進(jìn)一步研究miR-505-3p在神經(jīng)元細(xì)胞株GT1-7中的功能，我們用Gene Ontology（GO）分析將兩組之間的差異基因基于GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋，篩選出差異基因所體現(xiàn)的顯著性功能。結(jié)果顯示，miR-505-3p調(diào)控的基因主要參與細(xì)胞粘附、GTP分解代謝、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等生物過程（圖5）。在過表達(dá)miR-505-3p的GT1-7細(xì)胞中，參與調(diào)控細(xì)胞粘附過程的差異較大的基因有Ddr2、Cdh10、Pcdhb15等，它們分別上調(diào)3.03、2.99和2.75倍；參與GTP分解代謝的基因中，表達(dá)量變化較大的有Rasd1、Tuba4a，它們分別變化3.24和2.7倍；參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程的基因中變化較大的有Dscam和Ntrk，它們分別上升2.63和2.57倍。

此外，我們進(jìn)一步研究了miR-505-3p高表達(dá)影響的信號(hào)通路（圖6）。在前20個(gè)顯著差異的信號(hào)通路中，差異最顯著的是調(diào)控間隙連接、軸突導(dǎo)向和胃酸分泌的信號(hào)通路。參與縫隙連接的基因中表達(dá)量變化較大的有Adcy8和Gnai1基因，分別上調(diào)了3.09和2.58倍；參與軸突導(dǎo)向信號(hào)通路的基因中，表達(dá)量變化較大的有Gnai1和Srgap3基因，分別上調(diào)2.58和2.42倍；參與胃酸分泌信號(hào)通路的基因中，表達(dá)量變化較大的有Adcy8和Gnai1，它們分別上調(diào)3.09和2.58倍。其中，基因Adcy8和Gnai1都參與了顯著性最高的三個(gè)信號(hào)通路，并且在參與通路的基因中變化幅度較大。

圖6　差異表達(dá)基因參與的前20個(gè)最顯著的信號(hào)通路。縱坐標(biāo)代表基因參與的信號(hào)通路名稱，橫坐標(biāo)代表P值，（P＜0.05，5%FDR）Fig.6 The top 20 significant signaling pathways of the differentially expressed genes.The vertical axis is the pathway category and the horizontal axis is the P-value，（p＜0.05，5%FDR）

討 論

近年來，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了大量的miRNAs，這些miRNAs在神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)，并且對于神經(jīng)元的生長發(fā)揮著重要的作用。性發(fā)育由GnRH神經(jīng)元控制，GnRH神經(jīng)元脈沖性地釋放GnRH激素是性發(fā)育啟動(dòng)的標(biāo)志性事件。本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)miR-505-3p可以顯著抑制小鼠性發(fā)育啟動(dòng)，提示miR-505-3p可能對GnRH神經(jīng)元中相應(yīng)的基因起到調(diào)控作用。所以本文在永生化的GnRH神經(jīng)元GT1-7細(xì)胞中用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法過表達(dá)miR-505-3p，研究其對GT1-7基因表達(dá)譜的影響，并通過生物信息學(xué)分析的手段提示可能影響的生物學(xué)過程和信號(hào)通路。

當(dāng)在GT1-7細(xì)胞中過表達(dá)miR-505-3p時(shí)，GT1-7細(xì)胞中有165個(gè)基因的表達(dá)量改變了兩倍以上，其中表達(dá)量差異最大的基因?yàn)镾tag3。這個(gè)基因已經(jīng)被證明和雄性不育［12］及原發(fā)性卵巢發(fā)育不全密切相關(guān)［13］。當(dāng)我們對差異基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)性發(fā)育相關(guān)的重要信號(hào)通路例如GnRH信號(hào)通路、GABA能突觸信號(hào)通路和胰島素分泌信號(hào)通路都受到了顯著的調(diào)控，由此提示miR-505-3p確實(shí)可以對GnRH神經(jīng)元的性發(fā)育相關(guān)的基因起到調(diào)控作用，但是miR-505-3p的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

除此之外，在已有的報(bào)道中，miR-505-3p已經(jīng)被證明是一種腫瘤抑制因子，它可以通過抑制人乳腺癌上皮細(xì)胞的增殖實(shí)現(xiàn)腫瘤的抑制［14］；與此同時(shí)，它還可以誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的衰老和凋亡［4］。而且，miR-505-3p還是人類原發(fā)性膽汁肝硬化［15］和高血壓［16］的生物學(xué)標(biāo)記。因此對miR-505-3p的研究具有重要意義。

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Expression Patterns of GT1-7 Cell Line Affected by miR-505-3p

Tong Li1，Li Yu2，Wang Maochun2，Zhou Yuxun2，Xiao Junhua2*
（1Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，2College of Chemistry，Chemical Engineering&Biotechnology，Donghua University，Shanghai 201620，China）

Objective To understand the effect of miR-505-3p on the expression pattern of stability GT1-7 cell.Methods The GT1-7 cells were divided into 3 groups:control group（untreated），negative control group（infected with pLenti6.3-nc lentivirus），experimental group（infected with pLenti6.3-miR-505-3p lentivirus）.The miR-505-3p expression level was detected by quantitative Real-time PCR（qRT-PCR）.Then we used the GeneChip Mouse Transcriptome Assay 1.0 to detect the expression pattern of the stably transfected cell lines，GO analysis was used to analyze the main function of the differential expression genes according to Gene Ontology，and Pathway analysis was used to find out the significant pathways of the differential genes according to Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）.Results Compared with those in the negative control group，165 genes were regulated in the experimental group，which participated in some important biological processes such as cell adhesion，GTP catabolic process，and nervous system development.Conclusion Through its target genes，miR-505-3p can regulate such biological processes as cell adhesion，GTP catabolic process，and nervous system development，and such pathways as for gap junction，axon guidance，and gastric acid secretion.

miR-505-3p，GT1-7 cell，expression pattern，GO analysis，KEGG analysis

R394.3

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-01-20 〔修回日期〕2016-04-20

上海市動(dòng)管基金（13140900300），東華大學(xué)研究生創(chuàng)新基金（12D11321）

仝莉，女（1988年），漢族，博士

（To whom correspondence should be addressed）：xiaojunhua@dhu.edu.cn