幾種天然吡喃酮衍生物的抗腫瘤活性分析

鄭旭升，李慧慧，李　琦，唐　宇，王毅剛，許傳蓮

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2.天津大學(xué)藥學(xué)院，天津 300072)

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幾種天然吡喃酮衍生物的抗腫瘤活性分析

鄭旭升1，李慧慧2，李琦2，唐宇2，王毅剛1，許傳蓮1

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018；2.天津大學(xué)藥學(xué)院，天津 300072)

通過(guò)對(duì)幾種天然吡喃酮衍生物的抗腫瘤活性分析，獲得具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的該類化合物。利用MTT法檢測(cè)6種結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾與改造的天然吡喃酮類化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示化合物L(fēng)iQ-1與LiH-Ⅳ-80的抗腫瘤活性最為顯著。利用化合物L(fēng)iQ-1分析其對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞的生長(zhǎng)影響，結(jié)果呈劑量依賴關(guān)系。通過(guò)對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)分析比較證明，對(duì)于化合物L(fēng)iH-IV-80、LiH-IV-50-2和LiH-III-122-2，在7-位形成的內(nèi)酯環(huán)對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖有著重要的影響，而對(duì)于化合物L(fēng)iQ-1、LiQ-2和LiQ-4，4-位OH對(duì)化合物的抗腫瘤活性影響較大。

天然吡喃酮；結(jié)構(gòu)修飾；MTT法；抗腫瘤活性

0　引言

腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康和高致死率的疾病之一[1]。在傳統(tǒng)的癌癥治療方法中，化學(xué)藥物具有舉足輕重的地位，而絕大部分化學(xué)合成類抗腫瘤藥物都是以具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物。目前臨床上使用的抗腫瘤藥物62.9%來(lái)源于天然產(chǎn)物[2-3]，由此可見(jiàn)天然產(chǎn)物在腫瘤化學(xué)藥物這一領(lǐng)域中具有不可代替的作用。

二氫吡喃類化合物廣泛存在于植物和微生物中，且具有多種的生物活性，主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等[4]，其中抗腫瘤活性更是研究熱點(diǎn)。此外曾有報(bào)道顯示，人們對(duì)天然吡喃類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，得到的衍生物也具有抗腫瘤活性[5-6]，如高濃度的苯并二氫吡喃衍生物xy9902能夠抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的增殖[7]。在二氫吡喃類化合物中，苯并二氫吡喃環(huán)不僅是其重要的結(jié)構(gòu)單元，也是發(fā)揮活性的主要結(jié)構(gòu)。因此以二氫吡喃為母核，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改造[8]，并通過(guò)體外活性篩選，以期獲得抗腫瘤活性更好的二氫吡喃類衍生物。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了6種結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾的苯并二氫吡喃類化合物的抗腫瘤活性，并分析比較化合物的不同結(jié)構(gòu)修飾對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性影響，篩選出抗腫瘤活性好的衍生物，為苯并二氫吡喃類化合物的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)修飾以及開(kāi)發(fā)研制新型抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1主要試劑材料

本實(shí)驗(yàn)所用6種結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾的天然吡喃類衍生物，由天津大學(xué)藥學(xué)院唐宇教授課題組提供，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。DMEM、RPMI-1640，F(xiàn)BS(胎牛血清)購(gòu)自Gibco公司，MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)，胰酶購(gòu)自杭州都泰生物科技有限公司，DMSO(二甲基亞砜)購(gòu)于sigma-Aldrich公司，紫杉醇購(gòu)自杭州長(zhǎng)征化學(xué)試劑有限公司。

圖1　6種待測(cè)天然吡喃酮衍生物結(jié)構(gòu)式

1.1.2細(xì)胞株

人紅白血病細(xì)胞株K562、人肝癌細(xì)胞株BEL-7404和SMMC-7721、人胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人肺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自中科院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所，K562細(xì)胞Akt1過(guò)表達(dá)株、BEL-7404細(xì)胞Akt1過(guò)表達(dá)株由本研究組構(gòu)建完成[9]。

1.1.3主要儀器

XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光儀公司)；ELX800酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；HERA CELL 150二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；MS403S/01電子天平(METTLER TOLEDO公司)；1300 series A2生物安全柜(Thermo公司)。

1.2方法

1.2.16種化合物細(xì)胞毒性測(cè)試

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562、K562/Akt1、BEL-7404、BEL-7404/Akt1以及A549細(xì)胞，按3×103個(gè)細(xì)胞/孔植入96孔板中，每孔加入95μL的細(xì)胞液。對(duì)于懸浮細(xì)胞K562和K562/Akt1，待細(xì)胞鋪板之后立即加入20、40、60、80、100μM的5種待測(cè)化合物各5μL，對(duì)于BEL-7404、BEL-7404/Akt1和A549，待細(xì)胞貼壁后，加入相同濃度梯度的各個(gè)化合物各5μL。同時(shí)設(shè)置終濃度為0.5%的DMSO溶劑對(duì)照組和空白調(diào)零組，各組均設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，終體積均為100μL。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，每孔加入濃度為5mg/mL MTT溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄掉培養(yǎng)基并于每孔加入150μL DMSO溶液，震蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處各孔OD值，并按以下公式計(jì)算化合物對(duì)細(xì)胞的抑制率：

抑制率=[1-(OD實(shí)驗(yàn)組-OD調(diào)零組)/(OD對(duì)照組-OD調(diào)零組)]×100%。

1.2.2化合物L(fēng)iQ-1對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562，按3×103個(gè)細(xì)胞/孔植入96孔板中，每孔加入95 μL的細(xì)胞液，待細(xì)胞鋪板之后立即加入濃度分別為10、20、40 μM的化合物L(fēng)iQ-1各5μL。同時(shí)設(shè)置終濃度為0.5%的DMSO溶劑對(duì)照組和空白調(diào)零組，各組均設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，終體積均為100 μL。于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待化合物處理時(shí)間達(dá)24、48、72、96和120 h時(shí)，每孔加入濃度為5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)基并于每孔加入150 μL DMSO溶液，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔OD值，以天數(shù)為橫軸，平均OD值為縱軸，繪制K562細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.3化合物L(fēng)iQ-1對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增值抑制作用

分別取對(duì)數(shù)生產(chǎn)期的K562、K562/Akt、SGC-7901、MCF-7、A549和SMMC-7721，其中MCF-7按照6×103細(xì)胞/孔，SGC-7901按5×103細(xì)胞/孔，其余細(xì)胞按3×103細(xì)胞/孔植入96孔板中，每孔加入95 μL的細(xì)胞液，對(duì)于懸浮細(xì)胞組，待細(xì)胞鋪板之后立即加入5、10、20、40、80 μM的化合物L(fēng)iQ-1各5 μL，對(duì)于貼壁細(xì)胞組，待細(xì)胞貼壁后，再分別加入5 μL不同濃度的化合物L(fēng)iQ-1，同時(shí)設(shè)置終濃度為0.5%的DMSO溶劑對(duì)照組和空白調(diào)零組，各組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，終體積均為100 μL。于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，采用MTT法檢測(cè)化合物L(fēng)iQ-1對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制率，具體方法參照實(shí)驗(yàn)1.2.1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，利用SPSS軟件計(jì)算IC50值。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.16種化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性

采用MTT法檢測(cè)6種吡喃酮類衍生物對(duì)K562、K562/Akt1、BEL-7404、BEL-7404/Akt1以及A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果如表1所示?？芍糠只衔镆种颇[瘤細(xì)胞增殖活性具有選擇性，化合物L(fēng)iH-Ⅳ-50-2僅對(duì)K562細(xì)胞和BEL-7404細(xì)胞有明顯抑制作用；化合物L(fēng)iQ-4僅對(duì)K562和A549細(xì)胞具有明顯的抑制作用；化合物L(fēng)iH-Ⅲ-122-2，LiQ-2僅對(duì)K562細(xì)胞有明顯抑制作用；化合物L(fēng)iQ-1和LiH-IV-80的抗腫瘤活性最為顯著，80μM的化合物L(fēng)iQ-1和40μM LiH-IV-80的對(duì)各個(gè)受試腫瘤細(xì)胞的抑制率均達(dá)到了90%以上。

表1　6種不同化合物對(duì)5種腫瘤細(xì)胞株的抑制率

2.2化合物L(fēng)iQ-1對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)作用的影響

利用MTT比色法分析化合物L(fēng)iQ-1對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)作用的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2可知，化合物L(fēng)iQ-1對(duì)K562細(xì)胞增長(zhǎng)有顯著的抑制作用，隨著化合物濃度的上升，化合物L(fēng)iQ-1對(duì)K562細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制越明顯，呈劑量依賴性關(guān)系。

圖2　化合物L(fēng)iQ-1對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)作用的影響

2.3化合物L(fēng)iQ-1 對(duì)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增值抑制作用

檢測(cè)化合物L(fēng)iQ-1對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果表明，化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的IC50值在30～70μM之間(表2)，表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性，其中對(duì)A549、K562和K562/Akt這3種細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，IC50值在30～40 μM之間，而SMMC-7721、SGC-7901和MCF-7的IC50值在50～70 μM之間。

表2　化合物L(fēng)iQ-1對(duì)A549、SMMC-7721、SGC-7901、

3　討　論

天然二氫吡喃類化合物廣泛存在于植物和微生物中，具有豐富的生理活性，其中抗腫瘤活性是研究的熱點(diǎn)。關(guān)于這類化合物經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾與改造以增強(qiáng)其抗腫瘤活性的研究很多，如石磊等[10]曾設(shè)計(jì)合成了一系列全新二氫黃酮類化合物，其中有5種化合物具有很好的抗腫瘤活性，聶愛(ài)華等[11]設(shè)計(jì)并合成了2H-1苯并吡喃衍生物，發(fā)現(xiàn)部分化合物具有較為理想的抗腫瘤活性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)6種結(jié)構(gòu)經(jīng)修飾的苯并吡喃類衍生物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞毒性分析，結(jié)果以化合物L(fēng)iQ-1和LiH-Ⅳ-80的抗腫瘤活性最為顯著，而其他4種化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性存在差異性和選擇性。利用MTT法檢測(cè)化合物L(fēng)iQ-1對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制作用，其IC50皆介于30～70μM之間，表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活性，且通過(guò)化合物L(fēng)iQ-1對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)作用抑制的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，此外，這6種化合物對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞均具有較明顯的細(xì)胞毒性，為開(kāi)發(fā)研制新型的治療人紅白血病藥物提供了先導(dǎo)化合物。

有研究實(shí)驗(yàn)表明，苯并吡喃類化合物對(duì)白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種癌細(xì)胞均具有抑制作用[12]，其中苯并二氫吡喃環(huán)是該類化合物中發(fā)揮活性的主要結(jié)構(gòu)部件，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)苯并二氫吡喃類衍生物的結(jié)構(gòu)比較，希望發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)該類化合物抗腫瘤活性的結(jié)構(gòu)修飾。通過(guò)對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)分析比較，在同系物L(fēng)iH-IV-80、LiH-IV-50-2和LiH-III-122-2中化合物L(fēng)iH-IV-80的活性最好，說(shuō)明7-位OH形成內(nèi)酯環(huán)對(duì)活性影響至關(guān)重要，通過(guò)比較化合物L(fēng)iH-IV-50-2和LiH-III-122-2發(fā)現(xiàn)，5-位OH有利于提高化合物的生物活性(圖1a)。同系物L(fēng)iQ-1、LiQ-2和LiQ-4中化合物L(fēng)iQ-1的活性最強(qiáng)，說(shuō)明A環(huán)4-位OH對(duì)活性影響較為重要；而化合物L(fēng)iQ-2活性優(yōu)于化合物L(fēng)iQ-4，說(shuō)明C環(huán)的存在有利于活性的提高(圖1d)。

以天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾與改造，一直以來(lái)是人們尋找并發(fā)現(xiàn)新藥的重要途徑之一[13-15]。本實(shí)驗(yàn)最終篩選結(jié)果表明化合物L(fēng)iQ-1和LiH-Ⅳ-80均具有較為理想的抗腫瘤活性，對(duì)這兩種化合物的進(jìn)一步修飾與研究，將為開(kāi)發(fā)出高效低毒的新型天然吡喃酮類抗腫瘤藥物提供新的線索和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 許惠兒)

Anti-tumor Activity Anaysis of Several Natural Pyrones Derivatives

ZHENGXusheng1,LIHuihui2,LIQi2,TANGYu2,WANGYigang1,XUChuanlian1

(1. College of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China;2. School of Pharmacy, Tianjin University, Tianjin 300072, China)

Natural pyrones derivatives with stronger anti-tumor activity were gained through antitumor activity analysis of several such compounds. MTT was used to detect the cytotoxicity of 6 natural pyrone compounds on tumor cells after structural modification and reconstruction. The results show that the antitumor activity of LiQ-1 and LiH-Ⅳ-80 is significantly strong. LiQ-1 was used to analyze its infleunce on erythroleukemia K562 cell growth, and the result presented dose-dependent relaitonship. Through analysis and comparison of compound structure, it is proven that for LiH-IV-80, LiH-IV-50-2 and LiH-III-122-2, lactonic ring formed in 7-position plays an important role on tumor inhibition cell proliferation. For LiQ-1, LiQ-2 and LiQ-4, 4-position OH has a great affect on tumor activity.

natural pyrone; structural modification; MTT; anti-tumor activity

10.3969/j.issn.1673-3851.2016.01.016

2015-01-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81272687)；浙江省生物學(xué)重中之重學(xué)科開(kāi)放基金項(xiàng)目(11610032211201/002/008)

鄭旭升(1989-)，男，浙江余姚人，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物抗腫瘤活性方面的研究。

許傳蓮，E-mail：chuanlianxu@163.com

R285.5

A

1673- 3851 (2016) 01- 0099- 04 引用頁(yè)碼： 010702