金屬離子對(duì)CHO細(xì)胞抗體表達(dá)及抗體電荷分布的影響

張?chǎng)螡?唐紅萍 趙亮 范里 劉旭平 繆仕偉 譚文松

（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

金屬離子對(duì)CHO細(xì)胞抗體表達(dá)及抗體電荷分布的影響

張?chǎng)螡?唐紅萍 趙亮 范里 劉旭平 繆仕偉 譚文松

（華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

旨在深入認(rèn)識(shí)金屬離子在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)單克隆抗體過(guò)程中所發(fā)揮的作用。綜合考察了不同銅離子和鋅離子濃度下CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)、抗體的表達(dá)以及抗體的電荷分布情況。結(jié)果顯示，一方面，當(dāng)培養(yǎng)基中銅離子濃度為120 nmol/L、鋅離子濃度為50 μmol/L時(shí)，最有利于CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)和抗體的表達(dá)。過(guò)高或過(guò)低的銅離子和鋅離子均對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性的維持產(chǎn)生了不利影響。另一方面，作為堿性羧肽酶抑制劑和輔因子的銅離子和鋅離子對(duì)抗體的電荷分布有著重要的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中銅離子濃度為50 nmol/L、鋅離子濃度為50 μmol/L時(shí)，最有利于減少抗體的電荷變體，提高主峰含量。過(guò)高或過(guò)低的銅離子和鋅離子均導(dǎo)致了電荷變體的增加，主峰含量的降低。且兩者的濃度和比例影響了抗體C末端賴氨酸的酶切過(guò)程，進(jìn)而影響了堿性變體的含量。此外，對(duì)銅、鋅離子的操作空間進(jìn)行了初步的研究。金屬離子在CHO細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、抗體的表達(dá)以及抗體的電荷分布等方面都發(fā)揮著重要的作用。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)；電荷分布；金屬離子；單克隆抗體

抗體類藥物具有靶點(diǎn)明確、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于癌癥、自身免疫性疾病、器官移植后排異以及各類炎癥的治療［1］。運(yùn)用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)高效生產(chǎn)抗體類藥物已成為了當(dāng)今生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的核心技術(shù)。其中CHO細(xì)胞具有高效的蛋白質(zhì)翻譯后修飾功能以及較低的宿主蛋白分泌，已被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜蛋白質(zhì)，尤其是抗體類藥物的生產(chǎn)。作為一類糖蛋白，抗體類藥物在動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列的翻譯后修飾，如糖基化、C末端賴氨酸的切除、N末端谷氨酰胺的環(huán)化等，同時(shí)存在許多物理和化學(xué)降解，如天冬酰胺的去酰胺化、天冬氨酸的異構(gòu)化、二硫鍵的還原等，從而導(dǎo)致單克隆抗體異質(zhì)性的產(chǎn)生［2］。這些抗體的異質(zhì)性往往體現(xiàn)在糖型的差異、電荷的差異、分子量的差異以及疏水性的差異。

抗體的電荷異質(zhì)性是由于翻譯后修飾和降解導(dǎo)致抗體所帶的凈電荷或電荷空間分布發(fā)生了改變。這類變體可以通過(guò)離子交換色譜、疏水作用色譜和毛細(xì)管等電聚焦等方法進(jìn)行分離和鑒定。在陽(yáng)離子交換色譜中，抗體的酸性變體和堿性變體分別指洗脫時(shí)間小于和大于主峰的那部分電荷變體。其中酸性變體主要由天冬酰胺去酰胺化、賴氨酸的糖化、二硫鍵的錯(cuò)誤連接、糖基化（唾液酸）等引起，而堿性變體則主要由賴氨酸變體、焦谷氨酸的形成、天冬氨酸的異構(gòu)化、甲硫氨酸的氧化等引起。賴氨酸變體是由于抗體C末端賴氨酸的不完全酶切而引起的，它的存在會(huì)抑制補(bǔ)體的激活，進(jìn)而影響抗體補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用（Complement dependent cytotoxicity，CDC）活性，是一類重要的堿性變體［3］。此外，抗體電荷變體的存在還會(huì)引起抗體穩(wěn)定性、生物學(xué)活性、藥物動(dòng)力學(xué)、免疫原性等抗體結(jié)構(gòu)和功能的改變［4］，是抗體類藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical quality attribution，CQA）之一。因此，在單克隆抗體生產(chǎn)過(guò)程中，需要對(duì)其電荷變體含量進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)測(cè)和控制。

金屬離子是動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)過(guò)程中一類重要的添加劑。研究表明，培養(yǎng)基中金屬離子的濃度對(duì)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝以及抗體的表達(dá)都具有一定的影響［5］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開始關(guān)注金屬離子對(duì)抗體質(zhì)量方面的影響，如聚體［6］、碎片［7］、糖基化［8］、脯氨酸酰胺化［9］等。然而，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的非均相反應(yīng)體系，其中涉及細(xì)胞的生理狀態(tài)、底物的供給和相互交織的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，在保證抗體產(chǎn)量的前提下如何有效控制抗體的電荷異質(zhì)性仍是抗體類藥物生產(chǎn)過(guò)程中遇到的關(guān)鍵問題之一。為此，本研究以表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞為研究對(duì)象，考察銅離子和鋅離子在細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及抗體電荷分布中發(fā)揮的作用，旨在為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中金屬離子的濃度提供合理的操作空間，從而為抗體類藥物生產(chǎn)過(guò)程中電荷異質(zhì)性的有效控制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

本研究所用細(xì)胞為一株表達(dá)人源化單克隆抗體的重組CHO細(xì)胞株。所使用的培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的無(wú)血清培養(yǎng)基。專利號(hào)為：CN 104328158 A。培養(yǎng)基配制所用試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。培養(yǎng)基配制完后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜（Millipore）過(guò)濾除菌使用。

1.2方法

1.2.1種子細(xì)胞培養(yǎng) 從細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇CHO細(xì)胞，以5.0×105cells/mL的活細(xì)胞密度接種于125 mL搖瓶（Corning），接種體積為30 mL，置于37℃、5％ CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。每隔2 d進(jìn)行種子細(xì)胞傳代擴(kuò)增，傳代后活細(xì)胞密度控制在5.0×105cells/mL左右。

1.2.2批式培養(yǎng) 取指數(shù)生長(zhǎng)期的CHO種子細(xì)胞，經(jīng)1 000 r/min離心5 min，棄上清，用新鮮（不含銅離子和鋅離子）培養(yǎng)基進(jìn)行重懸。以1.0×106cells/mL的活細(xì)胞密度接種于125 mL搖瓶，接種體積為30 mL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)額外添加所需的硫酸銅和硫酸鋅濃縮液。將搖瓶置于37℃、5％ CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)過(guò)程中每天取樣1 mL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)10 000 r/min離心5 min后取上清液于-80℃保存，用于抗體產(chǎn)量和質(zhì)量的檢測(cè)。

1.2.3細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞密度采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)算，并用臺(tái)盼藍(lán)拒染法確定細(xì)胞的活性。

1.2.4抗體濃度檢測(cè) 抗體濃度采用親和色譜的方法進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱為POROS Protein A affinity column，4.0×50 mm（Applied Biosystems），具體步驟見參考Yang等［10］的方法。

1.2.5抗體純化 抗體純化采用親和層析的方法，層析柱為HiTrap Protein A HP（GE Healthcare），具體方法步驟見產(chǎn)品說(shuō)明書。

1.2.6抗體電荷變體檢測(cè) 抗體的電荷變體采用弱陽(yáng)離子交換色譜進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱為ProPac WCX-10 column，4.0×250 mm（Dionex），具體步驟參考Zhang等［11］方法。為了檢測(cè)堿性變體中賴氨酸變體的含量，將純化后抗體用羧肽酶B進(jìn)行酶切（37℃，30 min），對(duì)比酶切前后抗體的弱陽(yáng)離子交換色譜圖即可計(jì)算出賴氨酸變體的含量。圖1為典型的弱陽(yáng)離子交換色譜圖及羧肽酶酶切示意圖。

圖1　典型弱陽(yáng)離子交換色譜圖

1.2.7數(shù)據(jù)分析 抗體的比生成速率qmAb（mg/109cells/day）通過(guò)以下公式進(jìn)行計(jì)算：

其中，P為抗體濃度（mg/L）；IVCC為活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分（109cells·day/L）。

2　結(jié)果

2.1銅離子對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及抗體電荷分布的影響

為了研究銅離子對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及抗體電荷分布的影響，向起始培養(yǎng)基中添加不同量的硫酸銅濃縮液使銅離子濃度分別為0、10、50、120、200、400、1 000和50 000 nmol/L。同時(shí)將鋅離子濃度調(diào)整到10 μmol/L（無(wú)血清培養(yǎng)基中鋅離子的原始濃度）。

2.1.1銅離子對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)的影響 批式培養(yǎng)過(guò)程中，CHO細(xì)胞在不同銅離子濃度條件下的生長(zhǎng)曲線（圖2-A）顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中不含銅離子（0 nmol/L）時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)到第3天時(shí)達(dá)到最大活細(xì)胞密度為4.0×106cells/mL，隨后細(xì)胞逐漸死亡，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（10 day），活細(xì)胞密度僅為0.4× 106cells/mL。隨著銅離子濃度的升高，批式培養(yǎng)所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)銅離子濃度為120 nmol/L時(shí)，批式培養(yǎng)所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度最高，為5.9×106cells/mL。同時(shí)更有利于活細(xì)胞密度的維持，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，活細(xì)胞密度仍有4.5×106cells/mL。隨著銅離子濃度的進(jìn)一步升高（＞120 nmol/L），培養(yǎng)過(guò)程所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度逐漸下降。當(dāng)銅離子濃度達(dá)到50 000 nmol/L時(shí)，批式培養(yǎng)所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度下降到4.8×106cells/mL。此外，隨著銅離子濃度的升高，活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分（IVCC，圖2-B）、最終抗體濃度（Titer，圖2-C）以及抗體的比生成速率（qmAb，圖2-D）也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)銅離子濃度為120 nmol/L時(shí)，IVCC和最終抗體濃度都達(dá)到最高值，分別為不含銅離子條件下的1.65倍和2.39倍。而當(dāng)銅離子濃度為1 000 nmol/L時(shí)，抗體的比生成速率達(dá)到最大，為不含銅離子條件下的1.62倍。

2.1.2銅離子對(duì)抗體電荷分布的影響 此外，考察了不同銅離子濃度條件下抗體的電荷分布情況，結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中不含銅離子時(shí)，抗體中酸性變體、主峰以及堿性變體含量分別為33.17％、49.63％和17.19％。通過(guò)羧肽酶B的酶切實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其中7.14％的堿性變體來(lái)自于賴氨酸變體。當(dāng)銅離子濃度小于50 nmol/L時(shí)，隨著銅離子濃度的升高，抗體酸性變體含量隨之下降，而主峰、堿性變體以及賴氨酸變體含量則隨之上升。對(duì)比堿性變體和賴氨酸變體含量（圖3-C）發(fā)現(xiàn)，堿性變體含量的提高是由于賴氨酸變體含量的上升所導(dǎo)致的。當(dāng)銅離子濃度為50 nmol/L時(shí)，抗體的主峰含量達(dá)到最高，為54.10％。此時(shí)，抗體酸性變體、堿性變體以及賴氨酸變體含量分別為26.6％、19.3％和9.3％。隨著銅離子濃度的進(jìn)一步升高（＜400 nmol/L），抗體的酸性變體含量進(jìn)一步下降，主峰含量由上升轉(zhuǎn)為下降，同時(shí)堿性變體以及賴氨酸變體含量進(jìn)一步上升。當(dāng)銅離子濃度為400 nmol/L時(shí)，抗體的酸性變體含量達(dá)到最低，為24.46％，而抗體的堿性變體以及賴氨酸變體同時(shí)達(dá)到最高，分別為23.20％和13.59％。當(dāng)進(jìn)一步提高銅離子濃度時(shí)（＞400 nmol/L），抗體的酸性變體含量由下降轉(zhuǎn)為上升，同時(shí)主峰含量進(jìn)一步下降，堿性變體和賴氨酸變體的含量略有下降。

圖2　不同銅離子濃度下CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)（A）、活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分（B）、抗體濃度（C）以及抗體比生產(chǎn)速率（D）情況

以上結(jié)果表明，銅離子對(duì)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及抗體的電荷分布均有顯著影響。其中120 nmol/L的銅離子濃度最適合細(xì)胞的生長(zhǎng)以及抗體的表達(dá)，而50 nmol/L的銅離子濃度則最有利于減少抗體的電荷變體，獲得較高的主峰含量。

2.2鋅離子對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及抗體電荷分布的影響

為了研究鋅離子對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及抗體電荷分布的影響，向起始培養(yǎng)基中添加不同量的硫酸鋅濃縮液使鋅離子濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、1、10、50和200 μmol/L。同時(shí)將銅離子濃度調(diào)整到120 nmol/L（無(wú)血清培養(yǎng)基中銅離子的原始濃度）。

2.2.1鋅離子對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)的影響 批式培養(yǎng)過(guò)程中，CHO細(xì)胞在不同鋅離子濃度條件下的生長(zhǎng)曲線（圖4-A）顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中不含鋅離子時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)到第2天時(shí)就達(dá)到最大活細(xì)胞密度為2.2×106cells/mL。隨后細(xì)胞迅速進(jìn)入衰亡期，培養(yǎng)到第6天時(shí)，活細(xì)胞密度下降到0。隨著培養(yǎng)基中鋅離子濃度的升高，批式培養(yǎng)所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)鋅離子濃度為50 μmol/L時(shí)，批式培養(yǎng)所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度最高，為4.9×106cells/mL，同時(shí)延長(zhǎng)了活細(xì)胞密度的維持，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，活細(xì)胞密度仍有3.1×106cells/mL。隨著鋅離子濃度的進(jìn)一步升高（＞50 μmol/L），培養(yǎng)過(guò)程所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度逐漸下降。當(dāng)鋅離子濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，批式培養(yǎng)所能達(dá)到的最大活細(xì)胞密度下降到4.0×106cells/mL。此外，隨著鋅離子濃度的升高，IVCC（圖4-B）和最終抗體濃度（圖4-C）也呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)鋅離子濃度為50 μmol/L時(shí)，IVCC和最終抗體濃度同時(shí)達(dá)到最高值，分別為不含鋅離子條件下的3.74倍和11.28倍。而抗體的比生成速率隨著鋅離子濃度的升高而一直上升（圖4-D），當(dāng)鋅離子濃度達(dá)到最高時(shí)（200 μmol/L），抗體的比生成速率為不含鋅離子條件下的2.49倍。

圖3　不同銅離子濃度下抗體電荷分布情況

2.2.2鋅離子對(duì)抗體電荷分布的影響 此外，考察了不同鋅離子濃度條件下抗體的電荷分布情況，結(jié)果（圖5）顯示，當(dāng)培養(yǎng)基中不含鋅離子時(shí)，抗體中酸性變體、主峰以及堿性變體含量分別為31.97％、32.38％和35.65％，其中21.79％的堿性變體來(lái)自于賴氨酸變體。當(dāng)鋅離子濃度小于50 μmol/L時(shí)，隨著鋅離子濃度的升高，抗體酸性變體、堿性變體以及賴氨酸變體含量都隨之下降，同時(shí)主峰含量逐漸上升。對(duì)比堿性變體和賴氨酸變體含量發(fā)現(xiàn)，堿性變體含量的下降主要是由于賴氨酸變體含量的降低所導(dǎo)致的。當(dāng)鋅離子濃度為50 μmol/L時(shí)，抗體酸性變體含量達(dá)到最低，為18.64％，同時(shí)主峰含量達(dá)到最高，為54.53％。隨著鋅離子濃度的進(jìn)一步升高（＞50 μmol/L），抗體酸性變體含量由下降轉(zhuǎn)為上升，主峰含量由上升轉(zhuǎn)為下降，同時(shí)堿性變體和賴氨酸變體含量進(jìn)一步下降。當(dāng)鋅離子濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，抗體的酸性變體、主峰、堿性變體以及賴氨酸變體含量分別為24.18％、53.52％、22.30％和3.05％。

以上結(jié)果表明，鋅離子對(duì)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及抗體電荷分布具有顯著影響。其中鋅離子濃度為50 μmol/L時(shí)最適合細(xì)胞的生長(zhǎng)以及抗體的表達(dá)，同時(shí)有利于減少抗體的電荷變體，獲得較高的主峰含量。

2.3銅離子和鋅離子對(duì)抗體電荷分布的影響

圖4　不同鋅離子濃度下CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)（A）、活細(xì)胞密度對(duì)時(shí)間的積分（B）、抗體濃度（C）以及抗體比生產(chǎn)速率（D）情況

圖5　不同鋅離子濃度下抗體電荷分布情況

從以上結(jié)果可以看出，銅離子和鋅離子對(duì)抗體賴氨酸變體含量起著相反的作用。為此，進(jìn)一步考察了銅離子和鋅離子兩者之間的比例對(duì)抗體賴氨酸變體的影響。17個(gè)不同銅離子和鋅離子比例條件下賴氨酸變體的含量情況（圖6-A）顯示，當(dāng)銅/鋅［（nmol/L）/（μmol/L）］比例為0.6時(shí)，賴氨酸變體的含量只有3.05％。隨著銅/鋅比例的升高，賴氨酸變體的含量也隨之上升。當(dāng)銅/鋅比例為600時(shí)，賴氨酸變體的含量上升到了21.79％。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明了銅離子和鋅離子在抗體C末端賴氨酸的酶切過(guò)程中所發(fā)揮的相反的作用，調(diào)節(jié)兩者之間的比例是控制抗體賴氨酸變體含量的有效手段。

抗體電荷變體的有效控制是抗體類藥物生產(chǎn)過(guò)程中過(guò)程優(yōu)化和控制的關(guān)鍵。根據(jù)質(zhì)量設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）的基本理念，為了確定合適的操作空間，進(jìn)一步考察了不同銅離子和鋅離子條件下抗體的主峰含量，并做出主峰含量的等高線圖（圖6-B）。如圖所示，在我們的考察范圍內(nèi)（圖6-B右側(cè)實(shí)線范圍內(nèi)），顏色越深，代表主峰含量越高。當(dāng)鋅離子低于10 μmol/L時(shí)，抗體主峰含量均低于50％，且隨著鋅離子濃度的增加，抗體主峰含量顯著上升。當(dāng)鋅離子高于10 μmol/L時(shí)，抗體主峰含量均高于50％，且當(dāng)銅離子濃度為50 nmol/L左右時(shí)，抗體主峰含量達(dá)到最高?？梢钥闯?，抗體的主峰含量由銅、鋅離子濃度以及兩者的配比共同決定。為了有效地控制電荷變體含量，需要將銅、鋅離子控制在一個(gè)合適的濃度范圍內(nèi)，即操作空間。

圖6　銅離子和鋅離子對(duì)抗體電荷分布的影響

3　討論

作為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不可或缺的一部分，金屬離子在細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、抗體的表達(dá)以及抗體質(zhì)量等方面都發(fā)揮著重要的作用。本研究以一株表達(dá)單克隆抗體的CHO細(xì)胞為對(duì)象，綜合考察了銅離子和鋅離子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及抗體電荷分布的影響。

在細(xì)胞生長(zhǎng)和抗體表達(dá)方面，過(guò)低或過(guò)高的銅離子和鋅離子均抑制了CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)和活細(xì)胞密度的維持，進(jìn)而影響了抗體的表達(dá)。銅離子是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中一種重要的微量元素，它是細(xì)胞有氧代謝途徑中諸多關(guān)鍵酶的輔因子［12］。在銅離子不足的情況下，細(xì)胞的有氧代謝將受到抑制，乳酸等代謝副產(chǎn)物會(huì)大量積累，最終導(dǎo)致抗體表達(dá)水平的下降和細(xì)胞的死亡。同時(shí)，銅離子具有調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的作用，高濃度的銅離子會(huì)使胞內(nèi)累積大量的活性氧物質(zhì)（ROS），對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和抗體的表達(dá)。鋅離子是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中另一種重要的微量元素，細(xì)胞內(nèi)有超過(guò)300個(gè)關(guān)鍵性的細(xì)胞過(guò)程，包括DNA和蛋白質(zhì)的合成、有絲分裂、細(xì)胞擴(kuò)增、能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，需要鋅離子的參與［13］。在動(dòng)物細(xì)胞無(wú)蛋白懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，鋅離子往往被作為胰島素的替代物來(lái)添加［14］。此外，鋅離子還具有提高mRNA穩(wěn)定性和抗細(xì)胞凋亡的作用［15］。因此，鋅離子的不足將直接影響到葡萄糖的利用和細(xì)胞代謝，進(jìn)而影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)以及產(chǎn)物的表達(dá)。同時(shí)，作為重金屬，高濃度的鋅離子同樣會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)毒副作用。本研究發(fā)現(xiàn)，50 μmol/L的鋅離子濃度最適合CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)以及抗體的表達(dá)，該結(jié)果與Kim等［13］的研究結(jié)論基本一致。

在抗體的電荷分布方面，高濃度的銅離子提高了抗體賴氨酸變體含量，進(jìn)而提高了堿性變體含量（圖3-C）。相反，高濃度的鋅離子則降低了抗體賴氨酸變體含量，進(jìn)而降低了堿性變體含量（圖5-C）。兩者之間的比例對(duì)抗體賴氨酸變體的含量發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用（圖6-A）。賴氨酸變體是由于抗體重鏈C末端賴氨酸的不完全酶切而引起的，是一類重要的堿性電荷變體。在我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，堿性羧肽酶B（CpB）和堿性羧肽酶H（CpH）是CHO細(xì)胞中兩種主要的負(fù)責(zé)抗體C末端賴氨酸酶切的羧肽酶，它們的表達(dá)及活性受溫度、pH以及各類抑制劑的調(diào)節(jié)［11，16］。此外，有文獻(xiàn)［17］報(bào)道，銅離子和鋅離子分別是堿性羧肽酶的抑制劑和輔因子，它們的濃度和比例將直接影響到羧肽酶的活性，進(jìn)而影響抗體賴氨酸變體以及堿性變體的含量。另一方面，過(guò)高或過(guò)低的銅離子和鋅離子均導(dǎo)致了較高的酸性變體（圖3-A和圖5-A），這可能與銅離子和鋅離子所發(fā)揮的氧化還原作用有關(guān)。Hossler等［18］研究表明，培養(yǎng)基中氧化還原劑的添加可以有效地調(diào)節(jié)抗體的酸性變體。此外，銅離子和鋅離子還會(huì)影響到抗體聚體和碎片的含量［6，7］，而聚體和碎片恰恰與抗體的電荷分布密切相關(guān)［19］。

抗體的電荷異質(zhì)性是評(píng)價(jià)抗體質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo)。然而，電荷變體由于其種類繁多、分離鑒定困難且形成機(jī)制復(fù)雜，如何有效地控制其含量已成為抗體類藥物生產(chǎn)過(guò)程中一個(gè)普遍的難題。本研究通過(guò)對(duì)銅、鋅離子重要性的研究，以及對(duì)其操作空間的討論，為動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的開發(fā)及抗體類藥物電荷異質(zhì)性的有效過(guò)程控制奠定了基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

本研究通過(guò)運(yùn)用過(guò)程分析技術(shù)（Process analytical technology，PAT）對(duì)影響抗體電荷分布的兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程參數(shù)（Critical process parameters，CPPs）銅離子和鋅離子進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，銅離子和鋅離子對(duì)CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)、抗體表達(dá)以及抗體的電荷分布都有顯著影響。調(diào)節(jié)兩者的濃度和配比是控制抗體電荷變體的有效手段。

［1］ Aggarwal RS. What's fueling the biotech engine-2012 to 2013［J］. Nat Biotechnol， 2014， 32：32-39.

［2］ Liu H， Gaza-Bulseco G， Faldu D， et al. Heterogeneity of monoclonal antibodies［J］. J Pharm Sci， 2008， 97（7）：2426-2447.

［3］ Van den Bremer ET， Beurskens FJ， Voorhorst M， et al. Human IgG is produced in a pro-form that requires clipping of C-terminal lysines for maximal complement activation［J］. MAbs， 2015， 7（4）：672-680.

［4］ Eon-Duval A， Broly H， Gleixner R. Quality attributes of recombinant therapeutic proteins：an assessment of impact on safety and efficacy as part of a quality by design development approach［J］. Biotechnol Prog， 2012， 28（3）：608-622.

［5］ Luo J， Vijayasankaran N， Autsen J， et al. Comparative metabolite analysis to understand lactate metabolism shift in Chinese hamster ovary cell culture process［J］. Biotechnol Bioeng， 2012， 109（1）：146-156.

［6］ Chaderjian WB， Chin ET， Harris RJ， et al. Effect of copper sulfate on performance of a Serum-Free CHO Cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed［J］. Biotechnol Prog， 2005， 21（2）：550-553.

［7］ Kao YH， Hewitt DP， Trexler-Schmidt M， et al. Mechanism of antibody reduction in cell culture production processes［J］. Biotechnol Bioeng， 2010， 107（4）：622-632.

［8］ Surve T， Gadgil M. Manganese increases high mannose glycoform on monoclonal antibody expressed in CHO when glucose is absent or limiting：Implications for use of alternate sugars［J］. Biotechnol Prog， 2015， 31（2）：460-467.

［9］ Kaschak T， Boyd D， Lu F， et al. Characterization of the basic charge variants of a human IgG1：effect of copper concentration in cell culture media［J］. MAbs， 2011， 3（6）：577-583.

［10］ Yang JD， Lu C， Stasny B， et al. Fed-batch bioreactor process scaleup from 3-L to 2500-L scale for monoclonal antibody production form cell culture［J］. Biotechnol Bioeng， 2007， 98（1）：141-154.

［11］ Zhang X， Tang H， Sun YT， et al. Elucidating the effects of arginine and lysine on a monoclonal antibody C-terminal lysine variation in CHO cell cultures［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2015， 99（16）：6643-6652.

［12］ Yuk IH， Russell S， Tang Y， et al. Effects of copper on CHO cells：cellular requirements and product quality considerations［J］. Biotechnol Prog， 2015， 31（1）：226-238.

［13］ Kim BG， Park HW. High zinc ion supplementation of more than 30 muM can increase monoclonal antibody production in recombinant Chinese hamster ovary DG44 cell culture［J］. Appl MicrobiolBiotechnol， 2016， 100（5）：2163-2170.

［14］ Wong VV， Ho KW， Yap MG. Evaluation of insulin-mimetic trace metals as insulin replacements in mammalian cell cultures［J］. Cytotechnology， 2004， 45（3）：107-115.

［15］ Cao H. Expression， purification， and biochemical characterization of the antiinflammatory tristetraprolin：a zinc-dependent mRNA binding protein affected by posttranslational modifications［J］. Biochemistry， 2004， 43（43）：13724-13738.

［16］ Zhang X， Sun YT， Tang H， et al. Culture temperature modulates monoclonal antibody charge variation distribution in Chinese hamster ovary cell cultures［J］. Biotechnol Lett， 2015， 37（11）：2151-2157.

［17］ 吳珊， 李素霞. 重組豬羧肽酶B的酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性研究［J］.食品與藥品， 2012， 14（5）：159-162.

［18］ Hossler P， Wang M， McDermott S， et al. Cell culture media supplementation of bioflavonoids for the targeted reduction of acidic species charge variants on recombinant therapeutic proteins［J］. Biotechnol Prog， 2015， 31（4）：1039-1052.

［19］ Du Y， Walsh A， Ehrick R， et al. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies［J］. MAbs， 2012， 4（5）：578-585.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of Metal Ions on Antibody Production and Charge Heterogeneity in CHO Cell Cultures

ZHANG Xin-tao TANG Hong-ping ZHAO Liang FAN Li LIU Xu-ping MIAO Shi-wei TAN Wen-song
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）

The objective of this work is to get insights into the role of metal ions in the production of the monoclonal antibody（mAb）during Chinese hamster ovary（CHO）cell cultures. Cell growth，antibody production and antibody charge distribution at different concentrations of copper and zinc ions during cell cultures were comprehensively investigated. It was found that 120 nmol/L copper ion and 50 μmol/L zinc ion were the optimal concentrations for cell growth and antibody production. Excessively low or high levels of copper and zinc ions brought negative impacts on cell growth and viability maintenance. Additionally，copper ion and zinc ion，as the inhibitor and cofactor of basic carboxypeptidase respectively，showed considerable effects on antibody charge distribution. The medium containing 50 nmol/L copper ion and 50 μmol/L zinc ion was the most conducive to the reduction of charge variants and the increase of main species. Both excessively low or high concentrations of copper and zinc ions led to the increase of the antibody charge variants and the reduction of main species. The concentrations and ratios of copper and zinc ions altered the enzymatic digestion at antibody C-terminal lysine，subsequently affected the content of the basic variant. Additionally，the working space of copper and zinc ions for process control of antibody charge variants was preliminarily discussed. In conclusion，the metal ions play important roles in cell growth，mAb production and mAb charge distribution during CHO cell cultures.

animal cell culture；charge distribution；metal ions；monoclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.034

2016-01-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21406066），國(guó)家重大專項(xiàng)（2013ZX10004003-003-003）

張?chǎng)螡?，男，博士研究生，研究方向：?dòng)物細(xì)胞與組織工程；E-mail：zhangxintao@mail.ecust.edu.cn

趙亮，男，講師，研究方向：動(dòng)物細(xì)胞與組織工程；E-mail：zhaoliang@ecust.edu.cn譚文松，男，教授，研究方向：動(dòng)物細(xì)胞與組織工程；E-mail：wstan@ecust.edu.cn