青藏高原牦牛酸奶中具高抗氧化能力乳酸菌的篩選

陳 明，柯文燦，保安安，張紅梅，荊佩欣，張 娟，丁武蓉，*（.蘭州大學生命科學學院草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅蘭州730000；.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅蘭州73000）

青藏高原牦牛酸奶中具高抗氧化能力乳酸菌的篩選

陳 明1，柯文燦1，保安安1，張紅梅2，荊佩欣1，張 娟1，丁武蓉1，*
（1.蘭州大學生命科學學院草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅蘭州730020）

研究了從青藏高原牦牛酸奶中分離的881株乳酸菌的H2O2耐受能力，從中篩選出了8株對H2O2具有較強耐受能力的乳酸菌，并對它們清除DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基的能力以及T-AOC活性做了進一步研究。結(jié)果顯示，乳酸菌對DPPH自由基的清除能力都是活細胞體高于無細胞提取物；而在對OH自由基、O2-自由基的清除和T-AOC活性上恰好相反。菌株BX62、XS40和XM5在對自由基的清除中表現(xiàn)突出，在菌體濃度為109CFU/mL時，BX62的活細胞體對DPPH自由基的清除率最高（33.53%），其無細胞提取物對O2-自由基的清除率同樣最高（48.85%）。而在乳酸菌無細胞提取物對OH自由基的清除中XS40表現(xiàn)最好（52.12%）。此外，3株乳酸菌都具有較強的T-AOC活性。經(jīng)16S rRNA鑒定和系統(tǒng)進化分析，3株菌分別為Lactobacillus parplantarum BX62，Lactobacillus plantarum XM5和Pediococcus acidilactici XS40。本研究從青藏高原牦牛酸奶中篩選的3株乳酸菌的確具有高抗氧化活性，有作為天然抗氧化劑的應(yīng)用前景。

青藏高原，牦牛酸奶，自由基，乳酸菌，抗氧化能力

生物氧化作用是有機體的必要代謝過程，人體依賴這一過程獲得能量，但過度的氧化作用會產(chǎn)生各種活性氧分子（ROS），如羥自由基（OH）、超氧陰離子（O）等。自由基作用于機體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生

物大分子，造成氧化損傷，導(dǎo)致細胞死亡和組織損害，并引發(fā)多種疾病，給人類健康帶來很大威脅［1-2］。盡管人的機體有抗氧化防御系統(tǒng)，但是這些系統(tǒng)并不能完全有效地抵御或修復(fù)氧化作用帶來的損傷［3］。因此，抗氧化物的挖掘已經(jīng)被保健品、化妝品等眾多行業(yè)列為主要的研究方向之一，也是市場最重要的功能性訴求之一。

乳酸菌在人體中廣泛分布，是人體內(nèi)正常定植菌群，是被公認為健康的微生物。目前已經(jīng)有研究證明一些乳酸菌具有較好的抗氧化活性［4-7］。青藏高原牦牛酸奶作為藏區(qū)人民特色食品和生活必需品，以其豐富的營養(yǎng)，獨特的風味和抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫能力等保健功能，受到了越來越多人的關(guān)注［8］。傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶的保健功能與其中含有大量的乳酸菌密切相關(guān)，近年來已經(jīng)有大量的研究證明乳酸菌具有抑菌、增強機體免疫力、抗衰老和抗癌等益生功能。因此，無論從營養(yǎng)保健還是安全性方面考慮，牦牛酸奶中的乳酸菌作為天然抗氧化物質(zhì)吸引了眾多學者的研究興趣，成為近年來食品研究的新興領(lǐng)域。發(fā)酵乳制品是人們攝入外源乳酸菌的重要渠道，從牦牛酸奶中篩選出性能優(yōu)良的、具有抗氧化活性的乳酸菌菌株，對于開發(fā)青藏高原極端環(huán)境條件下的乳酸菌種質(zhì)資源，生產(chǎn)功能性乳制品、豐富現(xiàn)有乳制品種類、提高乳制品的附加值將具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 采樣地點包括青藏高原不同海拔地區(qū)，其中涉及17個縣，55個地區(qū)，覆蓋青藏高原主要的牦牛集聚地區(qū)和5個主要生態(tài)地理區(qū)，分為蕪湖高原湖盆寒草原區(qū)、藏東高山深谷針葉林區(qū)、藏南高山谷地灌叢草原區(qū)、果洛那曲高原山地高寒灌叢草甸區(qū)，祁連青東高山盆地針葉林、草原區(qū)，緯度跨度30°03′～37°52′，經(jīng)度跨度87°13′～102°56′，海拔高度從2612～4977 m，每個地點共采集6～10戶牧民牦牛酸奶，共采集了116戶牧民酸奶，每戶牧民牦牛酸奶樣采集2份以上，共241個酸奶樣品，所有采集的酸奶樣品pH范圍為3.65～4.87，課題組從241個酸奶樣品中初步篩選得到881株乳酸菌［9］；二苯基苦基苯肼自由基 上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；過氧化氫、Tris、鄰苯三酚、O-菲啰啉 天津市大茂化學試劑廠；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛膽汁 Solarbio公司；膽鹽 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；以上試劑 均為分析純；細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

紫外分光光度計 日本日立公司；超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器公司；高壓滅菌鍋 日本三洋公司；超凈工作臺 名牌之星公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 具過氧化氫耐受能力乳酸菌的篩選 在滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中分別添加H2O2溶液，使培養(yǎng)基中的起始H2O2濃度分別為1.4、1.7、2.0 mmol/L。將菌體濃度為1×108CFU/mL的乳酸菌菌液按10%的接種量接種到含不同H2O2濃度的液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h后用分光光度計測定在不同H2O2濃度下生長的乳酸菌菌液600 nm下的OD值。

1.2.2 乳酸菌細胞及無細胞提取物的制備 將活化好的乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液經(jīng)8000×g，10 min，4℃，離心收集菌體，PBS洗滌3次，重懸于PBS，調(diào)整細胞濃度為1×109CFU/mL，所有菌懸液分為兩組，一組作為活細胞組（IC），另一組用于無細胞提取物的制備。將乳酸菌菌體懸液冰浴超聲破碎，以4℃，8000×g離心10 min，收集上清液，即為無細胞提取物（CFE）［10］。

1.2.3 DPPH自由基清除能力的測定 取樣品1 mL，加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液2 mL，混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，8000×g，4℃，離心10 min，取上清液，在517 nm下測定上清液吸光度，去離子水調(diào)零。

DPPH清除率（%）=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100

式中：Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度；Ac為對照組吸光度［7］。

1.2.4 羥自由基（OH·）清除能力的測定 吸取0.5 mL的樣品和1 mL O-菲啰啉（濃度為0.1%），加入1 mL PBS，1 mL 2.5 mmol/L FeSO4，1 mL 20 mmol/L H2O2。37℃恒溫水浴1.5 h后，536 nm下測吸光度。利用以下公式計算超氧自由基的清除率：

羥自由基清除率（%）=［（A2-A1）/（A0-A1）］×100

式中：A0為空白組吸光度；A1對照組吸光度；A2為樣品組吸光度［11］。

超氧陰離子清除能力（%）=［1-A1/A0］×100

式中：A0為沒有添加樣品的空白對照，A1為添加樣品的吸光度［12］。

1.2.6 總抗氧化能力（T-AOC）的測定 具體操作步驟嚴格按照南京建成總抗氧化能力試劑盒說明進行。

1.2.7 乳酸菌的16S rRNA鑒定與系統(tǒng)進化分析 將純化后的乳酸菌接于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8 h后，8000 r/min離心1 min收集菌體，按照天根生化科技有限公司的試劑盒使用方法提取菌體總DNA。

在細菌的通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGC TACCTTGTTAC GACTT-3’）的擴增下，進行16S rRNA序列的擴增。擴增體系（25 μL體系）為：模板0.6 μL，上下游引物各1 μL，預(yù)混酶12.5 μL，ddH2O為9.9 μL。擴增條件：94℃3 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30個循環(huán)；72℃5 min。PCR產(chǎn)物送上海美吉生測序公司進行測序。在GenBank數(shù)據(jù)庫中利用Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）程序?qū)⑺鶞y定的所有菌株16S rRNA序列與該數(shù)據(jù)庫中已知細菌的16S rDNA/rRNA

序列進行比較鑒定，尋找與目的基因序列最大同源性已知分類的菌種序列。如果兩者之間的16S r RNA同源性值大于97.5%，則可認為他們屬于同一個種［10］。

從數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)屬種的16S rRNA基因序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。采用軟件MEGA 5.5中Clustal X程序進行多重序列比對分析，通過Neighbor-Joining方法與500 Bootstrap的統(tǒng)計檢驗進行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，以確定這幾株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 用Excel 2010軟件處理基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。采用SPSS 19.0軟件的One-way ANOVE進行差異顯著性檢驗，并用Ducan法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 具H2O2耐受能力乳酸菌的篩選

通過檢測881株乳酸菌在含不同濃度H2O2的MRS培養(yǎng)基中生長8 h后的OD值，絕大部分乳酸菌不能生長，其中有8株乳酸菌表現(xiàn)突出。從表1中可以看出，這8株乳酸菌的OD值隨著H2O2濃度的增大都出現(xiàn)不同程度的下降，但下降幅度較緩。8株乳酸菌在空白培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后OD值都在10以上。在H2O2濃度為1.4 mmol/L時所有菌株的OD值范圍在2.291～2.437。在H2O2濃度為1.7 mmol/L時所有乳酸菌的OD值范圍在1.932～2.215。在H2O2濃度為2.0 mmol/L時所有乳酸菌的OD值范圍在1.885～2.156。以上數(shù)據(jù)說明這8株乳酸菌在較高的H2O2脅迫下也能正常生長，具有較強的H2O2耐受能力。

表1 各菌株在不同H2O2濃度下的OD值Table1 OD value of strains in different concentration H2O2

2.2 乳酸菌的DPPH自由基清除能力

如表2所示，8株乳酸菌的無細胞提取物和活細胞體都表現(xiàn)出不同程度的DPPH自由基清除能力，且乳酸菌活細胞體對DPPH自由基的清除率總高于無細胞提取物。在乳酸菌無細胞提取物對DPPH自由基的清除中，菌株MS15表現(xiàn)最差，清除率僅為11.94%；菌株BX62的DPPH自由基清除率最高，為29.06%，除菌株XM5外顯著高于其他乳酸菌（p＜0.05）。在乳酸菌活細胞體對DPPH自由基的清除中，清除率最高的同樣是菌株BX62，為33.53%，顯著高于其他菌株（p＜0.05）。

2.3 乳酸菌的OH自由基清除能力

從表3中可以看出，8株乳酸菌都具有較強的OH自由基清除能力，且乳酸菌無細胞提取物的OH自由基清除率總高于活細胞體。在乳酸菌無細胞提取物對OH自由基的清除中，菌株BX62、XS40、XM5表現(xiàn)最好，其中菌株XS40的清除率為52.15%，顯著高于其他菌株（p＜0.05）。而在乳酸菌活細胞體對OH自由基的清除中，菌株BX62、XS32、XS40、XM8的清除率都大于30%，彼此之間沒有顯著差異（p＞0.05）。

表2 各菌株對DPPH自由基的清除率（%）Table2 Scavenging rate of strains on DPPH radical（%）

表3 各菌株對OH自由基的清除率（%）Table3 Scavenging rate of strains on hydroxyl radical（%）

表4 各菌株對O自由基的清除率（%）Table4 Scavenging rate of strains on superoxide anion radical（%）

表4 各菌株對O自由基的清除率（%）Table4 Scavenging rate of strains on superoxide anion radical（%）

菌株 無細胞提取物 活細胞體BX62 48.85±0.33a 34.83±0.00a XS14 25.14±0.83g 23.55±0.38e XS32 31.32±1.33e 29.29±0.23d XS40 45.33±0.38b 32.85±0.38b XS53 28.38±0.12f 29.42±0.46d XM5 44.76±0.20b 31.00±0.68c XM8 38.07±0.50c 28.50±0.50d MS15 33.84±0.87d 24.34±0.34e

2.5 乳酸菌的T-AOC活性

從表5中可以看出，8株乳酸菌的無細胞提取物和活細胞體都具有一定的T-AOC活性，且乳酸菌無細胞提取物的T-AOC活性都總是高于活細胞體。在所有乳酸菌中菌株BX62具有最高的T-AOC活性，其無細胞提取物和活細胞體的T-AOC活性的分別為2.21 U/mL和1.22 U/mL，均顯著高于其他乳酸菌（p＜0.05）。此外，菌株XS40和XM5的無細胞提取物和活細胞都具有較高的T-AOC活性。

表5 菌株的T-AOC活性（U/mL）Table5 The total antioxidant activity of strains（U/mL）

2.6 乳酸菌的16S rRNA鑒定與系統(tǒng)進化分析

將測定的乳酸菌16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過BLAST工具與已發(fā)表的16S rRNA基因序列進行同源性比對，尋找與目的基因序列最大同源性已知分類的菌種序列。如表6所示，經(jīng)16S rRNA鑒定，8株乳酸菌分為3類菌種，包括2株類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum）、5株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和1株乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），相似度都在99%以上。

表6 各菌株鑒定結(jié)果Table6 Identification results of the strains

在NCBI中查找與目標菌株同源性高的菌株序列，利用MEGA 5.5，以N-J方法繪制乳酸菌的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1所示，植物乳桿菌XS14、XS32、XS53、XM5、MS15與Lactobacillus plantarum WCFS1 strain WCFS1的系統(tǒng)發(fā)生地位最近，類植物乳桿菌BX62和XM8與Lactobacillus paraplantarum strain DSM 10667的系統(tǒng)發(fā)生地位最近，乳酸菌片球菌XS40 與Pediococcus acidilactici strain DSM 20284的系統(tǒng)發(fā)生地位最近。根據(jù)以上數(shù)據(jù)可確定菌株BX62和XM5為類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum），菌株XS14、XS32、XS53、XM5、MS15為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株XS40為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。

圖1 菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the strains

3 討論

乳酸菌清除活性氧自由基的機理，多數(shù)報道認為主要是乳酸菌可以產(chǎn)生清除O自由基的超氧化物歧化酶（SOD）和清除H2O2、OH自由基的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），也正是這些酶使其具有抗氧化活性［13-14］。國內(nèi)外有不少關(guān)于以H2O2耐受能力作為初步篩選具抗氧化能力乳酸菌的研究，普遍采用的方法是檢測乳酸菌在H2O2濃度為0.4、0.7、1.0 mmol/L的培養(yǎng)基中生長8 h后的存活率［15］。為了篩選出真正在較強氧化脅迫環(huán)境下也能生存的乳酸菌，本研究檢測了從青藏高原牦牛酸奶中分離的881株乳酸菌在H2O2濃度高達1.4、1.7、2.0 mmol/L的培養(yǎng)基中生長8 h后的存活率，結(jié)果顯示有8株乳酸菌表現(xiàn)突出，這8株乳酸菌在H2O2濃度高達2.0 mmol/L時菌液OD值都在1.8以上，具有較高的存活率。通過與其他相關(guān)研究［16-17］的實驗結(jié)果對比，可知本實驗初步篩選出的8株乳酸菌具有較強的H2O2耐受能力，能在較強氧化脅迫環(huán)境下生存。同時也證明在青藏高原這種極端環(huán)境條件下確實存在著對氧化脅迫具有很強耐受能力的乳酸菌菌株。

DPPH自由基的清除已經(jīng)成為一種廣泛使用的篩選和評價抗氧化劑抗氧化能力的方法［18］。生命活動的代謝過程所產(chǎn)生的自由基中，OH自由基是體內(nèi)極為活潑的自由氧，氧化能力極強。因此，迫切需要加強清除OH自由基的研究［19］。雖然O自由基不能直接誘導(dǎo)生物和食品體系中的脂類氧化，但它會在金屬離子催化下發(fā)生的fenton反應(yīng)產(chǎn)生具有具有高活性的OH自由基。本實驗結(jié)果顯示這8株乳酸菌的無細胞提取物和活細胞體均具有不同程度的自由基清除能力。此外，從實驗結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)一定的規(guī)律：本實驗初步篩選出的8株乳酸菌對DPPH自由基的清除能力都是活細胞體高于無細胞提取物；而在對HO·自由基、O自由基的清除和T-AOC活性上，除了個別乳酸菌外，都是無細胞提取物高于活細胞體。以

上結(jié)果說明不同乳酸菌對同種自由基的清除活性物質(zhì)在數(shù)量上差距很大，且不同自由基的清除活性物質(zhì)處于細胞中的不同位置。

目前國內(nèi)外有關(guān)具抗氧化能力乳酸菌的篩選的研究不少，篩選的乳酸菌的自由基清除能力有高有低。騫宇等［20］從青藏高原牦牛酸奶中篩選出三株具高抗氧化能力乳酸菌La3、La10和La11，這3株乳酸菌濃度為1010CFU/mL的無細胞提取物對O自由基的清除最高為62.5%，對DPPH自由基的清除率最高為48.6%。Li等［21］從中國傳統(tǒng)食物中篩選出一株具高抗氧化能力植物乳桿菌C88，在菌體濃度為1010CFU/mL 時OH自由基清除率為44.31%，DPPH自由基清除率為53.05%，但是發(fā)現(xiàn)當菌體濃度為109CFU/mL時，DPPH自由基清除率大幅下降。張書文等［22］從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中篩選出2株具抗氧化能力乳酸菌SY13和LJJ，在菌體濃度為109CFU/mL時DPPH自由基清除率最高為27.5%，對OH自由基和O自由基的清除率都在30%左右。本研究中，根據(jù)實驗結(jié)果可知菌株BX62、XS40和XM5在對活性氧自由基的清除中顯著強于其他乳酸菌菌株。在菌體濃度為109CFU/mL時，菌株BX62的活細胞體對DPPH自由基的清除率最高（33.53%），XS40和XM5的清除率也都在27%以上。在乳酸菌無細胞提取物對O自由基的清除中BX62同樣最高（48.85%），XS40和XM5都在44%以上。而在乳酸菌無細胞提取物對OH自由基的清除中XS40表現(xiàn)最好（52.12%），BX62和XM5也都在43%以上。此外，三株乳酸菌的T-AOC活性都在1.9 U/mL以上，BX62最高（2.21 U/mL）。通過與其他研究結(jié)果對比，可發(fā)現(xiàn)菌株BX62、XS40和XM5確實具有較強的自由基清除能力，尤其是具有很強的OH自由基清除能力。

4 結(jié)論

從青藏高原傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中篩選出3株性狀優(yōu)良、具高抗氧化能力乳酸菌Lactobacillus paraplantarum BX62、Lactobacillus plantarum XM5和Pediococcus acidilactici XS40。本次實驗采用的乳酸菌是從我國青藏高原不同海拔、不同地區(qū)采集的241份牦牛酸奶樣品中分離得到的881株乳酸菌，具有純正的地域代表性，這也是首次如此全面、大范圍的從青藏高原牦牛酸奶中分離篩選功能性發(fā)酵乳酸菌。實驗結(jié)果顯示這3株乳酸菌對氧化脅迫具有很強的耐受能力；對活性氧自由基具有較強的清除能力，尤其是具有很強的OH自由基清除能力。在此基礎(chǔ)上，我們準備將篩選出來的3株具高抗氧化能力乳酸菌進行下一步的體內(nèi)實驗。

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Screening of lactic acid bacteria with high antioxidant capacity in Tibetan Plateau yak yogurt

CHEN Ming1，KE Wen-can1，BAO An-an1，ZHANG Hong-mei2，JING Pei-xin1，ZHANG Juan1，DING Wu-rong1，*
（1.State Key Laboratory of Grassland and Agro-Ecosystems，college of Life Science，Lanzhou University，Lanzhou730000，China；2.State Key Laboratory of Grassland and Agro-Ecosystems，College of Pastoral Agriculture Science and Technology，
Lanzhou University，Lanzhou 730020，China）

The H2O2-resistant capacity of 881 strains which isolated from yak yoghurt in the Qinghai Tibet Plateau was introduced in this paper and 8 strains were screened out.It was also studied the scavenging abilities on DPPH radical，OH radical，O2-radical and total antioxidant capacity.The results showed that intact cells of lactic acid bactera scavenged the DPPH radical were more significantly than cell-free extracts while the opposite to clean up OH radical，O2-radical and total antioxidant capacity.According to the data，strains BX62，XS40 and XM5 had outstanding performance in the scavenging of free radicals.The intact cells of BX62 showed the highest ability to scavenge DPPH free radical（33.52%）at the concentration of 109CFU/mL.Besides its cell free extracts also had the best scavenging ability on O2-radical（48.85%）.While the cell-free extracts of XS40 showed the highest ability to scavenge OH radical（52.12%）.In addition，3 strains also had higher T-AOC activity.3 strains screened out in this paper were Lactobacillus parplantarum BX62，Lactobacillus plantarum XM5，and Pediococcus acidilactici XS40 by 16S rRNA identification and phylogenetic analysis.In this study，3 strains of lactic acid bacteria screened out from yak yogurt in the Qinghai Tibet Plateru really had high antioxidant activity，which would have an application prospect as a natural antioxidant in the future.

Tibetan Plateau；yak yoghurt；free radical；lactic acid bacteria；antioxidant capacity

TS252.1

A

1002-0306（2016）08-0201-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.033

2015－09－14

陳明（1992-），男，碩士研究生，研究方向：乳酸菌種質(zhì)資源的發(fā)掘，創(chuàng)新與利用，E-mail：chenm2014@lzu.edu.cn。

*通訊作者：丁武蓉（1982-），女，講師，研究方向：食品微生物，E-mail：dingwr@lzu.edu.cn。

國家自然科學基金（31272486）；蘭州大學中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（20220132YK13）。