一株熒蒽降解菌Rhodococcus erythropolis PJR1的篩選、鑒定及降解特性研究

靳競(jìng)男，劉文娟，劉建麗，姚　俊

(北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083)

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一株熒蒽降解菌Rhodococcus erythropolis PJR1的篩選、鑒定及降解特性研究

靳競(jìng)男，劉文娟，劉建麗，姚俊

(北京科技大學(xué)土木與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083)

采用富集培養(yǎng)方法從大港油田原油樣品中篩選到一株熒蒽降解菌，對(duì)其降解特性進(jìn)行了研究。通過(guò)16S rDNA序列比對(duì)，鑒定該菌株為Rhodococcus屬紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，并命名為PJR1。菌株P(guān)JR1對(duì)熒蒽的降解速率與其生長(zhǎng)活性呈正相關(guān)：在第5～20 d，菌株P(guān)JR1對(duì)熒蒽的降解速率隨其生長(zhǎng)活性的增強(qiáng)而不斷加快；20 d后，則隨其生長(zhǎng)活性的減弱而減慢；30 d完成降解，降解率達(dá)到76.18%。GC-MS分析表明熒蒽代謝產(chǎn)物為9-芴酮、鄰苯二甲酸和苯甲酸。為進(jìn)一步探討熒蒽在Rhodococcus屬中的代謝路徑及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

生物降解；熒蒽；紅球菌屬；降解特性

多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是含有2個(gè)以上芳香環(huán)的有機(jī)類環(huán)境污染物質(zhì)，主要來(lái)源于石油、煤炭和固體廢棄物等含碳化合物在高溫下的不完全燃燒[1-2]。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署已經(jīng)將16類PAHs認(rèn)定為優(yōu)先控制的環(huán)境污染物[3]。由于PAHs對(duì)人類具有潛在的毒性、致癌性和致突變性，已引起研究者的廣泛關(guān)注。化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和高疏水性導(dǎo)致PAHs在環(huán)境中的殘留時(shí)間較長(zhǎng)，并且難以去除[4]。熒蒽是一種具有4個(gè)稠合芳香環(huán)的高分子量PAHs，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與其它致癌性的高分子量PAHs具有一定的相似性。因此，它通常被作為模式化合物來(lái)研究高分子量PAHs的降解機(jī)制及毒理學(xué)性質(zhì)[5]。

生物修復(fù)是利用微生物代謝多樣性的特點(diǎn)來(lái)達(dá)到去除污染物的目的[6]，是一種生態(tài)友好、低成本的污染治理技術(shù)。作者通過(guò)生物富集培養(yǎng)方法從大港油田原油樣品中篩選到1株高效降解熒蒽的菌株，并對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性研究，對(duì)熒蒽在該菌株作用下的代謝路徑進(jìn)行探討，擬為熒蒽的微生物降解機(jī)制研究提供有效的科學(xué)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1材料與培養(yǎng)基

原油樣品取自大港油田港西43-3-3#油井。

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(1L)：0.50gKH2PO4，1.26gNa2HPO4·12H2O，3.00g(NH4)2SO4，0.54gMgSO4·7H2O，0.15mgMnSO4·H2O，0.50mgFeCl3·6H2O，0.24mgZnSO4·7H2O，3.66mgCoCl2·6H2O，0.30mgFeSO4·7H2O。在121 ℃高溫滅菌30min。

無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：在無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中添加1.6%的瓊脂。

1.2菌株的富集培養(yǎng)與分離

將5%的原油樣品添加到含有1g·L-1熒蒽的100mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150r·min-1振蕩培養(yǎng)10d，富集培養(yǎng)3次。將溶于乙酸乙酯的熒蒽溶液涂布于無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，然后接種上述培養(yǎng)液，30 ℃恒溫培養(yǎng)10d，至單菌落形成。挑取邊緣整齊生長(zhǎng)迅速的單菌落于無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中復(fù)篩，重復(fù)3次，得到單一的目的菌株[7]。

1.3菌株的鑒定

取2mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，于10 000r·min-1離心1min，棄上清液，收集菌體。通過(guò)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)提取總DNA。利用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體系25μL：2×TaqMasterMix12.50μL，正向和反向引物各1.00μL，總DNA0.50μL，ddH2O10.00μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性1min；94 ℃變性1min，54 ℃退火1min，72 ℃延伸1min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

菌株16SrDNA序列的測(cè)定由上海生工生物工程股份有限公司完成。采用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的同屬已知序列的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)MEGA5.0中的Neighbor-Joining模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定。

1.4菌株對(duì)熒蒽的降解特性研究

1.4.1熒蒽降解率的測(cè)定

在100 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入100 mg·L-1熒蒽，隨后加入1 mL菌懸液(OD600=0.20)，30 ℃培養(yǎng)30 d。每5 d取樣測(cè)定培養(yǎng)液中熒蒽的殘留量，計(jì)算熒蒽降解率，考察菌株對(duì)熒蒽的降解特性。以加入熱滅活菌懸液的樣品作為對(duì)照。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4.2熒蒽代謝產(chǎn)物的GC-MS分析

取5 mL培養(yǎng)液，加入15 mL乙酸乙酯提取3次，合并提取液。用無(wú)水Na2SO4填充柱去除提取液中殘留的水分，再通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至2 mL，用QP2010SE型GC-MS(日本島津公司)分析熒蒽代謝產(chǎn)物[7]。

GC-MS條件：HP-5色譜柱(30.00 m×0.32 mm，0.25 μm)，以氦氣作為載氣(40 cm3·s-1)；柱溫在60 ℃保持1 min，然后以10 ℃·min-1的速度升溫至320 ℃，保持10 min；質(zhì)譜設(shè)置為電子轟擊模式，電離能為70 eV，離子源溫度為230 ℃。

2　結(jié)果與討論

2.1菌株的鑒定

以熒蒽作為唯一碳源和能源，通過(guò)富集培養(yǎng)，分離篩選到一株能夠有效降解熒蒽的菌株。通過(guò)16S rDNA基因序列的測(cè)定，最終得到1 426 bp的部分保守核苷酸序列。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，該菌株的16S rDNA序列與Rhodococcus屬的細(xì)菌具有高度同源性，其中與Rhodococcuserythropolisstrain BZ4的同源性高達(dá)99%。采用Neighbor-Joining模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1 000，并用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹的可信度進(jìn)行檢驗(yàn)，進(jìn)一步確定該菌株的分類學(xué)地位(圖1)，最終將該菌株鑒定為紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，命名為PJR1。該菌株的16S rDNA基因序列已保存在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，編號(hào)KP257578。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，紅串紅球菌是介于Nocardiaceae科和 Rhodococcus科之間的一類微生物，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，菌落為乳白色，隆起，邊緣完整，表面光滑，不透明，好氧，化能異養(yǎng)。這一結(jié)果也得到了本實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

圖1熒蒽降解菌RhodococcuserythropolisPJR1的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.1Phylogenetic tree of fluoranthene-degrading strainRhodococcuserythropolisPJR1

2.2菌株P(guān)JR1對(duì)熒蒽的降解特性

菌株P(guān)JR1的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)熒蒽的降解率如圖2所示。

圖2　菌株P(guān)JR1的生長(zhǎng)曲線及其對(duì)熒蒽的降解率

由圖2可以看出，降解初始，細(xì)菌的生長(zhǎng)活性與熒蒽的降解率呈正相關(guān)，呈現(xiàn)出快速上升的趨勢(shì)；在第5～20 d，降解速率較快，降解率為27.58%～68.08%；但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌生長(zhǎng)活性下降，菌株P(guān)JR1對(duì)熒蒽的降解速率減緩；第30 d時(shí)，降解率達(dá)到76.18%。表明菌株P(guān)JR1對(duì)熒蒽具有良好的降解能力。

2.3熒蒽代謝產(chǎn)物分析

對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行GC-MS分析，共檢測(cè)到3種熒蒽代謝產(chǎn)物：9-芴酮、鄰苯二甲酸和苯甲酸，具體的保留時(shí)間(tR)和碎片離子的m/z見表1。

表1熒蒽及其代謝產(chǎn)物的保留時(shí)間(tR)和碎片離子的m/z

Tab.1　Retention time(tR) and m/z of fragment ions of fluoranthene and its metabolites

Kelley等研究表明，熒蒽的降解起始于熒蒽芳香環(huán)上C1-C2原子的雙羥基化反應(yīng)，形成中間體1,2-二羥基熒蒽；在微生物各種氧化還原酶的作用下，中間體9-芴酮-1-甲酸形成并發(fā)生脫羧反應(yīng)，生成9-芴酮[8-9]；隨之9-芴酮作為代謝中間體經(jīng)過(guò)與芴和萘相同的代謝路徑，其鄰位碳原子發(fā)生雙氧化反應(yīng)，形成中間體鄰苯二甲酸[10-11]，鄰苯二甲酸進(jìn)一步脫羧形成苯甲酸[12]。

菌株P(guān)JR1在降解熒蒽的過(guò)程中，通過(guò)一系列的氧化還原反應(yīng)形成中間體9-芴酮，之后通過(guò)鄰苯二甲酸代謝路徑進(jìn)一步降解，生成無(wú)毒或毒性更低的小分子物質(zhì)，最終通過(guò)三羧酸循環(huán)生成二氧化碳和水，如圖3所示。

圖3　熒蒽在菌株P(guān)JR1中的代謝路徑

3　結(jié)論

從大港油田原油樣品中篩選到一株熒蒽高效降解菌。通過(guò)16S rDNA序列比對(duì)，鑒定該菌株屬于Rhodococcus屬紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，命名為PJR1。菌株P(guān)JR1對(duì)熒蒽的降解速率與細(xì)菌生長(zhǎng)活性呈正相關(guān)，30 d的降解率達(dá)到76.18%。GC-MS檢測(cè)到3種熒蒽代謝產(chǎn)物，分別是9-芴酮、鄰苯二甲酸和苯甲酸，由此得出，鄰苯二甲酸代謝路徑參與了菌株P(guān)JR1對(duì)熒蒽的降解過(guò)程。為進(jìn)一步研究熒蒽在Rhodococcus屬細(xì)菌中的降解機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。

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Screening,Identification and Degradation Properties of a Fluoranthene-Degrading StrainRhodococcuserythropolisPJR1

JIN Jing-nan,LIU Wen-juan,LIU Jian-li,YAO Jun

(SchoolofCivilandEnvironmentalEngineering,UniversityofScienceandTechnologyBeijing,Beijing100083,China)

Afluoranthene-degradingstrainwasisolatedfromcrudeoilinDagangOilfieldbyenrichmentculture,anditsdegradationpropertieswerestudied.Basedonthesequencealignmentof16SrDNA,itwasidentifiedasRhodococcus erythropoliswhichbelongedtoRhodococcusandnamedasPJR1.ThedegradationspeedofstrainPJR1waspositivecorrelationwithitsgrowthactivity.Duringtheperiodof5～20dculture,thedegradationspeedofstrainPJR1increasedwiththeimprovementofgrowthactivity,20dlater,bothofthedegradationspeedandgrowthactivitydecreased.Finally,thedegradationcompletedin30dwithdegradationrateof76.18%.GC-MSAnalysisshowedthat,metabolitesoffluoranthenewere9-fluorenone,phthalicacidandbenzoicacid.ThisstudyprovidesatheoreticalbasisforthefurtherresearchofmetabolicrouteandmechanismoffluorantheneinRhodococcus.

biodegradation;fluoranthene;Rhodococcus;degradationproperty

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.08.008

國(guó)家自然科學(xué)基金杰出青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41273092)

2016-03-09

靳競(jìng)男(1986-)，女，河南焦作人，博士研究生，研究方向：有機(jī)污染物的生物修復(fù)，E-mail：jinjingnan2010@163.com；通訊作者：姚俊，教授，E-mail：yaojun@163.com。

Q 939.9

A

1672-5425(2016)08-0035-04

靳競(jìng)男，劉文娟，劉建麗，等.一株熒蒽降解菌RhodococcuserythropolisPJR1的篩選、鑒定及降解特性研究[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(8)：35-38.