聚合酶鏈反應(yīng)在乙型肝炎母嬰傳播基因診斷中的應(yīng)用研究

陳　曉

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，福州 350005)

?

聚合酶鏈反應(yīng)在乙型肝炎母嬰傳播基因診斷中的應(yīng)用研究

陳曉

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院輸血科，福州 350005)

目的探究聚合酶鏈反應(yīng)在乙型肝炎(簡稱乙肝)母嬰傳播基因診斷中的臨床價值。方法使用聚合酶鏈反應(yīng)對2014年3月至2015年3月收治的已感染HBV孕產(chǎn)婦108例與其新生兒股靜脈血液HBV-DNA水平進(jìn)行檢測。結(jié)果單純性乙肝患者血清內(nèi)HBeAg陽性組的HBV-DNA水平明顯比抗-HBc和抗-Hbe陽性組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HBeAb陽性組和HBcAb陽性對照組中有部分患者的HBV-DNA水平較高，證實胎兒出現(xiàn)宮內(nèi)感染的概率和母體血清HBV-DNA水平存在關(guān)聯(lián)性，其母體中HBV-DNA水平升高，胎兒出現(xiàn)宮內(nèi)感染的概率也就越大。結(jié)論使用定量檢測的方式對孕產(chǎn)婦血液內(nèi)HBV-DNA水平加以檢測，可以全面反映出孕婦疾病的傳染性，進(jìn)而實現(xiàn)預(yù)計HBsAg陽性孕產(chǎn)婦胎兒出現(xiàn)宮內(nèi)感染的風(fēng)險強(qiáng)弱，之后有針對性地對高危人群實施治療，全面減少其宮內(nèi)感染的發(fā)生率。

宮內(nèi)感染；乙型肝炎；熒光定量PCR；HBV-DNA；母嬰傳播

當(dāng)前，乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)的母嬰傳播力已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界所關(guān)心的問題[1]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)首次由外國學(xué)者Saiki提出，該檢測方式當(dāng)前已經(jīng)被應(yīng)用在多種疾病的診斷，在診斷HBV感染方面也突顯出重要地位。當(dāng)前HBV子宮內(nèi)感染已經(jīng)被國內(nèi)外學(xué)者所證實[2]。結(jié)合實際情況，本文選擇2014年3月至2015年3月本院收治的已感染HBV的孕婦(108例)血清和新生兒靜脈血HBV-DNA為研究標(biāo)本，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對其血清乙肝標(biāo)記物進(jìn)行研究，全面觀察孕產(chǎn)婦血清內(nèi)HBV水平和胎兒宮內(nèi)感染的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2014年3月至2015年3月本院收治的已感染HBV孕產(chǎn)婦108例與其新生兒股靜脈血液HBV-DNA為研究標(biāo)本。年齡23.6～33.7歲，平均(27.4±3.6)歲。經(jīng)臨床診斷，孕產(chǎn)婦符合最新全國病毒性肝炎會議中制定的關(guān)于乙肝的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有孕婦均為單胎生產(chǎn)，新生兒平安降生。在其懷孕32周時，每月為其注射高價免疫球蛋白，并對其分娩前后的外周血加以采集，同時使用乙肝疫苗實施全程免疫。在新生兒出生之后1 d，將HBV-DNA或者HBsAg陽性視為宮內(nèi)感染?，F(xiàn)依照孕婦血清ELISA檢測結(jié)果，將其分成HBeAg陽性對照組(64例)，HBeAb陽性組(25例)和HBcAb陽性對照組(19例)。各組受試者年齡等基線資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1HBV-DNA的定量檢測本實驗所使用的試劑盒均由北京諾康生物制劑有限公司生產(chǎn)，其引物序列為P1:5′-ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TT-3′(23 bp),P2:5′-ACA GTG GGG GAA AGC CCT ACG AA-3′(23 bp)，熒探針的序列為5′-TGG CTA GTT TAC TAG TGC CAT TTG-3′(25 bp)。HBV-DNA的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)由本院診斷中心提供。本實驗使用堿裂解法， 在血清內(nèi)提取出HBV-DNA[3]。將各個反應(yīng)管放在全自動熒光檢測設(shè)備中，擴(kuò)增條件如下：在93 ℃環(huán)境中預(yù)變性2 min，后按照93 ℃ 45 s、55 ℃ 120 s做40個循環(huán)。使用德國西門子公司生產(chǎn)的全自動熒光PCR設(shè)備進(jìn)行相關(guān)工作。在實施PCR過程中，持續(xù)性檢測反應(yīng)體系內(nèi)的熒光信號改變情況，如果信號加強(qiáng)到某一個特定閾值(結(jié)合熒光信號基線平均值與標(biāo)準(zhǔn)值差，算出將99.7%置信度大于平均值，即為閾值)的時候，循環(huán)次數(shù)就會被記錄，這個循環(huán)參數(shù)和PCR體系內(nèi)初始DNA對數(shù)之間存在線性關(guān)系，后使用標(biāo)準(zhǔn)化HBV-DNA創(chuàng)建回歸方程，結(jié)合標(biāo)本的循環(huán)次數(shù)值，能夠精準(zhǔn)地算出DNA數(shù)量，經(jīng)由計算機(jī)可分析出定量結(jié)果，最終值為對數(shù)值。

1.2.2質(zhì)量控制各項試驗中設(shè)置的雙份陰性對照與5個含量不一的HBV-DNA陽性對照，在各個標(biāo)準(zhǔn)中選擇兩個孔當(dāng)作計算結(jié)果，本實驗使用Kwok提出的預(yù)防污染方式進(jìn)行相關(guān)操作。

1.2.3HBV血清標(biāo)志物檢測對于該項標(biāo)志物，本實驗使用ELISA進(jìn)行檢測，試劑提供廠家為北京諾康生物制劑有限公司。

2　結(jié)　　果

2.1標(biāo)準(zhǔn)化HBV-DNA定量分析結(jié)果HBV定量陽性質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)過熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)，將初始復(fù)制數(shù)對數(shù)視為橫坐標(biāo)，將循環(huán)閾值當(dāng)作縱坐標(biāo)，可以得出直線型標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計算，其斜率為-2.336。陽性關(guān)系系數(shù)為0.956 2。上述結(jié)果證實，使用循環(huán)次數(shù)實施定量的精準(zhǔn)性。

2.2108例HBV感染者血清內(nèi)HBV-DNA水平和標(biāo)志物之間的關(guān)系血清HBeAg陽性對照組的HBV-DNA水平明顯高于HBeAb陽性組與HBcAb陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在陽性HBeAb陽性組和HBcAb陽性組內(nèi)，一部分孕產(chǎn)婦HBV-DNA呈現(xiàn)出了較高水平。HBeAg陽性對照組，HBeAb陽性組和HBcAb陽性對照組的孕產(chǎn)婦血清HBV-DNA對數(shù)均值分別是4.98±1.02、3.62±0.88、2.96±1.06，兩兩相比，組間數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳情見表1。

2.3108例新生兒相關(guān)情況本次實驗相關(guān)研究結(jié)果證實，105例新生兒的HBV-DNA水平在常規(guī)范圍內(nèi)，3例HBV-DNA水平為2.3×103copy/μL，與之相對應(yīng)的標(biāo)志物為HBeAg和HBcAb陽性，其母體的乙肝標(biāo)志物為HBcAb、HBcAg和HBeAg，新生兒DNA定量情況為2.5×105copy/μL。在本次試驗中，新生兒靜脈HBcAb陽性共計43例。HBsAg和HBcAb陽性共計7例。HBcAb，HBsAb和HBeAb陽性共計3例。

表1　　單純性HBV感染孕產(chǎn)婦血清HBV-DNA含量和標(biāo)志物之間的關(guān)聯(lián)性

注：HBV-DNA定量如果小于102，可以被視為陰性，無需計算在內(nèi)。

3　討　　論

隨著我國醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)展，F(xiàn)Q-PCR已經(jīng)成為了實施基因診斷的主要方式。從最早的斑點雜交法開始，到后來的PCR-ELISA等，PCR的定量精準(zhǔn)性和假陽性污染為臨床工作人員面臨的兩個難題[4]。這主要體現(xiàn)在以下兩個方面：第一，使用上述方式實施檢測，和各式各樣的PCR后續(xù)處理分不開，這些處理過程會令數(shù)量龐大的PCR生成物彌散到空氣中，進(jìn)而出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象[5]。第二，上述方式的定量法主要是針對PCR產(chǎn)物進(jìn)行的，但PCR存在的平臺效應(yīng)在很大程度上影響了PCR初始數(shù)量與最終產(chǎn)物相關(guān)性，令精準(zhǔn)性不佳，F(xiàn)Q-PCR以常規(guī)方式為基礎(chǔ)，增加雙標(biāo)記探測針，一個標(biāo)記于探針5′，被稱之為熒光報告基團(tuán)，另外一個標(biāo)記于探測針3′,被稱為熒光抑制劑基團(tuán)，上述兩個物質(zhì)可以被構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)[6]，探針在沒有特異PCR出現(xiàn)時，熒光信號并不會發(fā)生改變，如果存在PCR擴(kuò)增，探針會在PCR過程中被Taq酶5′-3′活性切斷，抑制作用下降，報告基團(tuán)熒光信號提升，伴隨著PCR的進(jìn)展，其產(chǎn)物越多，信號越強(qiáng)[7]。動態(tài)實時定量PCR就是基于上述原理進(jìn)行的。和以往方式存在差異，這種方法使用全封閉測量，并不需要對PCR進(jìn)行再次處理，以防止污染，在此同時也使用了動態(tài)檢測技術(shù)，令Ct值和初始模板數(shù)量呈現(xiàn)出線性關(guān)系，有著較強(qiáng)定量精準(zhǔn)性，另外使用電子監(jiān)測的方式，替代既往觀察，靈敏度得以提升[8]。

早在20世紀(jì)90年代，我國就實現(xiàn)了對新生兒的乙肝疫苗接種，使得新生兒罹患乙肝的概率明顯下降，但值得說明的是，對于在宮內(nèi)發(fā)生感染的新生兒，在出生后使用乙肝疫苗并沒有特別顯著的效果[9]，因此這部分新生兒極易演變成HBV攜帶者。造成宮內(nèi)感染發(fā)生的原因相對復(fù)雜，當(dāng)前還沒有公認(rèn)性較強(qiáng)的HBV宮內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)，目前學(xué)術(shù)界對新生兒肝臟組織內(nèi)HBV-DNA檢測較為理想，但這種方式實際操作起來相對困難[10]。

在本次試驗中顯示，孕婦的HBV-DNA感染陽性檢出率較高，且呈現(xiàn)為三種表象，血清HBeAg陽性對照組的HBV-DNA水平明顯比HBeAb陽性組與HBcAb陽性對照組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在陽性HBeAb陽性組和HBcAb陽性組內(nèi)，一部分孕產(chǎn)婦HBV-DNA呈現(xiàn)出了較高水平。

證實單純性乙肝患者血清內(nèi)的HBeAg可以代表HBV活躍性，F(xiàn)Q-PCR可在基因定量其水平進(jìn)一步證明了HBeAg能夠全面反映出乙肝復(fù)制水平，在本次試驗中可證實，在出現(xiàn)宮內(nèi)感染的患兒中，大部分患者的HBeAg呈現(xiàn)出陽性，且HBV-DNA水平較高，證實HBeAg陽性患者，其新生兒出現(xiàn)宮內(nèi)感染的概率要比HBeAg陰性者大，證明兩者之間存在較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。

對于本試驗中涉及的HBV-DNA陽性者，在HBeAb與HBcAb陽性組內(nèi)，部分患者HBV-DNA水平超出常規(guī)，證實HBeAg水平減少和HBeAb與HBcAb水平上升并不能表示其病毒復(fù)制能力下降或者病情好轉(zhuǎn)。

在本試驗中，有個別案例呈現(xiàn)為HBeAg陰性但HBV-DNA水平提升，證實HBeAg陰性但HBV-DNA陽性者其新生兒依舊可能發(fā)生宮內(nèi)感染。由此能夠看出，使用母體HBV-DNA來判斷其傳染性和宮內(nèi)發(fā)生感染風(fēng)險更具有說服力。

綜上所述，使用定量檢測的方式對孕產(chǎn)婦血液內(nèi)HBV-DNA水平加以檢測，可以全面反映出孕婦疾病傳染性，進(jìn)而實現(xiàn)預(yù)測HBsAg陽性孕產(chǎn)婦胎兒出現(xiàn)宮內(nèi)感染風(fēng)險的強(qiáng)弱，之后有針對性地對高危人群實施治療，全面減少其宮內(nèi)感染發(fā)生率。

[1]李新新.人類白細(xì)胞抗原-DQB1基因多態(tài)性與家族性乙肝原發(fā)性肝癌相關(guān)性研究[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué),2014.

[2]丁莉莎,陳曦,楊志軍,等.湖南省HIV-1和HBV合并感染者中HBV基因亞型流行情況分析[J].中國艾滋病性病,2011,17(6):621-625.

[3]呂曉婷,王俊峰,臧嘉.乙肝病毒DNA與前S1抗原在產(chǎn)前檢查中的意義[J].中國婦幼保健,2013,28(1):166-168.

[4]張樹仁,王文蓉,趙麗華,等.應(yīng)用PCR病毒定量評價免疫預(yù)防對阻斷母嬰垂直傳播乙型肝炎價值的研究[J].放射免疫學(xué)雜志,2008,21(4):377-380.

[5]王文歡,曹建彪.乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌抗病毒治療的現(xiàn)狀[J].世界華人消化雜志,2013,21(5):415-420.

[6]王國婧,王剛,董小巖,等.用重組8型腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的乙型肝炎病毒持續(xù)感染小鼠模型評價核苷類似物的抗病毒效果[J].生物工程學(xué)報,2013,29(1):95-106.

[7]廖祥偉,凌云,李新華,等.宿主IL28B基因型聯(lián)合病毒基因型對慢性丙型肝炎抗病毒療效的預(yù)測[J].中國病毒病雜志,2011(1):35-40.

[8]謝雯,閆杰,趙紅.慢性乙型肝炎聯(lián)合抗病毒治療專家共識[J].中華實驗和臨床感染病雜志(電子版),2011,3(2):224-233.

[9]閆杰,謝雯.慢性乙型肝炎特殊患者抗病毒治療專家共識:2014年更新[J].臨床肝膽病雜志,2014,30(7):580-587.

[10]周麗英,蔣理.乙型肝炎病毒核酸載量與乙型肝炎病毒大蛋白的相關(guān)性研究[J].中華疾病控制雜志,2012,16(1):39-42.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.048

A

1673-4130(2016)16-2322-02

2016-04-19

2016-06-20)