免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用研究

陳佩宣,李漢秋,吳細妹,陳志娟,劉建國

(廣東省東莞廣濟醫(yī)院　523690)

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免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用研究

陳佩宣,李漢秋,吳細妹,陳志娟,劉建國

(廣東省東莞廣濟醫(yī)院523690)

目的探討免疫比濁法在檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用。方法收集2014年1～10月東莞廣濟醫(yī)院皮膚科血清標本480份，用免疫比濁法、梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)分別進行檢測，陽性結(jié)果與TPPA檢測不符的標本采用熒光螺旋體抗體吸附試驗(FTA-ABS)進行驗證；另選擇10份TPPA檢測滴度為1∶1 280陽性標本，用生理鹽水按照1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280進行稀釋，用免疫比濁法和ELISA分別進行檢測。結(jié)果TPPA檢出陽性標本70份，免疫比濁法檢出陽性標本69份，ELISA檢出陽性標本73份，4份與TPPA陽性結(jié)果不相符的標本經(jīng)FTA-ABS確認全部為陰性；10份滴度為1∶1 280的陽性標本稀釋后用免疫比濁法和 ELISA對各個滴度進行檢測，其敏感性分別為78.3%和96.7%。結(jié)論免疫比濁法、ELISA與TPPA3種方法特異性差異無統(tǒng)計學意義，免疫比濁法可以取代TPPA作為梅毒血清學初篩陽性標本的確認試驗在臨床上推廣應(yīng)用；敏感性方面免疫比濁法比ELISA低，在檢測低濃度標本時差異有統(tǒng)計學意義，免疫比濁法不能取代ELISA作為梅毒螺旋體抗體過篩試驗。

梅毒螺旋體抗體；免疫比濁法；梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗；酶聯(lián)免疫吸附試驗

梅毒是由梅毒螺旋體感染引起的一種慢性傳染病，主要通過性接觸直接傳播，還可以通過胎盤、接吻、手術(shù)、輸血、哺乳、接觸污染物等途徑進行傳播。梅毒螺旋體感染人體后可侵犯人體的所有器官，對人類健康危害極大。梅毒臨床表現(xiàn)可分為早期梅毒、晚期梅毒和潛伏梅毒。早期梅毒和潛伏梅毒可無臨床癥狀[1]，診斷主要靠實驗室檢查，尤其是梅毒血清學檢查。實驗室檢測梅毒血清抗體的方法有很多種，不同檢測方法的臨床應(yīng)用有所不同。免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體是一種新開展的檢測方法，對本方法進行研究和評價具有十分重要的臨床意義。本研究通過對免疫比濁法與梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(TPPA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的特異性和敏感性進行比較分析，探討免疫比濁法在檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1標本來源收集東莞廣濟醫(yī)院2014年1～10月皮膚科進行梅毒血清學檢查的血清標本480份，其中男性300份、女性180份，年齡2～84歲、平均33歲。

1.2儀器與試劑日立7180全自動生化分析儀，徠卡DM750熒光顯微鏡，雷杜RT-6000酶標分析儀，匯松PW-9600全自動酶標洗板機，梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒(免疫比濁法)由北京邁譽森生物科技有限公司提供，ELISA試劑購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，TPPA試劑購自日本富士瑞必歐株式會社，F(xiàn)TA-ABS試劑購自德國歐蒙公司。所有試劑都在有效期內(nèi)使用。

1.3方法用免疫比濁法、TPPA和ELISA分別對480份標本進行檢測，陽性結(jié)果與TPPA檢測不符的標本采用熒光螺旋體抗體吸附試驗(FTA-ABS)進行驗證；另選擇10份TPPA檢測滴度為1∶1 280陽性標本，用生理鹽水按照1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280進行稀釋，用免疫比濁法和ELISA分別進行檢測。操作嚴格按照試劑說明書和SOP文件進行。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)　　果

2.1免疫比濁法檢測出陽性標本69份，其中68份結(jié)果與TPPA檢測結(jié)果相符；ELISA檢測出陽性標本73份，其中70份與TPPA檢測結(jié)果相符。4份與TPPA陽性結(jié)果不相符的標本經(jīng)FTA-ABS(IgG) 確認全部為陰性；1份比濁法檢測為陰性而TPPA和ELISA分別檢測為陽性的標本經(jīng)FTA-ABS(IgG)確認為陽性。TPPA、免疫比濁法與ELISA的特異度分別為100.0%、99.8%和99.2%；敏感度分別為100.0%、97.1%和100.0%，結(jié)果見表1。

表1　　3種方法檢測結(jié)果比較(n)

表2　　10份1∶1 280陽性標本稀釋后免疫比濁法與ELISA檢測結(jié)果比較(n)

注：+表示陽性，-表示陰性。

2.2在10份TPPA檢測滴度為1∶1 280的陽性標本稀釋至1∶40、1∶80、1∶160、1∶320時免疫比濁法和酶聯(lián)免疫吸附試驗兩種方法檢測結(jié)果都為陽性；稀釋至1∶640時免疫比濁法檢測7份陽性、3份陰性，ELISA檢測10份都為陽性；稀釋至1∶1 280時免疫比濁法檢測均為陰性，ELISA檢測8份陽性、2份陰性。統(tǒng)計二者的敏感度分別為78.3%和96.7%，結(jié)果見表2。免疫比濁法特異性低于TPPA但高于ELISA，不過其差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，敏感性方面免疫比濁法比ELISA低，特別是在檢測低濃度標本時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3　討　　論

梅毒螺旋體是引起梅毒的病原體，人體感染了梅毒螺旋體后可產(chǎn)生多種抗體。梅毒螺旋體人工培養(yǎng)較為困難，實驗室診斷主要以血清學為主。梅毒血清學檢測試驗根據(jù)抗原不同分為兩類：一類為非特異性抗體檢測，另一類是特異性抗體檢測。梅毒非特異性抗體檢測常用于對血清標本進行初篩、臨床療效觀察、復發(fā)或再感染的檢查，其缺點是不能反映既往感染，且受其他因素影響較大，易產(chǎn)生假性結(jié)果；梅毒特異性抗體檢測常用于對非特異性抗體初篩陽性標本進行復檢確認，此類方法的缺點是不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，且不能作為療效觀察指標。對上述血清學試驗如何選擇應(yīng)用，世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國疾病預防控制中心(CDC)都推薦用梅毒螺旋體非特異性抗體試驗對血清標本進行過篩試驗，出現(xiàn)陽性者用梅毒螺旋體特異性抗體試驗進行確認，這是傳統(tǒng)的梅毒血清學檢測方案，缺點是對過往感染者易產(chǎn)生漏檢；目前國內(nèi)外一些臨床實驗室為了降低漏檢率和提高工作效率逐漸采用梅毒血清學“逆向程序檢測方案”[2]，即先用梅毒螺旋體特異性抗體試驗對血清標本進行過篩試驗，出現(xiàn)陽性者用梅毒螺旋體非特異性抗體試驗進行現(xiàn)癥確認。

目前國內(nèi)大多數(shù)實驗室在檢測梅毒螺旋體特異性抗體常采用ELISA和TPPA。ELISA是在聚苯乙烯微孔條上預包被梅毒螺旋體抗體的基因重組抗原，配以酶標記抗原、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及過氧化物等試劑，檢測人血清或血漿中梅毒螺旋體抗體。ELISA試劑具有價廉、保存時間長且穩(wěn)定、不污染環(huán)境、敏感性高、可批量操作等優(yōu)點，被推薦為梅毒血清學篩查的理想方法[3]，也是我國血站篩查梅毒抗體的指定方法。TPPA是將梅毒螺旋體Nichols株的精制菌體成分包被在人工載體明膠粒子上，這種致敏粒子和樣品中的梅毒螺旋體抗體進行反應(yīng)發(fā)生凝集，產(chǎn)生粒子凝集反應(yīng)，由此可以檢測出血清和血漿中的梅毒螺旋體抗體，并且可用來測定抗體效價。TPPA具有高特異性，目前國內(nèi)外臨床實驗室常用它作為初篩陽性或可疑標本的確證試驗[4]。免疫比濁法是以純化的梅毒螺旋體抗原包被在乳膠表面上，利用這種致敏顆粒與標本中的梅毒螺旋體抗體進行抗原抗體反應(yīng)發(fā)生乳膠凝集，凝集反應(yīng)引起吸光度變化，通過測定反應(yīng)前后吸光度變化量檢測梅毒螺旋體抗體的濃度。免疫比濁法與ELISA和TPPA都是檢測梅毒螺旋體特異性抗體，所以本研究通過采用免疫比濁法與TPPA和ELISA這兩種相對成熟的方法在特異性和敏感性方面進行比較分析，探討免疫比濁法在檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用。

免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體是一種新開展的檢測方法。本研究采用免疫比濁法、ELISA和TPPA分別檢測480份血清標本，陽性結(jié)果與TPPA檢測不符的標本采用FTA-ABS進行驗證，統(tǒng)計3種檢測方法的特異性和敏感性；選擇10份TPPA檢測滴度為1∶1 280陽性標本，用生理鹽水按照1∶40、1∶80……1∶1 280進行稀釋，用免疫比濁法和ELISA分別進行檢測，統(tǒng)計兩種方法在檢測低濃度標本時的敏感性。從檢測結(jié)果中可以看出：免疫比濁法特異性低于TPPA但高于ELISA，不過其差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與相關(guān)報道相一致[5]；敏感性方面免疫比濁法比ELISA低，特別是在檢測低濃度標本時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。由此可見，免疫比濁法可作為梅毒血清學初篩陽性標本的確認試驗，由于其整個操作過程可在全自動生化分析儀進行，操作簡單，人為影響因素少，易于標準化，且可以定量，無論是大批量標本還是單個標本的檢測，都可以做到隨到隨測，非常方便，所以本研究認為免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體完全可以取代TPPA在臨床上加以推廣應(yīng)用。在本次研究中也可以看出，在70例陽性標本中免疫比濁法存在2例漏檢，在對低濃度標本檢測敏感性明顯比不上ELISA，這可能是受其方法學的局限所致(免疫比濁法的最小檢測限為μg水平[6]，而ELISA則可達到ng甚至pg水平[7])。人感染梅毒螺旋體后的臨床表現(xiàn)十分復雜，有的甚至不出現(xiàn)任何臨床癥狀，及早發(fā)現(xiàn)對梅毒進行及時治療有很大幫助，因此在對梅毒血清學篩查時更看重檢測方法的敏感性，所以本研究認為免疫比濁法不能取代在“逆向程序檢測方案”中常用于梅毒螺旋體抗體篩查的ELISA。

在進一步研究中發(fā)現(xiàn)：免疫比濁法誤判為陽性的標本有輕微脂血，而脂血是影響本法假性升高的重要因素之一，因此凡是能引起濁度變化的標本，比如高血脂、反復凍融、細菌污染、變質(zhì)等標本均不宜用此法檢測梅毒螺旋體抗體；ELISA誤判為陽性的3例標本中有1例標本溶血，1例標本來自78歲的老年男性，1例原因不明。溶血標本中的血紅蛋白可非特異的吸附到反應(yīng)孔上，在洗板不徹底的情況下，血紅蛋白的亞鐵血紅素具有類過氧化酶活性，作用于底物引起假陽性；老年患者用ELISA檢測梅毒螺旋體抗體易出現(xiàn)假陽性，這可能與一些交叉抗原和其自身免疫狀況有關(guān)[8]；原因不明的假陽性標本極有可能是由一些非特異物質(zhì)干擾引起，但也有可能是感染梅毒螺旋體時間不長，或者是一些自身免疫缺陷患者抗體滴度極低所致，像此類患者需定期進行隨訪復查或采用其他方法(如直接鏡檢、基因測定等)做進一步檢查。

綜上所述，免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體有較高的特異性，有操作簡單方便、速度快、可定量等優(yōu)點，可作為對梅毒血清學初篩陽性標本的確認試驗加以推廣應(yīng)用；而要求有高敏感性的梅毒螺旋體抗體過篩試驗，免疫比濁法卻有所欠缺，加上價格昂貴，因此不主張加以推廣。免疫比濁法所測定的定量結(jié)果對梅毒療效觀察意義不大，陽性結(jié)果濃度的高低對陽性預測值的判斷有一定的幫助。免疫比濁法的檢測結(jié)果與其他血清學檢測方法一樣，陽性僅提示標本中有梅毒螺旋體抗體存在，不能作為臨床診斷的絕對依據(jù)，陰性也不能完全排除梅毒螺旋體感染，診斷須結(jié)合病史、臨床癥狀、實驗室檢查進行綜合分析。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.045

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1673-4130(2016)16-2316-03

2016-02-22

2016-05-24)