枯草芽胞桿菌HZB02的分離及其室內抑菌效果

周小林,　黃振文,　劉人豪,　葛　磊,　顧衛(wèi)兵

(1.南通科技職業(yè)學院,南通市植物有害生物監(jiān)測與綜合治理重點實驗室, 南通　226007;2. 中興大學植物病害管理實驗室,臺中　40227; 3. 南通舜德生物制品有限公司, 南通　226000)

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枯草芽胞桿菌HZB02的分離及其室內抑菌效果

周小林1*,黃振文2,劉人豪3,葛磊1,顧衛(wèi)兵1

(1.南通科技職業(yè)學院,南通市植物有害生物監(jiān)測與綜合治理重點實驗室, 南通226007;2. 中興大學植物病害管理實驗室,臺中40227; 3. 南通舜德生物制品有限公司, 南通226000)

從施用SupperGreen的小白菜‘鳳山5號’根際土壤中分離篩選到1株對白菜炭疽病菌(Colletotrichum higginsianum)有較強拮抗活性的細菌菌株HZB02。該菌株對白菜炭疽病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長、盆栽白菜發(fā)病等均有明顯的抑制能力。根據菌落形態(tài)、菌體電鏡觀察及16SrDNA序列測定結果判斷,該菌株屬于Bacillus subtilissubsp. subtilis。進一步研究不同培養(yǎng)基條件及添加大豆油對HZB02抗生作用的影響,發(fā)現其在SYMA、PDA培養(yǎng)基上抑制炭疽病菌菌絲生長的能力最佳,此外其SYM、PDB發(fā)酵液對炭疽病菌孢子萌發(fā)的抑制作用亦最強,然而它的TSB發(fā)酵液則顯示出最優(yōu)抑制菌絲生長的效果。研究發(fā)現在SYM與PDB中添加5%大豆油的發(fā)酵液可顯著提升HZB02的抑菌功效。

枯草芽胞桿菌;拮抗細菌;白菜炭疽病菌;室內抑菌

近幾年來,因為食品與環(huán)境生態(tài)的安全問題,農藥及化肥的使用受到越來越多的限制,不用任何化肥農藥的有機栽培法得到了較多的推行。這給作物病害的治理帶來了兩個方面的變化,一是田間的病害種類發(fā)生了巨大的改變,比如有機田易發(fā)生由Colletotrichum higginsianum引起的白菜炭疽病、Sclerotium rolfsii(無性世代)導致的白絹病等病害[1];二是非農藥植保手段要設法彌補農藥限制所留下的空間,其中生物防治是可以大力發(fā)展應用的主要方法,高效無污染的生物防治技術已成為研究熱點[2]。

大量實踐證明, 芽胞桿菌的穩(wěn)定性、與其他化學試劑的相容性和在不同果蔬不同年份防效的一致性等方面均明顯優(yōu)于非芽胞桿菌和真菌生防菌劑[3]。用蔗糖麩酸培養(yǎng)基培養(yǎng)的Bacillusspp.BR-11 及BS-25皆可促進其對白花芥藍黑斑病的抑制效果[4]。微生物制劑的組成成分會影響拮抗微生物的生物活性及儲架壽命[5],其中不同來源的碳氮是影響拮抗微生物抗生作用的重要因子,因此如何有效地提升微生物制劑的有效性及防治潛力,導入環(huán)境因子的調控,以建立一個利于拮抗微生物生長及促其抗生物質產生的發(fā)酵環(huán)境,是研發(fā)微生物制劑不可忽略的方面之一[6]。

本研究以白菜炭疽病菌為測試對象,對從小白菜根際土壤中分離得到的細菌與放線菌菌株進行控病作用測試,以期篩選出有較高生防效果的菌株;同時對影響其生防作用發(fā)揮的培養(yǎng)條件進行初步研究,為生防制劑的應用開發(fā)提供依據。

1　材料與方法

1.1供試材料

SuperGreen(SG),由安理科技公司(新北市)提供,為一種香蕉萃取物。

白菜炭疽病病菌(Colletotrichum higginsianum)菌株PA01,由中興大學植物病害管理實驗室提供。

SYMA培養(yǎng)基由黃豆粉(20g)煮沸20min后的濾液,添加5g糖蜜(市售),加水至1L,瓊脂20g(無瓊脂則為SYM),pH7.5,再滅菌而成;幾丁質培養(yǎng)基:2g膠狀幾丁質(中興大學植物病害管理實驗室自制)、瓊脂20g、K2HPO40.7g、KH2PO40.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、ZnSO40.001g,水1L,pH自然。

其他固體培養(yǎng)基包括:TSA、PDA、NA、ISP4,相應液體培養(yǎng)基包括:TSB、PDB、NB、ISP4-A。均為美國DIFCO公司產品。

小白菜品種為‘鳳山5號’,種子為臺中市售,種植于日光溫室中,在3葉1心時挑選長勢較為一致的植株進行試驗。

1.2菌株的誘導與分離

用SG500倍液澆透盆栽小白菜基質,一周后采集土樣。用幾丁質、PDA等培養(yǎng)基進行菌株分離,挑選菌落四周有不透明圈的放線菌、分解幾丁質能力較強及數量較多的菌落,進一步進行純化培養(yǎng),每周用PDA平板畫線更新待用。

1.3分離菌株對白菜炭疽病菌的抑菌作用

先采用平板對峙法粗篩出有抑菌作用的菌株,再進行精確測定。

取濃度為105個/mL的白菜炭疽病菌PA01分生孢子懸浮液10μL于PDA平板中央,在PA01兩側對稱的兩點分別接種兩株待測菌,與PA01相距2cm,待測菌濃度為107個/mL孢子(細胞)液,每點接10μL;以只接種菌株PA01為對照。各處理均為4個重復。30℃培養(yǎng)8d后,測量菌株PA01的菌落直徑。按如下公式計算抑菌率：

抑菌率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100。

1.4HZB02 PDB發(fā)酵產物對白菜炭疽病(菌)的控制效果

選用PDB培養(yǎng)液,將HZB02 于30℃、150r/min下培養(yǎng)5d,發(fā)酵液離心后過0.22μm濾膜除菌備用。

1.4.1對白菜炭疽病菌孢子萌發(fā)的影響

設置無菌水(CK)、HZB02除菌發(fā)酵液的2×、10×、100×稀釋液共4個處理,每處理3個重復,每重復隨機調查100個孢子的萌發(fā)狀況。

操作方法：取5μL105個/mL菌株PA01分生孢子懸浮液與5μLHZB02發(fā)酵液在無菌玻片上混勻,置于無菌培養(yǎng)皿中,于30℃下保濕培養(yǎng)。12h后檢查孢子萌發(fā)率、萌發(fā)孢子中未形成附著胞的百分比及其他抑制萌發(fā)的特征。

孢子萌發(fā)率(%)=(對照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率)/對照組孢子萌發(fā)率×100。

1.4.2對白菜炭疽病的控制效果

取溫室中生長有3葉1心的白菜植株,分別噴施清水、HZB02PDB發(fā)酵液10×、50×、100×稀釋液,待葉面干燥后噴霧接種105個/mL菌株PA01分生孢子懸浮液,每盆接種孢子液10mL,保濕24h。每個處理4個重復,每重復3株(盆)。

5d后調查各處理植株1～3葉發(fā)病狀況,計算各處理的病情指數和相對防效。各葉片發(fā)病程度分級標準為：0級，無發(fā)病,1級，發(fā)病率[0～0.07%],2級，發(fā)病率(0.07%～3%],3級，發(fā)病率(3%～10%],4級，發(fā)病率(10%～25%],5級，發(fā)病率(25%～50%],6級，發(fā)病率50%以上;1～5級的發(fā)病率上限不計在本級別內[7]。

相對防效(%)=

1.5HZB02的鑒定

觀察HZB02在平板上的菌落形態(tài),用電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)與大小,再進行種的分子鑒定。

分子鑒定通過微波法提取菌株DNA,擴增引物為16S-F(5′-TTGTACACACCGCCCGTCA-3′)和23S-R(5′-GGTACCTTAGATGTTTCAGTTC-3′)[8]。反應體系：兩種10μmol/L引物各0.4μL, 5×PCRMasterMix4μL, 模板DNA1μL，ddH2O14.2μL。擴增條件：92℃ 5min;92℃ 60s,55℃ 60s,72℃ 60s,30個循環(huán);72℃ 5min;4℃保存。PCR產物測序由源資國際生物科技股份有限公司完成,再將該序列與美國國家生物信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)數據庫進行比對,采用MAGE5.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6不同培養(yǎng)基對HZB02抑菌作用的影響

1.6.1不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的HZB02對白菜炭疽病菌菌絲生長的影響

HZB02平板培養(yǎng)選擇SYMA、TSA、PDA、NA、ISP4等5種培養(yǎng)基。

取105個/mL菌株PA01分生孢子懸浮液10μL于各平板中央,在與PA01相距2.5cm的對稱的兩點各接種106個/mLHZB02菌液10μL,每處理4個重復。30℃培養(yǎng)8d后,測量受各待測菌影響的PA01菌落直徑,同時觀察HZB02在各種培養(yǎng)基上的生長及抑菌表現狀況。

1.6.2HZB02不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對白菜炭疽病菌的影響

菌株HZB02的發(fā)酵選用SYM、TSB、PDB、NB、ISP4-A(不含瓊脂)共5種培養(yǎng)基,在30℃,150r/min條件下培養(yǎng)5d。取各發(fā)酵液過0.22μm濾膜除菌備用。

1.6.2.1對孢子萌發(fā)的影響

設置無菌水CK、經不同培養(yǎng)基發(fā)酵的HZB02除菌發(fā)酵液10×稀釋液共6個處理。每處理3個重復,每重復隨機調查100個孢子的萌發(fā)狀況。

操作方法:將5μL105個/mL菌株PA01分生孢子懸浮液與5μLHZB02發(fā)酵液在無菌玻片上混勻;每玻片上做3個重復,置于保濕無菌培養(yǎng)皿中30℃下培養(yǎng);12h后檢查孢子萌發(fā)抑制率及抑制萌發(fā)特征。

1.6.2.2對菌絲生長的影響

將各除菌發(fā)酵液與熔化的PDA培養(yǎng)基(V/V為1∶50)混合均勻,以不加發(fā)酵液的PDA平板為對照,每處理4個重復。取105個/mL菌株PA01分生孢子懸浮液10μL置于平板中央,30℃培養(yǎng),待對照組菌落基本長滿平板時測定各處理菌落直徑。

1.6.3添加植物油的發(fā)酵液對抑菌作用的影響

設置SYM、PDB、TSB及分別添加0.5%(V/V)大豆油共6個處理,將各發(fā)酵液除菌后與PDA培養(yǎng)基(V/V為1∶50)混合均勻,以不加發(fā)酵液的PDA平板為對照,每處理4個重復。取105個/mL菌株PA01分生孢子液10μL置于平板中央,30℃培養(yǎng),待對照組菌落基本長滿平板時測定各處理菌落直徑。

1.7數據處理

試驗數據采用SAS9.0 軟件進行統(tǒng)計分析,采用Duncan’s新復極差法對各處理進行差異顯著性檢測。

2　結果與分析

2.1分離菌株對白菜炭疽病菌的抑菌效果

從白菜根際土壤中共分離到25株細菌和16株放線菌。經過平板對峙培養(yǎng)初步篩選出2株細菌和5株放線菌對白菜炭疽病菌菌株PA01菌絲生長有一定的抑制效果;有6個菌株在PDA平板上不能良好生長,無法觀察其影響;其他菌株則沒有抑菌作用。

經進一步精確測定,細菌HZB02、放線菌HZS08具有極為顯著的抑制菌株PA01生長的作用,抑菌率分別達到69.90%和63.15%;3個放線菌菌株HZS07、HZS10、HZS06抑制作用表現微弱;細菌HZB03、放線菌HZS16則無明顯作用(表1)。

表1　拮抗菌對白菜炭疽病菌的抑制作用篩選1)Table 1　Inhibitory effects of antagonistic HZB and HZSstrains on Colletotrichum higginsianum

1) 表中同列數據后不同小寫字母表示經Duncan’s新復極差法檢驗差異顯著(P<0.05)。下同。

DatainthesamecolumnfollowedbydifferentlowercaselettersaresignificantlydifferentbyDuncan’snewmultiplerangetest(P<0.05).Thesamebelow.

2.2HZB02 PDB發(fā)酵產物對白菜炭疽病(菌)的控制效果

2.2.1對白菜炭疽病菌PA01孢子萌發(fā)的影響

HZB02除菌發(fā)酵液2×稀釋液對菌株PA01的孢子萌發(fā)率雖然沒有明顯的影響(表2),但萌發(fā)產生的菌絲普遍出現腫大,萌發(fā)孢子中只有5.67%產生淺色的附著胞(圖1a);10×稀釋液處理的PA01其孢子萌發(fā)率為90.67%,顯著高于對照的80.00%,可能是除菌發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質有促進孢子萌發(fā)的作用,但萌發(fā)的孢子中僅7.00%有附著胞,且附著胞與萌發(fā)孢子基部的長度普遍長于孢子長度3倍以上(圖1b);100×稀釋液處理的菌株PA01萌發(fā)率較CK高,且產生附著胞,與對照沒有顯著差異。

表2　HZB02 PDB發(fā)酵產物對白菜炭疽病菌 孢子萌發(fā)的控制作用Table 2　Effects of fermentationproducts of HZB02 on conidial germination ofColletotrichum higginsianum in PDB medium

圖1　HZB02 PDB發(fā)酵產物對白菜炭疽 病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.1　Conidial germination of Colletotrichum higginsianum after the treatment with fermentation products of HZB02 in PDB medium

附著胞是炭疽菌產生的能穿透寄主組織的特殊侵染結構[9],對其致病性有著重要影響。10倍稀釋液處理后雖然90.67%的白菜炭疽病菌孢子萌發(fā),但絕大多數不能正常形成附著胞。因此，以此為起點,設置10×、50×和100×發(fā)酵液進行盆栽防效試驗。

2.2.2對白菜炭疽病的控制效果

HZB02PDB發(fā)酵液對白菜炭疽病顯示出較好的控病作用(表3)。10×稀釋液的相對防效達到64.79%,50×和100×也分別達到31.19%和28.00%,顯示出較為理想的控病效果。10×稀釋液處理后葉片上出現邊緣模糊的褐色斑塊,其他2個低濃度處理未見此狀況,可能是因為高濃度導致的“藥害”。

表3　HZB02 PDB發(fā)酵產物對白菜炭疽病的控制作用Table 3　Effects of fermentation products of HZB02 inPDB medium on anthracnose disease control

2.3HZB02的鑒定

在不同培養(yǎng)基平板上，HZB02的菌落顏色均為稍灰暗的乳白色,不規(guī)則形,邊緣鋸齒狀。在電子顯微鏡下可見菌體為短桿狀,兩端鈍圓,1.56(1.42～1.67)μm×0.78(0.73～0.87)μm(圖2)。

圖2　HZB02電鏡下形態(tài)(5 000×)Fig.2 Observation of HZB02 morphology under electron microscopy

HZB02菌株16SrDNA片段的序列鑒定及分析結果顯示,HZB02屬于Bacillus subtilissubsp. spizizenii,與菌株NRS231 (CP010434.1)、TU-B-10 (CP002905.1)、W23 (CP002183.1)的相似度達到99%(圖3)。

2.4不同培養(yǎng)基對HZB02抑菌作用的影響

2.4.1不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的HZB02對白菜炭疽病菌菌絲生長的影響

不同平板培養(yǎng)基上的HZB02對白菜炭疽病菌菌絲生長抑制作用表現出顯著差異,在SYMA、PDA培養(yǎng)基上其抑制作用表現最為優(yōu)異,對白菜炭疽病菌菌絲抑菌率分別達到74.64%、69.99%,在NA、ISP4培養(yǎng)基上的抑菌率也達到50%以上,顯示出較強的抑菌作用和營養(yǎng)適應能力(表4)。另外,在PDA平板上,白菜炭疽病菌被抑制處菌落表現出黑色、鋸齒狀特征,其他幾種培養(yǎng)基上則較為整齊,亦無顏色變化。

圖3　菌株HZB02 16S-23S rDNA 基因區(qū)間序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree based on 16S-23S rDNA interval sequences of the strain HZB02 and its relatives

培養(yǎng)基 Medium抑菌率/% InhibitionrateSYMA(74.64±2.05)aTSA(32.03±3.47)ePDA(69.99±2.29)bISP4(53.88±2.08)dNA(59.26±2.49)c

2.4.2不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對白菜炭疽病菌的影響

2.4.2.1對孢子萌發(fā)的影響

HZB02不同液體培養(yǎng)基發(fā)酵液10×稀釋液對白菜炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的影響有著較大的差異。從總體萌發(fā)率來看,SYM發(fā)酵液處理的白菜炭疽病菌只有34.0%的孢子萌發(fā),顯示出優(yōu)異的抑制孢子萌發(fā)的作用;其他幾種發(fā)酵液中白菜炭疽病菌分生孢子萌發(fā)率則都明顯高于對照的80.0%,均達到90%以上,可能是發(fā)酵液中營養(yǎng)的促進作用;發(fā)酵液對附著胞形成的影響與對孢子萌發(fā)的影響相似,TSB、PDB發(fā)酵液處理的白菜炭疽病菌只有12.67%和29.00%具有附著胞(表5)。

2.4.2.2對菌絲生長的影響

利用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)HZB02得到的發(fā)酵液除菌后與熔化的PDA培養(yǎng)基(V/V為1∶50)混合,對白菜炭疽病菌菌絲生長的抑制作用與對孢子萌發(fā)的影響有所不同。結果顯示,TSB培養(yǎng)的HZB02抑菌率最高,與其他幾種培養(yǎng)液差異顯著;SYM、PDB次之,NB、ISP4-A則與對孢子的影響一致,只有6.69%和6.00%(表6)。

表5　HZB02不同發(fā)酵液對白菜炭疽病菌 分生孢子萌發(fā)的影響Table 5　Effects of different fermentation products of HZB02on conidial germination of Colletotrichum higginsianum

表6　HZB02不同發(fā)酵液對白菜炭疽病菌 菌絲生長的影響Table 6 Effects of different fermentation products ofHZB02 on mycelial growth of Colletotrichum higginsianum

2.4.3添加植物油的發(fā)酵液對抑菌作用的影響

3種培養(yǎng)基中添加5%大豆油的HZB02發(fā)酵液對白菜炭疽病菌菌絲生長抑制作用不同。其中SYM、PDB中添加大豆油后抑菌率顯著提高,分別從29.91%提高到35.12%、30.68%提高到36.60%;但TSB添加大豆油后其抑菌能力反而下降了5百分點。

表7　添加大豆油的發(fā)酵液對白菜炭疽病菌菌絲生長的影響1)Table 7　Effects of the addition of soybean oil to fermentationproducts on mycelial growth of Colletotrichum higginsianum

1) 同行數據后不同小寫字母表示在0.05水平有顯著差異。
Differentsmalllettersinthesamerowindicatesignificantdifferenceat0.05level.

3　討論

炭疽菌的分生孢子先附著于寄主表面,條件適合,產生芽管,繼而在其頂端形成附著胞,隨后侵入寄主表皮細胞[10]。因此,分生孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的高低成為病原菌侵染寄主成功與否的關鍵[11]。Bacillus subtilisHZB02多種發(fā)酵產物有明顯導致附著胞消失或黑色素減少的現象,這是由于培養(yǎng)基中殘存營養(yǎng)的影響,還是特定的代謝產物的作用,以及該現象與對病害控制的關系有待深入研究。

生物農藥的加工開發(fā)中,通過液態(tài)培養(yǎng)進行批量生產是最具經濟效益的方法,許多培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)時間等)對生物制劑功效的發(fā)揮有著重要的影響[12-13]。Bacillus subtilisHZB02總體表現出優(yōu)良的抑菌和控病能力,顯示出較好的生防應用潛力。本研究測定了不同C源、N源的固體與液體培養(yǎng)基以及添加大豆油情況下培養(yǎng)的HZB02對白菜炭疽病菌的影響,結果表明,抑制孢子萌發(fā)和菌絲生長的優(yōu)勢培養(yǎng)基有所不同,SYM、PDB的抑制孢子萌發(fā)作用最強,而TSB則顯示出最優(yōu)的抑制菌絲生長能力,HZB02制劑的最佳培養(yǎng)條件還需進一步篩選優(yōu)化。

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(責任編輯：楊明麗)

IsolationofBacillus subtilisHZB02anditsantimicrobialeffect

ZhouXiaolin1,HuangJennwen2,LiuRenhao3,GeLei1,GuWeibing1

(1.NantongCollegeofScienceandTechnology,NantongKeyLaboratoryofPlantPestMonitoringandComprehensiveManagement,Nantong226007,China; 2.LaboratoryofPlantDiseasesManagement,ChungHsingUniversity,Taichung40227,China; 3.NantongShundeBiologicalsCo.,Ltd.,Nantong226000,China)

AbacterialstrainHZB02,whichishighlyantagonisticagainstColletotrichum higginsianum,wasisolatedandscreenedfromtherhizospheresoilofChinesecabbage‘Fengshan5’ (Brassica chinensisL.)whichwasdrenchedwithSupperGreen.ThestrainhadsignificantlyinhibitoryeffectonconidialgerminationandmycelialgrowthofC.higginsianum,aswellastheinfectionofBrassica chinensisL.bytheanthracnosefungusinthelaboratoryandgreenhouseexperiments.Accordingtotheresultsofmorphologicalcharacteristics,electronmicroscopicobservationand16SrDNAsequencehomology,thestrainHZB02wasidentifiedasBacillus subtilissubsp. subtilis.DifferentnutrientmediaandtheadditionofsoybeanoilforculturingHZB02werefurtherevaluatedforitsantibioticeffectsonthepathogen.TheresultsshowedthatthestrongestinhibitoryeffectonthemycelialgrowthofC.higginsianumwasobservedwhenHZB02andthefunguswereduallyculturedinSYMAandPDA.ConidialgerminationwasalsohighlyinhibitedbyfermentationproductsofHZB02inSYMandPDB.Moreover,theantimicrobialeffectofthestrainHZB02wasdramaticallyenhancedwhenitsculturalmediaSYMandPDBwereaddedwith5%(V/V)soybeanoil.

Bacillus subtilis;antagonisticbacterium;Colletotrichum higginsianum;antimicrobialeffect

2014-11-24

2015-02-15

江蘇省高校優(yōu)秀中青年教師和校長境外研修項目(2011年度)；南通舜德生物制品有限公司和南通市植物有害生物監(jiān)測與綜合治理重點實驗室提供部分資金資助

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S476

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.025