圓滑番荔枝葉乙醇提取物中抑菌活性成分的初步分離

茍亞峰,　高圣風(fēng),　孫世偉,　桑利偉,　劉愛(ài)勤

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所, 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 萬(wàn)寧　571533)

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圓滑番荔枝葉乙醇提取物中抑菌活性成分的初步分離

茍亞峰,高圣風(fēng),孫世偉,桑利偉,劉愛(ài)勤*

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所, 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 萬(wàn)寧571533)

采用活性跟蹤法對(duì)圓滑番荔枝葉乙醇提取物中抑菌活性成分進(jìn)行了初步分離。結(jié)果表明:圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑制活性最高,從該萃取組分中分離得到化合物松香酸和β-谷甾醇,并測(cè)定了其對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性。當(dāng)兩種化合物供試濃度為0.6mg/mL時(shí)抑菌率分別達(dá)到了69.21%和61.78%,對(duì)胡椒瘟病菌具有一定抑菌效果。

圓滑番荔枝葉;萃取組分;胡椒瘟病菌;抑菌活性

圓滑番荔枝(Annona glabraLinn.)是番荔枝科(Annonaceae)番荔枝屬(Annona)植物[1],我國(guó)南方諸省均有栽培。番荔枝科植物具有抗病毒、殺蟲(chóng)、抗癌等多種生理活性。楊世林等[2]對(duì)番荔枝科植物化學(xué)成分及其抗腫瘤活性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明該科植物所含的番荔素、多氧環(huán)己烯和苯乙烯內(nèi)酯是主要的抗腫瘤活性成分。田麗娟等[3]、常世忠等[4]對(duì)圓滑番荔枝的化學(xué)成分進(jìn)行了分析,分離得到貝殼杉烷型二萜和生物堿等化合物,發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抑制腫瘤的生理活性。姜盼等[5]綜述了圓滑番荔枝的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)其藥用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。茍亞峰等[6-7]研究報(bào)道了圓滑番荔枝乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)具有較好的抑制作用。因此,本試驗(yàn)以胡椒瘟病菌為供試病原菌,采用活性追蹤法[8]分離圓滑番荔枝葉乙醇提取物中抑菌活性成分,為進(jìn)一步研制防治胡椒瘟病的植物源殺菌劑提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試植物和供試病原菌

圓滑番荔枝葉采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所院內(nèi)。將新鮮的圓滑番荔枝葉充分陰干,磨碎過(guò)40目篩后置通風(fēng)、避光處儲(chǔ)藏備用。

胡椒瘟病菌(Phytophthora capsici)由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所病蟲(chóng)害防控研究室提供。

1.2圓滑番荔枝葉乙醇提取物制備

采用冷浸法:準(zhǔn)確稱取3kg的圓滑番荔枝葉干粉裝入廣口瓶中,加入干粉5倍量的乙醇浸提48h,過(guò)濾,依次重復(fù)3次,合并3次濾液并減壓濃縮,得圓滑番荔枝葉乙醇提取物浸膏514.50g,放置4℃冰箱內(nèi)備用。

1.3抑菌活性成分分離純化

準(zhǔn)確稱取圓滑番荔枝葉乙醇提取物浸膏,用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯不同溶劑萃取,通過(guò)抑菌活性測(cè)定篩選出抑菌活性較高的萃取段進(jìn)行抑菌活性成分分離純化。將大孔樹(shù)脂濕法裝柱,用適量的溶劑溶解萃取段,上樣,用二氯甲烷∶乙醇系統(tǒng)梯度洗脫,等量接餾分(每瓶大約200mL)。結(jié)合薄層色板技術(shù)合并相同餾分,減壓濃縮,上GC-MS分析(具體分離流程如圖1)。

圖1　圓滑番荔枝抑菌活性成分分離純化流程圖Fig.1　Flowchart of separation and purification of the components with antifungal activity from Annona glabra leaves

1.4抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定圓滑番荔枝葉乙醇提取物不同溶劑萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性:準(zhǔn)確稱取供試化合物,先用溶劑助溶,再用無(wú)菌蒸餾水定容,制成母液。采用倍半稀釋法用無(wú)菌蒸餾水依次稀釋成供試濃度。將培養(yǎng)基熔化并冷卻至50℃左右,把1mL不同濃度的供試化合物分別與9mL/皿的PDA培養(yǎng)基混勻,待其凝固后,取菌落直徑為5mm的胡椒瘟病菌的外層菌塊放置于培養(yǎng)皿中央,以加入等體積萃取溶劑的PDA培養(yǎng)平板為對(duì)照,每個(gè)處理做3個(gè)皿重復(fù)。接種后,在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi),25～28℃下培養(yǎng)5d,采用十字交叉法分別測(cè)量菌落直徑,求其平均值,按下式計(jì)算抑菌率。

菌落直徑(cm)=測(cè)量菌落直徑平均值-0.5；

2　結(jié)果與分析

2.1圓滑番荔枝葉乙醇提取物的不同溶劑萃取物抑菌活性測(cè)定

按照1.4的方法測(cè)定不同萃取組分的抑菌活性,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　不同萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果Fig.2　Antifungal activity of different extracts to Phytophthora capsici

從圖2中可以看出,在供試濃度下乙酸乙酯萃取組分的抑菌活性均高于石油醚和三氯甲烷萃取組分。當(dāng)供試濃度為10mg/mL時(shí),只有乙酸乙酯萃取組分對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌率達(dá)到了50%以上,其他兩種溶劑萃取組分抑菌率均低于50%。當(dāng)供試濃度為20mg/mL時(shí),乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚萃取組分的抑菌率分別為74.43%、44.98%和34.63%。由此可見(jiàn)乙酸乙酯萃取組分中含有抑制胡椒瘟病菌的活性成分,可作為下一步抑菌活性成分分離的萃取組分。

2.2GC-MS檢測(cè)

按照1.3的流程對(duì)乙酸乙酯萃取組分進(jìn)行抑菌活性化合物分離,通過(guò)GC-MS檢測(cè),觀察各餾分的譜圖,并與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比,得化合物1和2。

化合物1 的GC-MS檢測(cè)質(zhì)譜信息(圖3)與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中松香酸數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物1為三環(huán)二萜類化合物松香酸(化學(xué)式為C20H30O2)。

化合物2的GC-MS檢測(cè)質(zhì)譜信息(圖4)與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中β-谷甾醇數(shù)據(jù)一致,故鑒定化合物2為甾醇類化合物β-谷甾醇(化學(xué)式為C29H50O)。

圖3　化合物1質(zhì)譜圖譜及與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照?qǐng)DFig.3　MS of compound one and standard control

圖4　化合物2質(zhì)譜圖譜及與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照?qǐng)DFig.4 MS of compound two and standard control

2.3松香酸和β-谷甾醇對(duì)胡椒瘟病菌抑菌活性測(cè)定

分別用倍半稀釋法將化合物松香酸和β-谷甾醇(上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司,純度大于75%)配成5個(gè)梯度濃度(0.6、0.3、0.15、0.075、0.037 5mg/mL),按照1.4的方法測(cè)定其對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5　松香酸和β-谷甾醇對(duì)胡椒瘟病菌抑菌活性測(cè)定結(jié)果Fig.5　Antifungal activity of abietic acid and β-sitosterol to Phytophthora capsici

從圖5中可以看出,在供試濃度下松香酸對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性均高于β-谷甾醇,當(dāng)供試濃度為0.6mg/mL時(shí),松香酸和β-谷甾醇對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌率分別達(dá)到了69.21%和61.78%,對(duì)胡椒瘟病菌具有一定的抑菌活性。

3　結(jié)論與討論

從本試驗(yàn)中可以得出,圓滑番荔枝葉乙醇提取物的乙酸乙酯萃取組分中含有對(duì)胡椒瘟病菌有較高抑菌活性的化合物。當(dāng)供試濃度為20mg/mL時(shí),乙酸乙酯萃取組分抑菌率達(dá)到了74.43%,高于石油醚和三氯甲烷萃取組分的抑菌活性。進(jìn)一步對(duì)乙酸乙酯萃取組分中抑菌活性成分分離,得到松香酸和β-谷甾醇,當(dāng)供試濃度為0.6mg/mL時(shí)，二者對(duì)胡椒瘟病

菌的抑菌率分別達(dá)到了69.21%和61.78%,均對(duì)胡椒瘟病菌具有一定的抑菌活性,其中松香酸的抑菌活性略高于β-谷甾醇。

有研究報(bào)道番荔枝科植物含有生物堿、萜類、黃酮、番荔素、多氧環(huán)己烯和苯乙烯內(nèi)酯等成分,這些成分具有驅(qū)蟲(chóng)、抗病毒、殺蟲(chóng)、抗癌等多種生理活性[9-10]。因此,圓滑番荔枝葉乙醇提取物乙酸乙酯萃取組分中的高抑菌活性成分有待進(jìn)一步分離,此項(xiàng)研究對(duì)胡椒安全生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有一定意義。

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì). 中國(guó)植物志[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2004:170.

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

PrimaryisolationofthecomponentswithantifungalactivityfromethanolextractsofAnnona glabraleaves

GouYafeng,GaoShengfeng,SunShiwei,SangLiwei,LiuAiqin

(SpiceandBeverageResearchInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences;HainanProvincialKeyLaboratoryofGeneticImprovementandQualityRegulationforTropicalSpiceandBeverageCrops,Wanning571533,China)

Byusingbioassay-guidedmethod,thecomponentswithantifungalactivitywereisolatedfromtheethanolextractsofAnnona glabraleaves.TheresultsshowedthatethylacetateextractionofAnnona glabraleafethanolextracthadthestrongestinhibitoryeffectonPhytophthora capsici,andtwocompounds(abieticacidandbetasitosterol)wereisolatedfromethylacetateextraction.Theantifungalactivityofthetwocompoundswastested.Whenabieticacidandβ-sitosterolconcentrationwas0.6mg/mL,theinhibitionrateagainstPhytophthora capsicireachedto69.21%and61.78%,respectively.

Annona glabraleaf;extractcomponent;Phytophthora capsici;antifungalactivity

2014-11-19

2015-01-22

國(guó)家自然科學(xué)基金(31501681)；海南省自然科學(xué)基金(313091)

E-mail：laq3680@163.com

S435

ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.024