一個(gè)水稻褐飛虱為害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆

關(guān)麗梅,　馬偉華,　林擁軍,　陳　浩*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢　430070;2.江西省科學(xué)院, 南昌　330029)

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一個(gè)水稻褐飛虱為害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的克隆

關(guān)麗梅1,2,馬偉華1,林擁軍1,陳浩1*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢430070;2.江西省科學(xué)院, 南昌330029)

目前組成型啟動(dòng)子在基因工程中的應(yīng)用最為廣泛,然而驅(qū)動(dòng)外源基因在各組織中持續(xù)恒定地表達(dá)可能引起植物發(fā)育遲緩等問題。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能夠在特定條件下實(shí)現(xiàn)目的基因定時(shí)優(yōu)勢(shì)表達(dá),最大限度減少由于非必需蛋白在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的積累對(duì)其造成的傷害。依據(jù)基因芯片數(shù)據(jù)并通過定量RT-PCR驗(yàn)證,找到了一個(gè)受水稻褐飛虱(Nilaparavatalugens)為害誘導(dǎo)表達(dá)基因(LOC_Os01g73940)。用PCR技術(shù)從秈稻品種‘TN1’的基因組中獲得Os01g73940上游1 953 bp的啟動(dòng)子片段,命名為BPHIP。將BPHIP連接到帶有β-glucuronidase(GUS) 報(bào)告基因的植物表達(dá)載體上,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻品種‘中花11’。通過GUS組織化學(xué)染色法及定量RT-PCR檢測(cè)證明,BPHIP是一個(gè)受褐飛虱為害和茉莉酸處理誘導(dǎo)上調(diào)的啟動(dòng)子。利用此類啟動(dòng)子在基因工程中可以減少對(duì)水稻生理方面產(chǎn)生的副作用,對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

水稻;誘導(dǎo)型啟動(dòng)子;褐飛虱;抗蟲;基因工程

近幾年,全國(guó)病蟲草鼠害年均發(fā)生面積達(dá)4.67億hm2,雖然通過各種防治手段挽回大量經(jīng)濟(jì)損失,但是每年仍損失糧食達(dá)4 000萬t。農(nóng)作物病蟲害除了造成產(chǎn)量損失外,還能造成農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降,出現(xiàn)腐爛、霉變等,甚至產(chǎn)生對(duì)人體有毒、有害的物質(zhì)。一些主要病、蟲害對(duì)作物生產(chǎn)具有嚴(yán)重威脅,例如,稻飛虱、螟蟲等蟲害以及水稻稻瘟病、水稻白葉枯病、水稻紋枯病、小麥條銹病、白粉病、赤霉病、油菜核菌病、棉花枯萎病等。因此,防治植物病蟲害,對(duì)保障國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展、提高人民生活水平具有重大意義。隨著遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的日益發(fā)展，基因工程技術(shù)被越來越廣泛地應(yīng)用于農(nóng)作物品種的改良。

啟動(dòng)子是基因工程中構(gòu)建表達(dá)載體的重要組成部分,它可以控制外源基因表達(dá)的起始、表達(dá)部位與強(qiáng)度。目前,轉(zhuǎn)基因植物中所使用的啟動(dòng)子一般為組成型啟動(dòng)子,其驅(qū)動(dòng)外源基因在植物體內(nèi)持續(xù)大量地表達(dá),打破了植物原有的代謝平衡,增加了植株的代謝負(fù)擔(dān),造成了物質(zhì)和能量上的浪費(fèi),而且還可能影響食物的安全性[1-2]。而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子則可以較好地避免上述問題,比如水稻褐飛虱為害誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,當(dāng)褐飛虱刺吸水稻時(shí),啟動(dòng)子被誘導(dǎo)使相應(yīng)的基因高效表達(dá),進(jìn)而達(dá)到改良水稻相應(yīng)性狀的目的[3-4]。

1　材料與方法

1.1植物材料與菌種

用于提取DNA和RNA的秈稻品種‘TN1’和

‘RH’,轉(zhuǎn)化受體粳稻品種‘中花11’均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)徐才國(guó)教授提供;啟動(dòng)子的克隆載體為DX2181b,由本室葉榮建博士改造;用于構(gòu)建載體的大腸桿菌菌株為TOP10;轉(zhuǎn)化所用農(nóng)桿菌菌株為EHA105;兩種菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2啟動(dòng)子的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用本實(shí)驗(yàn)室水稻接種褐飛虱誘導(dǎo)的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù),挑選褐飛虱為害誘導(dǎo)表達(dá)基因。結(jié)合RiceXPro 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/),挑選出在‘TN1’和‘RH’品種中均受褐飛虱為害誘導(dǎo)表達(dá),且在胚乳中表達(dá)量極低的水稻基因LOC_Os01g73974。通過芯片的雜交信號(hào)值對(duì)其表達(dá)量的高低進(jìn)行一個(gè)粗略的估計(jì),預(yù)測(cè)此基因上游序列為褐飛虱誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子。設(shè)計(jì)引物BPHIP-F和BPHIP-R,并在引物的5′端引入Hind Ⅲ和PstI酶切位點(diǎn)(引物序列見表1)。利用‘TN1’的基因組DNA,對(duì)該基因翻譯起始位點(diǎn)上游約2 kb的啟動(dòng)子區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增,所獲得的啟動(dòng)子片段命名為BPHIP。PCR反應(yīng)體系為:100 ng/μL基因組DNA 1 μL,10×buffer 2 μL,2 mmol/L dNTPs 4 μL,10 μmol/L BPHIP-F 0.2 μL,10 μmol/L BPHIP-R 0.2 μL,5 U/μLTaqDNA 聚合酶 0.2 μL,ddH2O 12.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 2 min,30 個(gè)循環(huán);72℃ 延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用Hind Ⅲ和PstI酶切后,連接到植物表達(dá)載體DX2181b相應(yīng)的酶切位點(diǎn)之間獲得重組質(zhì)粒,命名為DX2181-BPHIP(圖1),測(cè)序驗(yàn)證。

當(dāng)主電源接入24 V時(shí)，高于23 V的標(biāo)準(zhǔn)工作電壓，此時(shí)E1使能，控制G1產(chǎn)生下拉電流，Q1導(dǎo)通，此時(shí)V1=Vs>V2，G2產(chǎn)生上拉電流，Q2、Q3截止，避免產(chǎn)生逆向電流；當(dāng)主電源接入電壓低于21 V時(shí)，E2使能，控制G2產(chǎn)生下拉電流，Q2、Q3導(dǎo)通，此時(shí)V2=Vs>V1，G1產(chǎn)生上拉電流，Q1截止，避免產(chǎn)生逆向電流.

圖1　終表達(dá)載體DX2181-BPHIP的T-DNA區(qū)域示意圖Fig.1　Schematic diagram of the T-DNA region of the final expression vector DX2181b-BPHIP

1.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

利用本實(shí)驗(yàn)室建立的水稻農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法[7],以粳稻品種‘中花11’成熟種子的胚誘導(dǎo)后產(chǎn)生的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體,用帶有表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105進(jìn)行侵染,侵染后用含有50 mg/L的潮霉素培養(yǎng)基篩選2次,每次2周,獲得抗性愈傷組織,經(jīng)分化、生根得到轉(zhuǎn)基因植株。

取轉(zhuǎn)基因植株幼苗葉片提取基因組DNA,以其作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè),擴(kuò)增報(bào)告基因GUS的部分片段(引物為GUS-F和GUS-R,序列見表1),預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為699 bp。

表1　本研究中所涉及的引物1)Table 1　PCR primers used in this study

1) 下畫線代表該引物所加酶切位點(diǎn)。

The underlined letters indicate the restriction enzyme site.

PCR反應(yīng)體系:100 ng/μL 模板1 μL,10×buffer 2 μL,2 mmol/L dNTPs 4 μL,10 μmol/L GUS-F 0.2 μL,10 μmol/L GUS-R 0.2 μL,ddH2O 12.4 μL,TaqDNA 聚合酶0.2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 1 min,28 個(gè)循環(huán);72℃ 延伸8 min。PCR擴(kuò)增呈陽性的植株保留,陰性植株去除。

1.4褐飛虱為害處理及JA處理

取不同水稻材料種子去殼,用1.5%升汞表面消毒后,在1/2 MS培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)約10 d。每個(gè)材料挑選6株長(zhǎng)勢(shì)健康且相近的水稻植株移栽,其中3株移栽一盆準(zhǔn)備進(jìn)行接蟲處理,另3株移栽一盆不做任何處理作為對(duì)照。移栽后待水稻幼苗長(zhǎng)至三葉一心階段,進(jìn)行褐飛虱接蟲處理。平均每株接種約10頭2齡褐飛虱若蟲,然后每盆均用紗網(wǎng)罩住防止若蟲逃逸。接蟲6 h或24 h后對(duì)地上部分進(jìn)行取樣,樣品用于GUS組織化學(xué)染色分析或RNA提取和定量PCR檢測(cè)。

茉莉酸(JA)處理的前期準(zhǔn)備同褐飛虱為害處理,只是水稻植株進(jìn)行水培液培養(yǎng)[8]。水培液加入JA (100 μmol/mL,Sigma-Aldrich)進(jìn)行培養(yǎng),且每隔2 h用含有相同濃度JA的水培液噴灑水稻葉片1次,共噴施3次。JA處理24 h后取水稻幼苗根部以上部分進(jìn)行分析,其中少量葉片和葉鞘樣品進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析,其余樣品用于RNA提取和定量PCR檢測(cè)。

1.5GUS組織染色

將葉片和葉鞘樣品剪成合適大小,浸沒于GUS染色液中,抽真空后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)染色過夜。隨后,用無水乙醇脫色2次,每次1 h,最后用75%乙醇脫色至葉片綠色脫盡,然后用萊卡解剖鏡觀察拍照。

1.6定量RT-PCR檢測(cè)

采用TriZol Reagent (Invitrogen)試劑盒提取總RNA。具體操作步驟參照試劑盒說明書。RNA反轉(zhuǎn)錄步驟簡(jiǎn)述如下,取2 μg 總RNA至Rnase-free 1.5 mL離心管中,加入1 μL DNase I,1 μL 10×緩沖液,加DEPC處理過的水至總體積10 μL,混勻后短暫離心,25℃(室溫)孵育15 min。加入1 μL 0.5 mol/L EDTA,混勻后短暫離心,65℃水浴10 min滅活DNase I。加入1 μL oligo d(T)18, dNTPs 1 μL,65℃水浴10 min,然后立即置冰上3 min,短暫離心。加入5×First strand buffer 4 μL,DTT 1 μL,反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 1 μL,RRI 1 μL混勻后短暫離心,于50℃水浴反應(yīng)2 h。75℃水浴滅活15 min。加水適當(dāng)稀釋反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用ABI7500 (Life TechnologiesTM)檢測(cè)系統(tǒng),使用試劑盒為FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche)。反應(yīng)體系:100 ng/μL cDNA 1 μL,Mixture 5 μL,10 μmol/L左右引物各0.2 μL(所有引物序列見表1),ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 10 min；95℃ 10 s,60℃ 36 s,40個(gè)循環(huán)。

2　結(jié)果與分析

2.1Os01g73940基因表達(dá)模式分析

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室李昌焱等的褐飛虱接蟲誘導(dǎo)全基因組表達(dá)芯片分析的數(shù)據(jù),不論是敏感品種‘TN1’還是高抗品種‘RH’,Os01g73940基因均受褐飛虱為害特異性誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),且在‘TN1’中上調(diào)表達(dá)的幅度高于‘RH’。此外,在未處理或用針刺模擬褐飛虱為害處理中,Os01g73940基因表達(dá)量無顯著變化,說明Os01g73940是一個(gè)褐飛虱為害誘導(dǎo)特異性表達(dá)的基因(圖2a)。為了驗(yàn)證基因芯片的數(shù)據(jù)是否可靠,我們利用定量RT-PCR方法對(duì)Os01g73940基因在褐飛虱為害條件下表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)。無論是‘TN1’還是‘RH’,褐飛虱接種6 h后,Os01g73940基因表達(dá)水平僅有輕微上升;褐飛虱接種24 h,Os01g73940基因表達(dá)水平顯著上升,其中‘TN1’中表達(dá)上調(diào)6倍以上,而在‘RH’中表達(dá)上調(diào)5倍以上(圖3)。定量RT-PCR分析結(jié)果與基因芯片分析結(jié)果基本一致,證明基因芯片分析的結(jié)果是可靠的。

圖2　Os01g73940基因在褐飛虱接種和JA處理下表達(dá)量的變化Fig.2　Expressional pattern of Os01g73940 gene under brown planthopper infection and JA treatment

圖3　定量RT-PCR驗(yàn)證Os01g73940基因在褐飛虱為害6 h和24 h后的表達(dá)模式Fig.3　Validation of the expression pattern of Os01g73940 gene 6 h and 24 h after brown planthopper infection by real-time RT-PCR

根據(jù)http:∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/下載的基因芯片數(shù)據(jù)分析,Os01g73940基因的表達(dá)還受植物激素JA的誘導(dǎo)(圖2b)。Os01g7390基因在JA處理0.5 h后就有輕微上調(diào)表達(dá),處理3 h后表達(dá)上調(diào)明顯,處理6 h后表達(dá)進(jìn)一步升高。根據(jù)http:∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/GGEP下載的全生育期各種組織器官基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)分析,Os01g73940基因的表達(dá)主要集中在葉片、葉鞘和莖稈等綠色組織中,而在根、花特別是胚乳中表達(dá)量很低(圖4)。

2.2啟動(dòng)子克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

以‘TN1’總DNA為模板,采用PCR的方法克隆出Os01g73940的上游長(zhǎng)度為1 953 bp的啟動(dòng)子區(qū)段,命名為BPHIP。將BPHIP啟動(dòng)子構(gòu)建于GUS報(bào)告基因上游,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法,將融合的GUS報(bào)告基因?qū)刖酒贩N‘中花11’中,獲得的轉(zhuǎn)基因植株通過PCR驗(yàn)證,共獲得31株T0陽性獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株。

2.3褐飛虱接種和JA處理24 h后GUS組織化學(xué)染色分析

T0代陽性植株的種子在含有潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上發(fā)芽,篩選陽性T1代植株3個(gè)家系進(jìn)行接褐飛虱及JA處理,24 h后進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析。以野生型‘中花11’作為陰性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)室先前轉(zhuǎn)化得到一個(gè)CaMV35S啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因構(gòu)建的融合基因的轉(zhuǎn)基因家系,該轉(zhuǎn)基因家系中GUS報(bào)告基因組成型表達(dá),作為本研究的陽性對(duì)照。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,啟動(dòng)子BPHIP在水稻苗期的葉片和葉鞘部分均有一定的本底表達(dá),在褐飛虱接種及JA處理24 h后GUS活性似乎有所上升,但無論褐飛虱接種或JA處理的前后,BPHIP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的活性顯著低于組成型的CaMV35S啟動(dòng)子(圖5)。

圖4　Os01g73940在水稻各組織的表達(dá)譜(根據(jù)http:∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/GGEP下載的數(shù)據(jù)制作)Fig.4　Expression profile of Os01g73940 in various rice tissues

圖5　GUS組織化學(xué)染色分析Fig.5　GUS histochemical staining analysis

2.4褐飛虱接種及JA處理后GUS基因表達(dá)量的定性分析

為了對(duì)BPHIP啟動(dòng)子的表達(dá)活性進(jìn)行定量分析,我們對(duì)經(jīng)過褐飛虱接種和JA處理24 h后,轉(zhuǎn)基因家系GUS基因的轉(zhuǎn)錄本用定量RT-PCR進(jìn)行了定量分析。由于處理褐飛虱接種和JA處理過程較為繁瑣,我們從31個(gè)獨(dú)立的陽性轉(zhuǎn)基因植株中隨機(jī)挑選3個(gè)轉(zhuǎn)基因植株家系作為代表進(jìn)行了檢測(cè)(圖6)。結(jié)果表明,褐飛虱接種及JA處理24 h后GUS基因的表達(dá)量均有上調(diào),與芯片數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致。褐飛虱接種24 h后3個(gè)轉(zhuǎn)基因家系GUS轉(zhuǎn)錄本平均上調(diào)2.78倍,最高上調(diào)倍數(shù)為4.38倍。與CaMV35S啟動(dòng)子相比較,在未處理的條件下,GUS基因平均表達(dá)水平是CaMV35S啟動(dòng)子的1/27;接蟲誘導(dǎo)24 h后平均表達(dá)水平可達(dá)CaMV35S啟動(dòng)子的1/7。JA激素處理24 h后比未處理24 h平均上調(diào)倍數(shù)為2.68倍,最高上調(diào)倍數(shù)為3.17倍。與CaMV35S啟動(dòng)子相比較,在未處理的條件下,GUS基因平均表達(dá)水平是CaMV35S啟動(dòng)子的1/30;JA處理24 h后平均表達(dá)水平可達(dá)CaMV35S啟動(dòng)子的1/7。

圖6　BPHIP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)量檢測(cè)Fig.6　Detection of the expression of GUS report gene derived by BPHIP promoter

3　討論

在李昌焱等的芯片數(shù)據(jù)中,我們發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個(gè)褐飛虱誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)基因,其中上調(diào)幅度最大的基因在褐飛虱接蟲誘導(dǎo)24 h后,表達(dá)上調(diào)可達(dá)90倍以上。但是,誘導(dǎo)上調(diào)幅度大的基因通常表達(dá)的本底水平低,即使經(jīng)過褐飛虱誘導(dǎo)后的基因表達(dá)水平仍然很低。部分這類基因的啟動(dòng)子克隆后,接GUS報(bào)告基因轉(zhuǎn)化水稻，即使褐飛虱為害誘導(dǎo)24 h后,在轉(zhuǎn)基因水稻中利用GUS組織化學(xué)染色甚至檢測(cè)不到明顯的GUS染色活性表達(dá)。此外,我們還發(fā)現(xiàn)一些褐飛虱誘導(dǎo)型基因僅在特定基因型如抗性品種中,才有基因誘導(dǎo)表達(dá)效應(yīng)。我們將一些這類基因的啟動(dòng)子克隆后,與GUS基因融合導(dǎo)入褐飛虱敏感水稻品種‘中花11’中,發(fā)現(xiàn)這些啟動(dòng)子在敏感品種中誘導(dǎo)表達(dá)效果遠(yuǎn)不如原始基因那么強(qiáng),甚至沒有明顯的誘導(dǎo)表達(dá)效果,說明這樣的啟動(dòng)子的誘導(dǎo)依賴特異性的基因組背景,而不具有普遍適用性。

雖然,Os01g73940基因受褐飛虱為害誘導(dǎo)的上調(diào)表達(dá)的幅度并不是很大(5～6倍),但無論是褐飛虱敏感品種背景還是褐飛虱抗性品種背景,該基因均可受褐飛虱為害誘導(dǎo),說明該基因啟動(dòng)子的誘導(dǎo)效果不受水稻品種基因型的限制,具有普遍性。此外,根據(jù)表達(dá)芯片數(shù)據(jù)預(yù)測(cè),Os01g73940的啟動(dòng)子具有一定的組織特異性,表達(dá)主要集中在莖葉等綠色組織,而在水稻害蟲不直接為害的花和種子中基本沒有表達(dá)。因此BPHIP啟動(dòng)子是一個(gè)誘導(dǎo)型兼組織特異性啟動(dòng)子。在NCBI網(wǎng)站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)上檢索Os01g73940基因的同源蛋白,幾乎沒有相關(guān)研究,其基因功能未知。該基因推測(cè)的蛋白產(chǎn)物分子量較小,據(jù)預(yù)測(cè)可能是信號(hào)受體或膜蛋白。

本研究所得到的BPHIP啟動(dòng)子不僅受到褐飛虱為害誘導(dǎo),還受JA處理誘導(dǎo)。據(jù)報(bào)道,昆蟲接觸植物后首先給植物造成不同程度的機(jī)械損傷,引起植物體內(nèi)JA和過氧化氫等信號(hào)分子積累水平的改變并激活防御反應(yīng)化合物如蛋白酶抑制基因的表達(dá)[9-10]。此外，不同口器類型(如咀嚼式或刺吸式)的昆蟲對(duì)激活植物體內(nèi)的防御信號(hào)也不同[11]。表明JA信號(hào)途徑廣泛參與植物應(yīng)答蟲害的抗性反應(yīng),已經(jīng)鑒定出水稻中OsERF是可以通過調(diào)控JA的合成來調(diào)節(jié)植物應(yīng)對(duì)蟲害的免疫反應(yīng)[12]。褐飛虱取食水稻后,體內(nèi)激素信號(hào)會(huì)相應(yīng)改變,從而引起一些基因表達(dá)模式的相應(yīng)變化。因此，對(duì)于某些基因來說,褐飛虱取食和激素處理都可能會(huì)引起其表達(dá)量的改變。

本文所得到的啟動(dòng)子BPHIP是一個(gè)新的褐飛虱誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子,水稻的葉片和葉鞘又是許多病蟲害發(fā)生部位,該啟動(dòng)子經(jīng)過優(yōu)化改造后,非常有望應(yīng)用于抗蟲或抗病水稻的研究中。后續(xù)將此啟動(dòng)子進(jìn)行缺失分析,進(jìn)而鑒定其核心功能元件的大致范圍,還需通過凝膠阻滯試驗(yàn)等鑒定方法,找出該啟動(dòng)子中與褐飛虱誘導(dǎo)相關(guān)的順式作用元件,分析其在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的分子作用機(jī)理,使其能夠在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上得以有效利用。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Cloning of a brown planthopper (Nilaparavatalugens) infection inducible promoter in rice

Guan Limei1,2,Ma Weihua1,Lin Yongjun1,Chen Hao1

(1.National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University,Wuhan430070, China； 2.Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang330029, China)

The constitutive promoters are widely applied in plant genetic engineering. However, it may cause growth retardation and other adverse effects due to the constant expression of exogenous genes in transgenic plants. The inducible promoters can control the expression of target genes more economically and minimize the possible harms to transgenic plants due to the accumulation of non-essential proteins. Based on the analysis of DNA microarray and quantitative RT-PCR, we found the expression of a rice gene (LOC_Os01g73940) could be induced by brown planthopper infection. The 1 953 bp upstream region ofOs01g73940 gene was isolated from the indica rice variety ‘TN1’ by PCR, which was referred to as brown planthopper induced promoter (BPHIP). BPHIP was ligated with aβ-glucuronidase(GUS) report gene to construct a fusion gene, and then transformed into a japonica rice variety ‘Zhonghua 11’. The results of GUS histochemical staining and quantitative RT-PCR confirmed that BPHIP is a promoter induced by brown planthopper infection and jasmonic acid treatment. This inducible promoter may mitigate the possible adverse effects of constitutive promoters in genetic engineering and has enormous application potential in insect-resistant transgenic breeding.

Oryzasativa;inducible promoter;Nilaparavatalugens;insect-resistance;genetic engineering

2014-11-23

2015-01-07

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX0810-002)

E-mail:chenhaoxy2003@126.com

S 435.112.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.004