長(zhǎng)期施藥果園中的蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇和甲基硫菌靈的敏感性

安久棟,　國(guó)立耘,　朱小瓊,　宋月鳳

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 北京　100193)

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長(zhǎng)期施藥果園中的蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇和甲基硫菌靈的敏感性

安久棟,國(guó)立耘*,朱小瓊,宋月鳳

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 北京100193)

為了監(jiān)測(cè)果園中蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇和甲基硫菌靈敏感水平的變化,采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了采集自山東煙臺(tái)地區(qū)和北京市昌平區(qū)，有較長(zhǎng)施藥史蘋(píng)果園中的蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇和甲基硫菌靈的敏感性。結(jié)果表明:戊唑醇對(duì)連續(xù)施用戊唑醇5年、每年施藥1～2次的果園中蘋(píng)果輪紋病菌的EC50為0.017 4～0.114 3 μg/mL,即該類(lèi)果園中蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)此藥的敏感性仍然保持在較高水平,與野生菌株的敏感性非常接近,沒(méi)有出現(xiàn)敏感性分化的抗藥亞群體;甲基硫菌靈對(duì)連續(xù)施用甲基硫菌靈10年、每年施藥2次的果園中蘋(píng)果輪紋病菌的EC50為0.846 4～4.677 4 μg/mL,果園中蘋(píng)果輪紋病菌與野生菌株相比EC50平均值約上升3.15倍,最低值和最高值分別是已報(bào)道敏感性基線的1.19倍和6.59倍,沒(méi)有出現(xiàn)敏感性發(fā)生顯著分化的抗藥性亞群體。

蘋(píng)果輪紋病菌;戊唑醇;甲基硫菌靈;敏感性

蘋(píng)果輪紋病分布廣泛,在我國(guó)各蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,且有逐年加重的趨勢(shì)[1]。該病是由Botryosphaeriadothidea引起的真菌病害[2],主要危害果實(shí)和枝干,在果實(shí)貯藏期仍可致病,不僅造成樹(shù)勢(shì)衰弱、枝干枯死,而且造成大量爛果[3],是制約蘋(píng)果產(chǎn)量和品質(zhì)的最為重要的病害之一。

目前,化學(xué)防治仍是治理蘋(píng)果輪紋病的主要措施,其中戊唑醇和甲基硫菌靈是主要推廣使用的藥劑。戊唑醇通過(guò)抑制麥角甾醇的生物合成而干擾真菌細(xì)胞膜的形成[4],具有廣譜、內(nèi)吸等特點(diǎn),對(duì)蘋(píng)果輪紋病具有良好的防治效果[5]。該藥自20世紀(jì)90年代中期開(kāi)始在中國(guó)蘋(píng)果樹(shù)上登記使用,由于當(dāng)時(shí)戊唑醇原藥和制劑價(jià)格偏高,登記后的十幾年中在蘋(píng)果生產(chǎn)中沒(méi)有得到廣泛的推廣應(yīng)用。進(jìn)入21世紀(jì)后,戊唑醇首先在山東東部蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)迅速推廣應(yīng)用[6],室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估認(rèn)為蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的室內(nèi)抗藥性具有高度至中等風(fēng)險(xiǎn)[7],因此對(duì)田間病菌敏感性進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測(cè)十分重要。

以甲基硫菌靈為代表的苯并咪唑類(lèi)藥劑也是防治蘋(píng)果輪紋病的高效內(nèi)吸性殺菌劑。該藥被植物體吸收后,經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)最終被分解為多菌靈[8],多菌靈可以特異性地與病原真菌的β-微管蛋白結(jié)合,干擾微管裝配,進(jìn)而影響有絲分裂中紡錘體的形成,使病原菌孢子萌發(fā)長(zhǎng)出的芽管發(fā)生扭曲,從而使病菌不能正常進(jìn)行有絲分裂而達(dá)到殺菌的效果[9]。室內(nèi)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估認(rèn)為甲基硫菌靈具有高抗藥風(fēng)險(xiǎn)性[10],國(guó)內(nèi)外已有研究表明許多病原菌對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生了抗性[9,11]。在我國(guó)各蘋(píng)果產(chǎn)區(qū),甲基硫菌靈的推廣較早且具有較高的施用率。但是未開(kāi)展蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)該藥敏感性水平監(jiān)測(cè)。

綜上所述,戊唑醇和甲基硫菌靈是防治蘋(píng)果輪紋病的主要藥劑,在我國(guó)蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)已推廣使用多年,病原菌在這兩種藥劑持續(xù)的選擇壓力下有可能產(chǎn)生抗藥性菌株。因此,及時(shí)進(jìn)行病原菌敏感性的監(jiān)測(cè),對(duì)于保證防治效果是十分重要的。本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法,分別測(cè)定了果園中的蘋(píng)果輪紋病病原菌對(duì)戊唑醇和甲基硫菌靈的敏感性。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株:69株蘋(píng)果輪紋病菌菌株采集于山東煙臺(tái)地區(qū),其中煙臺(tái)福山區(qū)25株,煙臺(tái)蓬萊市23株,煙臺(tái)海陽(yáng)市21株，果園每年施用戊唑醇1～2次,連續(xù)施用5年;34株采集于北京昌平區(qū),果園每年施用甲基硫菌靈2次,連續(xù)施用10年。所有菌株均經(jīng)過(guò)組織分離、單菌絲純化,鑒定為Botryosphaeriadothidea。

供試藥劑為96.7%戊唑醇原藥(江蘇劍牌農(nóng)藥化工有限公司),98.6%甲基硫菌靈原藥(陜西美邦農(nóng)藥有限公司)。

1.2方法

1.2.1含藥培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱(chēng)取0.1 g戊唑醇原藥,溶于約9 mL異丙醇(99.7%),用10 mL容量瓶定容,配成濃度為104μg/mL的母液,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。制備含藥培養(yǎng)基時(shí),用異丙醇按一定比例將母液稀釋到所需的質(zhì)量濃度,加入培養(yǎng)基千分之一體積的稀釋液[12],得到如下終濃度的含藥PDA平板:0、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 μg/mL,對(duì)照培養(yǎng)基加入等量異丙醇。

用電子天平稱(chēng)取0.1 g甲基硫菌靈原藥,溶于約9 mL丙酮(99.5%),用10 mL容量瓶定容,配成濃度為 104μg/mL的母液,于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｖ苽浜幣囵B(yǎng)基時(shí),用丙酮按一定比例稀釋母液到所需的質(zhì)量濃度,加入培養(yǎng)基千分之一體積的稀釋液,得到如下終濃度的含藥PDA平板:0、0.1、0.25、0.5、1、2、4 μg/mL,對(duì)照培養(yǎng)基加入等量丙酮。

1.2.2菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定供試藥劑對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌的EC50

將供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d左右,用直徑5 mm打孔器在菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅,用接種針挑取菌餅菌絲面朝下接種于各個(gè)濃度平板的中央,26℃黑暗培養(yǎng),每個(gè)處理3次重復(fù)。3 d后,用十字交叉法測(cè)量各個(gè)平板的菌落直徑,計(jì)算平均菌落直徑,按下列公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率:

抑菌率(%)=

通過(guò)Excel軟件進(jìn)行藥劑濃度對(duì)數(shù)值和菌絲生長(zhǎng)抑制率幾率值之間的線性回歸分析,將菌絲生長(zhǎng)抑制率轉(zhuǎn)化為幾率值,藥劑濃度轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值,以X(藥劑濃度的對(duì)數(shù)值)和Y(抑制率幾率值)做線性回歸分析得到回歸方程Y=a+bX,當(dāng)Y=5 時(shí),求出X的反對(duì)數(shù)[5]即為供試藥劑對(duì)各供試蘋(píng)果輪紋病菌菌株的EC50。

1.2.3不同甲基硫菌靈敏感性菌株的β-tubulin基因序列分析

采用OligoCalc(Oligonucleotide Properties Calculator, http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)設(shè)計(jì)擴(kuò)增蘋(píng)果輪紋病菌β-tubulin基因的特異性引物TubF：5′-GTCAGGAGTCGCAGTCAGTAATTAG-3′和TubR：5′-CTTCATTTTGTCGCATGTCTGGCTC-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為2.1 kb。選擇5株對(duì)甲基硫菌靈敏感性不同的蘋(píng)果輪紋病菌菌株,在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～6 d,收集菌絲,用試劑盒SP Fungal DNA Kit提取DNA,用引物TubF/TubR擴(kuò)增β-tubulin基因。PCR反應(yīng)總體積為50 μL：10×LA PCR buffer(Mg2+Plus)5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL,TubF/TubR(20 μmol/L)各1 μL,LATaqDNA聚合酶(1.5 U/μL,TaKaRa)0.5 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性9 min；94℃變性1 min,61℃退火1 min,72℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠、0.5×TBE中電泳30 min,電壓為100 V,然后用溴化乙錠染色,并用凝膠成像儀觀察、拍照。

電泳檢測(cè)后的PCR產(chǎn)物交由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司用正反向引物進(jìn)行序列測(cè)定。用ClustalW 1.82軟件(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)對(duì)所測(cè)序列與從NCBI上下載的β-tubulin基因序列進(jìn)行比對(duì),根據(jù)NCBI上登錄的β-tubulin基因相關(guān)序列的編碼區(qū),截取所測(cè)序列的編碼區(qū),用EMBOSS軟件(http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq)將DNA序列翻譯為蛋白質(zhì)序列,用ClustalW 1.82軟件比較不同敏感性的蘋(píng)果輪紋病菌菌株β-tubulin基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)序列,確定是否有氨基酸突變。

2　結(jié)果與分析

2.1蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了從山東煙臺(tái)地區(qū)施用戊唑醇5年的果園中采集的69株蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性。結(jié)果表明戊唑醇對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,EC50為0.017 4～0.114 3 μg/mL,最高值約是最低值的6.57倍,EC50平均值為(0.057 8±0.018 3)μg/mL(表1)。根據(jù) EC50極差R=Xmax-Xmin=0.114 3-0.017 4=0.096 9 μg/mL,將EC50數(shù)據(jù)分成6組,EC50的頻數(shù)分布見(jiàn)圖1。戊唑醇對(duì)69株蘋(píng)果輪紋病菌菌株EC50的頻數(shù)分布呈現(xiàn)單峰曲線,符合正態(tài)分布,表明蘋(píng)果輪紋病菌菌株對(duì)戊唑醇的敏感性沒(méi)有產(chǎn)生分化,未出現(xiàn)敏感性下降的抗藥性亞群體(圖1)。王英姿等[6]采集山東地區(qū)未施用過(guò)戊唑醇的野生輪紋病菌菌株建立的敏感性基線為(0.111 5±0.048 5)μg/mL,相比可知,煙臺(tái)地區(qū)施用戊唑醇5年果園中的蘋(píng)果輪紋病菌的EC50平均值是已報(bào)道敏感性基線的0.52倍,最低值和最高值分別是已報(bào)道敏感性基線的0.16倍和1.03倍。

表1　山東省煙臺(tái)地區(qū)蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性Table 1　Susceptibility of Botryosphaeria dothidea from Yantai, Shandong Province to tebuconazole

圖1　戊唑醇對(duì)山東煙臺(tái)地區(qū)蘋(píng)果輪紋病菌的 EC50頻數(shù)分布Fig.1　Frequency distribution of EC50 values of tebuconazole against isolates of Botryosphaeria dothidea from Yantai, Shandong Province

2.2蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了來(lái)自北京市昌平區(qū)的34株蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性。結(jié)果顯示,隨著甲基硫菌靈濃度升高,對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。EC50為0.846 4～4.677 4 μg/mL,最高值約是最低值的5.53倍,EC50平均值是(2.235 6±0.857 5)μg/mL(圖2,表2)。根據(jù)EC50極差R=Xmax-Xmin=4.677 4-0.846 4=3.831 μg/mL,將EC50數(shù)據(jù)分成8組,EC50的頻數(shù)分布見(jiàn)圖2。有94.12%的菌株集中于主峰范圍內(nèi),58.8%的供試菌株的EC50小于平均值。楊煒華等[11]采集山東泰安的野生輪紋病菌菌株建立的敏感性基線為0.710 2 μg/mL,相比可知,采集于北京昌平區(qū)施用甲基硫菌靈10年果園中的蘋(píng)果輪紋病菌的EC50平均值是已報(bào)道敏感性基線的3.15倍,最低值和最高值分別是已報(bào)道敏感性基線的1.19倍和6.59倍。

圖2　甲基硫菌靈對(duì)北京市昌平區(qū)蘋(píng)果輪紋病菌的 EC50頻數(shù)分布Fig.2　Frequency distribution of thiophanate-methyl EC50values against isolates of Botryosphaeria dothidea from Changping District, Beijing

菌株Isolate回歸方程Regressionequation相關(guān)系數(shù)CorrelationcoefficientEC50/μg·mL-1SB2-3y=2.6979x+4.29580.99051.8256LC4-2y=3.5272x+2.63750.97314.6774SB0-5y=1.9901x+4.38490.99702.0394SA0-2y=1.0625x+4.85630.94761.3665LB3-1y=2.3639x+5.17120.89270.8464

2.3β-tubulin基因序列分析結(jié)果

選擇對(duì)甲基硫菌靈敏感性不同的5株菌SB2-3、LC4-2、SB0-5、SA0-2和LB3-1,用TubF和TubR均擴(kuò)增出2.1 kb的DNA片段。測(cè)序后去掉內(nèi)含子,將序列重新拼接并進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)不同敏感性菌株β-tubulin基因序列存在堿基的差異,菌株SA0-2第183位、第291位、第597位、第696位堿基對(duì)發(fā)生突變(圖3);將不同敏感性菌株的β-tubulin基因序列翻譯為蛋白序列,并進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)氨基酸序列完全相同,均沒(méi)有發(fā)生變化(圖4),說(shuō)明對(duì)甲基硫菌靈敏感性不同的蘋(píng)果輪紋病菌β-微管蛋白基因未出現(xiàn)引起β-微管蛋白氨基酸序列發(fā)生變化的突變。

圖3　北京市昌平區(qū)對(duì)甲基硫菌靈不同敏感性的蘋(píng)果輪紋病菌β-微管蛋白基因序列比對(duì)結(jié)果Fig.3　Alignment of β-tubulin gene of Botryosphaeria dothidea from Changping District, Beijing with different susceptibility to thiophanate-methyl

圖4　北京市昌平區(qū)對(duì)甲基硫菌靈不同敏感性的蘋(píng)果輪紋病菌β-微管蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.4　Alignment of β-tubulin amino acid sequences of Botryosphaeria dothidea from Changping District, Beijing with different sensibility to thiophanate-methyl

3　討論

戊唑醇為新一代三唑類(lèi)殺菌劑,具有高效、廣譜、內(nèi)吸、低毒等特性,對(duì)大田作物、果樹(shù)、蔬菜和重要的經(jīng)濟(jì)作物上由子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌引起的重要病害具有極好的治療和鏟除作用,且用量低[13]。戊唑醇結(jié)構(gòu)上與其他三唑類(lèi)殺菌劑相似,但在安全性、使用范圍等方面有所提高[14]。21世紀(jì)后該藥在山東東部蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)迅速推廣使用,給該地區(qū)的蘋(píng)果輪紋病菌造成更大的選擇壓力。王英姿等[6]的試驗(yàn)結(jié)果表明,來(lái)自山東不同區(qū)域的蘋(píng)果輪紋病菌大多數(shù)仍對(duì)戊唑醇表現(xiàn)較高的敏感性,15.49%的菌株對(duì)戊唑醇產(chǎn)生了2～5倍低水平抗藥性,且抗性菌株集中在山東東部地區(qū),表明戊唑醇防治蘋(píng)果輪紋病具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性。蘇平等[5]檢測(cè)了山東、河南和遼寧蘋(píng)果種植區(qū)的蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性,結(jié)果表明蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性呈單峰分布,未出現(xiàn)敏感性分化的亞群體,其中山東地區(qū)的蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇敏感性最低,遼寧地區(qū)的蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇敏感性最高,但不同地理來(lái)源的蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性差異不顯著。

目前,蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇的敏感性檢測(cè)采用的供試菌株大多針對(duì)性不強(qiáng),不能體現(xiàn)出戊唑醇田間施用史對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌敏感性的影響。本研究采集山東煙臺(tái)地區(qū)蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)連續(xù)施用戊唑醇5年以上,每年施用1～2次,且未施用過(guò)其他三唑類(lèi)殺菌劑的果園中的蘋(píng)果輪紋病菌測(cè)定其對(duì)戊唑醇的敏感性,發(fā)現(xiàn)所有蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)戊唑醇均保持較高敏感性,與之前報(bào)道的敏感性基線非常接近,未出現(xiàn)抗藥性分化的亞群體。

甲基硫菌靈在我國(guó)登記較早,目前在各大蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)應(yīng)用普遍,是蘋(píng)果輪紋病化學(xué)防治中應(yīng)用最廣泛、最重要的藥劑之一。楊煒華等[11]對(duì)我國(guó)重要蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)的蘋(píng)果輪紋病菌進(jìn)行了抗藥性檢測(cè),結(jié)果表明,我國(guó)重要蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)對(duì)多菌靈的抗性菌株已普遍存在,表現(xiàn)為中低水平抗藥性;對(duì)甲基硫菌靈存在低水平抗藥性菌株。李曉軍等[15]測(cè)定了山東主要蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)多菌靈的敏感性,發(fā)現(xiàn)多菌靈對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌菌株的EC50呈單峰頻次分布,沒(méi)有出現(xiàn)敏感性分化的亞群體。馬志強(qiáng)等[16]通過(guò)檢測(cè)河北保定地區(qū)蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)多菌靈的敏感性,發(fā)現(xiàn)供試菌株對(duì)多菌靈的敏感性均已產(chǎn)生不同程度的分化。不同地理和施藥史來(lái)源的蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)多菌靈的敏感性不同。由于甲基硫菌靈主要通過(guò)轉(zhuǎn)化為多菌靈對(duì)病害起到防治作用,因此兩種藥劑之間存在交互抗性[8]。本研究檢測(cè)了北京市昌平區(qū)連續(xù)施用甲基硫菌靈10年,每年施用2次的蘋(píng)果園中的蘋(píng)果輪紋病菌對(duì)甲基硫菌靈的敏感性并與之前報(bào)道的敏感性基線相比[11],沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的抗性群體,對(duì)不同敏感性的蘋(píng)果輪紋病菌β-微管蛋白基因序列的測(cè)定,也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)位點(diǎn)氨基酸序列的變化,進(jìn)一步證實(shí)了病原菌在分子水平上沒(méi)有發(fā)生抗藥性突變。綜上結(jié)果表明,按照每年施用2次的頻率,這兩種藥劑是可以長(zhǎng)期用于蘋(píng)果輪紋病的防治。建議生產(chǎn)中將戊唑醇與苯并咪唑類(lèi)殺菌劑交替使用,增強(qiáng)防治效果,延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生,提高殺菌劑的使用壽命。甲基硫菌靈仍然可以用于蘋(píng)果輪紋病的防治。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Susceptibility ofBotryosphaeriadothideato tebuconazole and thiophanate-methyl

An Jiudong,Guo Liyun,Zhu Xiaoqiong,Song Yuefeng

(College of Plant Protection, China Agricultural University, Beijing 100193, China)

In order to monitor the susceptibility ofBotryosphaeriadothideato tebuconazole and thiophanate-methyl in orchards with long history of using these two fungicides, the susceptibility ofB.dothideaisolates collected from represented orchards to these two fungicides was determined based on mycelium growth rate. The results showed that the EC50values of tebuconazole against 69 isolates collected from Yantai,Shandong Province with application of tebuconazole for 1-2 times each year for 5 years ranged from 0.017 4 to 0.114 3 μg/mL with no appeared resistant sub-populations. The EC50values of thiophanate-methyl against 34 isolates collected from Changping District, Beijing with application of thiophanate-methyl for 2 times each year for 10 years ranged from 0.846 4 to 4.677 4 μg/mL with no appeared resistant sub-populations. The maximum and minimum values were 1.19 and 6.59 times of the reported susceptible baseline, respectively.

Botryosphaeriadothidea;tebuconazole;thiophanate-methyl;susceptibility

2015-01-08

2015-06-08

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-28)

E-mail: ppguo@cau.edu.cn

S 436.611

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.034