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    除硫菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)條件研究與應(yīng)用

    2021-03-08 06:49:40孟章進(jìn)姜桂英錢志鴻王志明
    復(fù)雜油氣藏 2021年4期
    關(guān)鍵詞:硫菌氮源菌體

    楊 帆,孟章進(jìn),姜桂英,錢志鴻,王志明

    (1.中國(guó)石化江蘇油田分公司工程技術(shù)研究院,江蘇 揚(yáng)州,225009;2:江蘇省油氣微生物工程研究中心,江蘇 揚(yáng)州,225009)

    微生物人工培養(yǎng)和自然條件下的生理特性有很大的不同,影響合成代謝產(chǎn)物能力的因素也有相當(dāng)大的差異,其中培養(yǎng)基對(duì)微生物的各種代謝活動(dòng)的影響最為顯著[1-2],培養(yǎng)基的成分對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離及產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要影響,除此之外,溫度、pH 值、裝液量等操作條件也是影響微生物生長(zhǎng)的因素[3-4]。因此,微生物培養(yǎng)條件的優(yōu)化非常重要。N411 是一株高溫除硫菌,為提高該菌的培養(yǎng)效能,提高發(fā)酵水平,從溫度、pH 值、搖瓶裝液量3 個(gè)因素著手,開展了工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件研究。

    1 材料與方法

    1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

    按照表1 的組成成分設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基,比較不同配方條件下N411菌株的生長(zhǎng)增殖情況,以確定合適發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基。

    表1 發(fā)酵配方設(shè)計(jì) g

    1.2 檢測(cè)方法

    比濁法:取一定量搖瓶液,稀釋不同倍數(shù)后,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為600 nm 的吸收值(OD600)。

    平板菌落計(jì)數(shù)法:取搖瓶液1 mL,分別稀釋至10~5、10~6、10~8倍(由預(yù)試驗(yàn)得出),取0.1 mL的稀釋菌液涂布于固體培養(yǎng)基平板上,培養(yǎng)1 d 后,計(jì)算搖瓶液中的活菌數(shù)。

    細(xì)菌數(shù)(CFU/mL)=平板上菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/平板上加菌液的量(mL)。

    pH 檢測(cè):定期取樣,以4.0~9.0 精密pH 試紙檢測(cè)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 除硫菌的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

    2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源篩選

    以XSN 為基本氮源,保持質(zhì)量濃度10 g/L 和其他基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分配比不變,分別設(shè)置2 g/L PTT、3 g/L YMF、1 g/L PTT +1.5 g/L YMF 作為不同碳源處理,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基最終pH 為7.0,50℃培養(yǎng)并觀察菌體生長(zhǎng)情況,明確不同碳源條件下除硫菌N411 的增殖影響。

    以YMF 作為多糖部分或全部替代PTT 測(cè)定除硫菌N411 對(duì)多糖的分解利用能力(圖1)。試驗(yàn)結(jié)果表明,2 g/L PTT 作為碳源培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)較好,50℃培養(yǎng)16 h后菌體達(dá)最大濃度,1 g/L PTT+3 g/L YMF 的細(xì)菌繁殖量明顯低于20 g/L PTT 處理。以5 g/L YMF 替代PTT 的培養(yǎng)基中除硫菌N411繁殖速度慢,12 h 達(dá)最大高峰期,表明除硫菌N411 能有效利用PTT等單糖作為碳源,而對(duì)DF為碳源的多糖降解利用能力較弱,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),菌體增殖能力與培養(yǎng)基PTT濃度成正相關(guān)。

    圖1 不同碳源培養(yǎng)基對(duì)除硫菌N411發(fā)酵培養(yǎng)的影響

    2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源篩選

    以PTT 為基本碳源,保持質(zhì)量濃度2 g/L 和其他基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分配比不變,分別設(shè)置4 g/L XSN、6 g/L 豆餅粉、2 g/L XSN+3 g/L 豆餅粉等不同氮源處理,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基最終pH 為7.0,50℃培養(yǎng)并觀察菌體生長(zhǎng)情況,明確不同氮源條件下除硫菌N411 的增殖影響(圖2)。

    圖2 不同氮源培養(yǎng)基對(duì)除硫菌N411發(fā)酵培養(yǎng)的影響

    在以2 g/L PTT 為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,以豆餅粉作為氮源部分或全部替代無機(jī)氮NaNO3,測(cè)定除硫菌N411 對(duì)有機(jī)氮的利用能力。試驗(yàn)結(jié)果表明,4 g/L XSN作為氮源培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)較好,50℃培養(yǎng)16 h 后菌體達(dá)最大濃度。2 g/L XSN+3 g/L 豆餅粉的處理中,細(xì)菌繁殖量明顯低于4 g/L XSN的氮源處理,且培養(yǎng)16 h 后菌體自溶,濁度下降。以6 g/L豆餅粉替代XSN作為氮源的培養(yǎng)基中,除硫菌N411幾乎不能繁殖生長(zhǎng),表明除硫菌N411 能有效利用XSN 等無機(jī)氮作為氮源,而對(duì)蛋白質(zhì)為主要成分的豆餅粉作為有機(jī)氮源幾乎不能利用。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),菌體繁殖生長(zhǎng)與XSN濃度成正相關(guān)。

    2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

    在明確除硫菌N411 適宜碳源、氮源基礎(chǔ)上,通過調(diào)整培養(yǎng)基中碳、氮比例對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化(見表1)。

    培養(yǎng)基各組成成分的變化直接影響了除硫菌N411 的菌體生長(zhǎng)?;A(chǔ)培養(yǎng)基以PTT、XSN 為基本碳、氮源,能提供菌體發(fā)酵培養(yǎng)的一般需求,但發(fā)酵周期短,生長(zhǎng)不整齊,16 h達(dá)最大OD600值,鏡檢呈現(xiàn)芽孢、孕孢及營(yíng)養(yǎng)體多種菌體形態(tài)。通過對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方調(diào)整試驗(yàn)表明,XSN 和PTT 是影響除硫菌發(fā)酵培養(yǎng)的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)因子,其含量和比例直接影響了菌體的發(fā)酵水平和發(fā)酵周期。在試驗(yàn)范圍內(nèi),菌體生長(zhǎng)量與XSN 含量成顯著正相關(guān),同時(shí)PTT 含量也顯著影響除硫菌的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明配方1、配方2 都能獲得較高菌數(shù)的發(fā)酵培養(yǎng)液,培養(yǎng)44 h平板測(cè)定單位活菌數(shù)分別達(dá)6.6×107CFU/mL和2.1×107CFU/mL,可以在此范圍內(nèi)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基以提高除硫菌N411的發(fā)酵水平。

    圖3 除硫菌N411在不同組成培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖動(dòng)態(tài)

    2.2 除硫菌的發(fā)酵培養(yǎng)控制條件研究

    2.2.1 不同溫度條件對(duì)除硫菌生長(zhǎng)發(fā)育的影響

    不同溫度條件試驗(yàn)結(jié)果表明,除硫菌N411 的生長(zhǎng)對(duì)溫度具有較高的要求,以50~60℃為宜。試驗(yàn)在40℃條件下培養(yǎng)24 h,孢子幾乎不萌發(fā)。在60℃條件下培養(yǎng)孢子萌發(fā)率最高,平均達(dá)236 CFU/皿,隨溫度的提高,孢子萌發(fā)率有所下降(圖4)。從菌落生長(zhǎng)速度來看,萌芽的菌體隨溫度的升高生長(zhǎng)速度加快,以60℃溫度培養(yǎng)單菌落最多,說明60℃更適合菌體生長(zhǎng)(圖5)。

    圖4 不同溫度對(duì)除硫菌的孢子萌發(fā)的影響

    圖5 不同溫度對(duì)除硫的菌落生長(zhǎng)影響

    2.2.2 不同pH值對(duì)除硫菌孢子萌發(fā)的影響

    將培養(yǎng)基以1 mol/L HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)pH 值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0 等不同酸堿度,按照方法接入1 mL 稀釋的孢子懸浮液,置于60℃生化培養(yǎng)箱中觀察培養(yǎng),24 h 檢查培養(yǎng)基平板表面形成的菌落數(shù),明確不同pH 條件對(duì)除硫菌N411孢子萌發(fā)的影響。

    不同pH條件顯著影響除硫菌N411的孢子萌發(fā)(F=46.861,P=0.000)。pH 為4.0 的酸性條件下,孢子萌發(fā)受到顯著抑制,培養(yǎng)24 h 幾乎不萌發(fā)。在酸性條件下隨著pH 值的升高,孢子萌發(fā)率逐步提高,pH 值中性(pH 7.0)條件下達(dá)最大值,單位菌落數(shù)達(dá)237 個(gè)。堿性條件同樣抑制芽孢的萌發(fā),pH 值大于8.0 以上孢子60℃培養(yǎng)24 h 幾乎不萌發(fā)。說明除硫菌適合在中性條件下生長(zhǎng)(圖6)。

    圖6 培養(yǎng)基不同pH值對(duì)除硫菌芽孢萌發(fā)的影響

    2.2.3 不同裝液量對(duì)除硫菌生長(zhǎng)狀況的影響

    在50 mL 的滅菌的培養(yǎng)基中加入1 mL 除硫菌孢子懸浮液并充分搖勻。分別取4 mL、8 mL、12 mL加入15 mL 的指形管中,每處理重復(fù)6 次。以硅膠塞封口后,置于60℃、230 r/min 的搖床上震蕩培養(yǎng)。間隔4 h 分別取出不用裝液量的試管1 支,測(cè)定OD600值、pH值,并顯微鏡染色觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況。

    不同裝液量直接影響了培養(yǎng)基中的溶氧濃度,進(jìn)而影響好氧微生物的生長(zhǎng)。裝液少,液體與空氣接觸面積大,溶氧量增加,反之則溶氧量減少。試驗(yàn)結(jié)果表明,除硫菌N411 在不同溶氧條件下都能繁殖生長(zhǎng),但溶氧量的大小影響到菌體的生長(zhǎng)速度,充足的溶氧量有利于芽孢的形成。4 mL/管裝液量生長(zhǎng)發(fā)育速度快,整齊度高,12 h 達(dá)菌體最高濃度,OD600值達(dá)0.281,伴隨著芽孢形成,pH 逐漸上升,24 h 大部分芽孢脫落完成生長(zhǎng)周期。隨裝液量的增加,菌體生長(zhǎng)速度減緩,發(fā)育進(jìn)度加長(zhǎng),12 mL/管裝液量24 h菌體形態(tài)仍處于營(yíng)養(yǎng)體階段,pH值為7.0,未見芽孢形成(表2)。

    表2 不同裝液量搖菌試驗(yàn)對(duì)除硫菌N411菌體生長(zhǎng)發(fā)育的影響

    2.3 除硫菌工業(yè)發(fā)酵過程控制研究

    2.3.1 除硫菌的發(fā)酵周期及菌體形態(tài)觀察

    除硫菌在配方1 的培養(yǎng)基中,按照控制參數(shù)培養(yǎng),24 h 完成發(fā)酵周期。接種后4 h,孢子萌發(fā)產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)體并進(jìn)行對(duì)數(shù)生長(zhǎng);接種后8 h 菌數(shù)顯著增多,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期,以營(yíng)養(yǎng)體形態(tài)存在;接種12 h后細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)體一端開始形成孢囊;接種后16 h,形成孢囊的菌體自溶并釋放出芽孢,20 h 后大部分芽孢脫落并聚集;24 h 后反應(yīng)體系中主要以芽孢形式存在,脫落的芽孢二次萌芽生長(zhǎng)(圖7)。

    圖7 除硫菌N411在8M3發(fā)酵體系中菌體生長(zhǎng)發(fā)育形態(tài)

    終止培養(yǎng)取樣測(cè)定OD600值達(dá)2.327,顯著高于對(duì)照0.396 的OD600值,平板活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果表明工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的除硫菌N411 菌數(shù)達(dá)2.2×108CFU/mL(圖8)。

    圖8 工業(yè)發(fā)酵除硫菌活菌數(shù)測(cè)定

    2.3.2 除硫菌發(fā)酵過程pH值變化

    伴隨著發(fā)酵過程進(jìn)行,N411 反應(yīng)體系的pH 值也隨之變化。接種時(shí)培養(yǎng)基pH 值為7.0,孢子萌發(fā)進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段,培養(yǎng)4 h 后取樣檢測(cè)pH 值下降至6.5。隨著溶氧增加、蛋白質(zhì)代謝增強(qiáng),pH 逐步提高,接種后12 h pH 值升高到7.2。16 h后pH 上升至7.5,營(yíng)養(yǎng)體形態(tài)的菌體開始形成孢囊,伴隨著細(xì)胞自溶,芽孢釋放,反應(yīng)體系pH值上升為7.7(圖11)。

    圖11 除硫菌N411在發(fā)酵培養(yǎng)過程中pH的動(dòng)態(tài)變化

    3 結(jié)論

    (1)培養(yǎng)基的優(yōu)化研究結(jié)果表明,在碳源選擇上,除硫菌N411 能有效利用PTT 等單糖作為碳源,而對(duì)DF 為碳源的多糖降解利用能力較弱。在氮源選擇上,除硫菌N411 能有效利用XSN 等無機(jī)氮作為氮源,而蛋白質(zhì)為主要成分的豆餅粉作為有機(jī)氮源幾乎不能利用。

    (2)N411 發(fā)酵控制條件以溫度、pH、裝液量(溶氧)為主要參數(shù)。通過實(shí)驗(yàn)確定溫度為60℃,pH 值為7.0,裝液量為26.7%。

    (3)采用制定的發(fā)酵工藝和控制條件完成了除硫菌N411 的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。所得發(fā)酵產(chǎn)品平板活菌數(shù)達(dá)2.2×108CFU/mL,且菌體整齊度高,無雜菌。

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