國(guó)外引進(jìn)甘蔗材料白葉病植原體巢式PCR檢測(cè)及其序列分析

王曉燕,　李文鳳,　黃應(yīng)昆,　張榮躍,　單紅麗

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所,云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 開(kāi)遠(yuǎn)　661699)

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國(guó)外引進(jìn)甘蔗材料白葉病植原體巢式PCR檢測(cè)及其序列分析

王曉燕,李文鳳,黃應(yīng)昆*,張榮躍,單紅麗

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所,云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 開(kāi)遠(yuǎn)661699)

為有效防止引起重要危險(xiǎn)性檢疫病害甘蔗白葉病(SCWL)的植原體病原隨引進(jìn)甘蔗材料侵入我國(guó),確保我國(guó)甘蔗生產(chǎn)安全,本研究對(duì)從緬甸、菲律賓、法國(guó)和泰國(guó)引進(jìn)的22個(gè)甘蔗材料進(jìn)行了SCWL植原體巢式PCR檢測(cè),并對(duì)陽(yáng)性樣品的巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序及序列分析。結(jié)果表明,18個(gè)甘蔗材料呈SCWL植原體陽(yáng)性,陽(yáng)性檢出率為81.8%。所有SCWL陽(yáng)性樣品的16S-23S 基因間隔區(qū)片段長(zhǎng)210 bp,與GenBank中已有的其他SCWL植原體分離物(登錄號(hào)HQ917068、AB646271)的同源性為99.8%～100%,并在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中聚為一個(gè)類群。根據(jù)SCWL的巢氏PCR檢測(cè)及其序列分析結(jié)果,對(duì)呈陽(yáng)性的材料及時(shí)進(jìn)行了集中銷毀處理。

國(guó)外甘蔗材料;甘蔗白葉病;巢式PCR檢測(cè);序列分析

甘蔗白葉病(sugarcane white leaf, SCWL)是由植原體引起的甘蔗重要病害之一[1-5]。該病于1954年首先在泰國(guó)北部南邦府發(fā)生[6],現(xiàn)已廣泛發(fā)生于印度、斯里蘭卡、日本、緬甸、菲律賓、老撾和越南等亞洲國(guó)家[7-13];我國(guó)臺(tái)灣于1958年報(bào)道了該病的發(fā)生[14]。SCWL對(duì)甘蔗的危害是毀滅性的,在泰國(guó)SCWL發(fā)病率達(dá)5%～35%,每年導(dǎo)致超過(guò)2 000萬(wàn)美元的損失[4]。在新幾內(nèi)亞,該病害造成栽培品種‘拉格納’損失高達(dá)100%[7,15],給當(dāng)?shù)馗收岷椭铺钱a(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

SCWL植原體存在于病株韌皮部篩管中,甘蔗是無(wú)性繁殖作物[16],SCWL可通過(guò)帶病蔗種進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播,且傳播性極強(qiáng),是重要的檢疫對(duì)象。近年來(lái),云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所結(jié)合云南省建設(shè)面向西南開(kāi)放橋頭堡的發(fā)展戰(zhàn)略,深入開(kāi)展與東南亞國(guó)家在甘蔗科技方面的合作交流,每年都從緬甸、菲律賓、泰國(guó)等東南亞國(guó)家引進(jìn)甘蔗品種和資源材料。為了防止危險(xiǎn)性檢疫病害SCWL隨引進(jìn)的甘蔗材料侵入我國(guó)境內(nèi)并擴(kuò)散蔓延,對(duì)甘蔗生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅,筆者利用已建立的巢式PCR技術(shù)對(duì)從國(guó)外引進(jìn)的甘蔗材料進(jìn)行了SCWL植原體檢測(cè),同時(shí)對(duì)SCWL陽(yáng)性樣品的16S-23S基因間隔區(qū)序列(16S-23S ISR)進(jìn)行了克隆和同源性分析。

1　材料與方法

1.1材料

從緬甸引進(jìn)的7個(gè)甘蔗材料k95-205、k95-282、k95-89、k91-2-056、k95-87、01-89、09-02;從菲律賓引進(jìn)的4個(gè)甘蔗材料PSR03-48、PSR03-128、PSR03-147、PSR02-237;從法國(guó)引進(jìn)的7個(gè)甘蔗材料DB71060、CP99-1534、CP99-1894、CP00-1101、CP00-1252、Ho95-988、PSR97-092;從泰國(guó)引進(jìn)的4個(gè)甘蔗材料KK3、UT6、SP50、SP72。陽(yáng)性對(duì)照為感染SCWL的甘蔗材料UT3的葉片總基因組DNA,由云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,陰性對(duì)照為健康甘蔗葉片基因組DNA,空白對(duì)照為滅菌雙蒸水。

1.2巢式PCR檢測(cè)

1.2.1引物序列

擴(kuò)增SCWL植原體16S rDNA的引物序列參照文獻(xiàn)[2,5,17],委托上海生工生物工程公司合成。MLOX:5′-GTTAGGTTAAGTCCTAAAACGAGC-3′,MLOY:5′-GTGCCAAGGCATCCACTGTATGCC-3′;P1: 5′-GTCGTAACAAGGTATCCCTACCGG-3′,P2:5′-GGTGGGCCTAAATGGACTTGAACC-3′。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為210 bp。

1.2.2樣品DNA的提取

參照Harrison等[18]的方法,改進(jìn)后提取葉片基因組DNA。稱取0.2 g甘蔗樣品葉組織,加入液氮研磨成粉并轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管,加入1 mL 經(jīng)65℃預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液,65℃水浴30 min,12 000 r/min離心10 min;取上清液加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)搖勻,12 000 r/min離心10 min;取750 μL上清液加入2/3體積異丙醇,緩慢翻轉(zhuǎn)混勻,于-20℃放置4 h,12 000 r/min離心10 min;沉淀用500 μL 95%乙醇清洗2次,12 000 r/min離心5 min;室溫下干燥1.5 h;加入180 μL滅菌雙蒸水,室溫放置1.5 h,充分混勻;加入200 μL 5 mmol/L NaCl和200 μL 95%乙醇,混勻,12 000 r/min離心5 min;沉淀加入500 μL 70%乙醇,12 000 r/min離心5 min;沉淀于室溫下風(fēng)干,溶于40 μL滅菌雙蒸水中,置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3植原體的巢式PCR檢測(cè)

參考盧文潔等[19]建立的SCWL植原體巢式PCR檢測(cè)體系,對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。以待測(cè)樣品DNA為模板,MLOX/MLOY為第1次PCR引物,反應(yīng)體系為20 μL:10×PCR buffer 2.5 μL,10 mmol/L dNTPs 1 μL,25 mmol/L MgCl20.5 μL,5 U/μLTaq酶0.2 μL,20 μmol/L MLOX和MLOY 各1 μL,模板總基因組DNA 1 μL,ddH2O 13.8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,25個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。取1 μL第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,稀釋100倍作為模板,P1/P2為引物,進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增。巢氏PCR反應(yīng)體系為20 μL: 20 μmol/L P1和P2各1 μL,其他試劑用量同第1次PCR擴(kuò)增。第2次PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,62℃退火1 min,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

取10 μL 巢式PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(膠里預(yù)先加入0.005%的GoldView核酸染料),在0.5×TBE緩沖液，100 V的電壓下電泳40 min后,用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察,擴(kuò)增到210 bp條帶的為陽(yáng)性,反之為陰性。

1.2.4巢式PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序及序列分析

陽(yáng)性巢式PCR產(chǎn)物用快捷型瓊脂糖DNA回收試劑盒(天根生化科技公司)純化。純化后的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T(TaKaRa公司)于16℃下過(guò)夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基,于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。挑取平板上的單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),取適量的培養(yǎng)產(chǎn)物用于PCR檢測(cè)。每個(gè)分離物挑選6個(gè)經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆,送交北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。將所測(cè)序列提交GenBank并進(jìn)行BLAST比對(duì)檢索,與NCBI上已知序列進(jìn)行同源性比較,采用DNAMAN 6.0和MEGA 4.0軟件進(jìn)行序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1SCWL植原體巢式PCR檢測(cè)

利用巢式PCR技術(shù)對(duì)從緬甸、菲律賓、法國(guó)和泰國(guó)引進(jìn)的22個(gè)甘蔗材料進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:從緬甸引進(jìn)的5個(gè)材料 k95-282、k91-2-056、k95-87、01-89、09-02,從菲律賓引進(jìn)的3個(gè)材料PSR03-48、PSR03-128、PSR02-237,從法國(guó)引進(jìn)的6個(gè)材料CP99-1534、CP99-1894、CP00-1101、CP00-1252、Ho95-988、PSR97-092,和從泰國(guó)引進(jìn)的4個(gè)材料 KK3、UT6、SP50和SP72 等共18個(gè)材料都擴(kuò)增出約210 bp的目的片段,陽(yáng)性檢出率為81.8%。從緬甸引進(jìn)的k95-205、k95-89,從菲律賓引進(jìn)的PSR03-147和從法國(guó)引進(jìn)的DB71060等4個(gè)材料未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶。圖1為部分檢測(cè)樣品的電泳結(jié)果。

圖1　部分國(guó)外引進(jìn)甘蔗品種材料SCWL巢式PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1　Nested PCR detection result of SCWL in some exotic sugarcane materials

2.2巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果及序列分析

對(duì)18個(gè)SCWL陽(yáng)性樣品的巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序。結(jié)果表明,來(lái)源于緬甸、菲律賓、法國(guó)和泰國(guó)的18個(gè)SCWL樣品的16S-23S ISR序列長(zhǎng)度都為210 bp。從每個(gè)國(guó)家的供試樣品中隨機(jī)選擇1個(gè)樣品序列提交到GenBank,序列號(hào)分別為KC662511(緬甸k95-282)、KC662512(菲律賓PSR03-48)、KC662510(法國(guó)CP99-1534)和KF431838(泰國(guó)UT6)。經(jīng)NCBI BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn),緬甸‘k95-282’、菲律賓‘PSR03-48’、法國(guó)‘CP99-1534’和泰國(guó)‘UT6’SCWL分離物16S-23S ISR核苷酸序列與GenBank中公布的泰國(guó)和緬甸SCWL植原體分離物(登錄號(hào)HQ917068、AB646271)相應(yīng)序列同源性高達(dá)99.8%～100%,而與其他組植原體相應(yīng)序列的同源性低于89.9%。表明檢測(cè)的片段是甘蔗白葉病植原體。

2.3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建與分析

將GenBank中植原體16Sr各組代表性16S-23S ISR序列下載下來(lái),與本研究測(cè)定的4個(gè)SCWL 16S-23S ISR序列進(jìn)一步進(jìn)行同源性分析,利用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),以Acholeplasmalaidlawii(登錄號(hào)JQ390342)為外群(圖2)。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出,緬甸、菲律賓、法國(guó)和泰國(guó)SCWL植原體分離物與GenBank中已有的SCWL植原體分離物(登錄號(hào)HQ917068、AB646271)歸為一個(gè)類群,都屬于16Sr Ⅺ組植原體。

圖2　基于16S-23S ISR序列的緬甸、菲律賓、法國(guó)和泰國(guó)甘蔗 白葉病植原體及其他相關(guān)植原體株系的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)Fig.2　Phylogenetic tree based on the 16S-23S ISR sequences of SCWL phytoplasma from Myanmar, the Philippines,France, Thailand and other representative phytoplasma

3　討論

隨著云南橋頭堡建設(shè)發(fā)展戰(zhàn)略的深入實(shí)施,與東南亞國(guó)家在甘蔗科技方面的合作交流加強(qiáng),國(guó)際甘蔗種質(zhì)資源引進(jìn)交換工作不斷深入,引種國(guó)家數(shù)量增加,規(guī)模、范圍不斷擴(kuò)大,由國(guó)外引種導(dǎo)致的病害侵入風(fēng)險(xiǎn)也在不斷增加。因此,切實(shí)加強(qiáng)甘蔗引種檢疫檢測(cè)工作將是有效防止外來(lái)危險(xiǎn)性有害生物隨引種傳入我國(guó)蔗區(qū)造成災(zāi)害隱患的首要任務(wù)和安全保障措施。

SCWL是甘蔗上分布廣泛,危害嚴(yán)重的重要病害[4,7],極大地威脅著甘蔗的生產(chǎn)和發(fā)展[15]。本研究利用已建立的巢式PCR技術(shù),對(duì)從緬甸、菲律賓、法國(guó)和泰國(guó)引進(jìn)的22個(gè)甘蔗材料進(jìn)行了危險(xiǎn)性檢疫病害SWCL的檢測(cè),結(jié)果有18個(gè)甘蔗材料呈陽(yáng)性,陽(yáng)性檢出率為81.8%,其余呈陰性。本文所測(cè)SCWL陽(yáng)性樣品的16S-23S ISR序列與其他GenBank中已公布的SCWL植原體分離物16S-23S ISR序列同源性高達(dá)99.8%～100%,且在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中所有的SCWL植原體都?xì)w為一個(gè)類群。進(jìn)一步證實(shí)了18份國(guó)外引進(jìn)甘蔗材料中存在SCWL植原體。根據(jù)巢氏PCR檢測(cè)及序列分析結(jié)果,對(duì)呈陽(yáng)性的甘蔗材料及時(shí)進(jìn)行了銷毀處理,為國(guó)際合作甘蔗材料交換的順利開(kāi)展和實(shí)施提供了安全保障。本研究結(jié)果顯示從緬甸、菲律賓和泰國(guó)等東南亞國(guó)家引進(jìn)的甘蔗材料SWCL陽(yáng)性檢出率高,這與有關(guān)研究報(bào)道相吻合,SCWL近年在東南亞國(guó)家發(fā)生尤為普遍和嚴(yán)重,且SCWL易隨蔗種進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播。這就要求我們今后在加強(qiáng)與東南亞國(guó)家深入開(kāi)展甘蔗科技交流合作,進(jìn)行甘蔗材料交換工作中,要重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)引進(jìn)甘蔗材料的SCWL檢疫檢測(cè),有效防止其隨引進(jìn)材料侵入我國(guó)境內(nèi)擴(kuò)散蔓延,確保我國(guó)蔗糖產(chǎn)業(yè)的安全可持續(xù)發(fā)展,推進(jìn)國(guó)際合作的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Nested PCR detection and sequence analysis of phytoplasma causing white leaf disease in imported sugarcane materials

Wang Xiaoyan,Li Wenfen,Huang Yingkun,Zhang Rongyue,Shan Hongli

(Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan661699, China)

To effectively prevent invasion of sugarcane white leaf disease (SCWL), an important quarantine disease caused by phytoplasma, into China through introduction of sugarcane materials, and to secure sugarcane production, phytoplasma causing SCWL was detected by nested PCR in 22 imported sugarcane materials from Myanmar, the Philippines, France and Thailand. Then, the nested PCR products of SCWL positive samples were sequenced and analyzed. The results showed that 18 of 22 materials (81.8%) were positive. The 16S-23S intergenic region of all SCWL positive samples were all 210 bp long, and shared 99.8% to 100% identity with other published SCWL phytoplasma sequences (GenBank accession number HQ917068, AB646271), and they were clustered together in a group in phylogenetic tree. Based on the nested PCR detection and sequence analysis results, the SCWL positive materials were destroyed immediately.

imported sugarcane materials;sugarcane white leaf disease;nested PCR detection;sequence analysis

2015-02-14

2015-04-22

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-20-2-2)；云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系

E-mail:huangyk64@163.com

S 435.661, Q 939.34

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.025