凝血酶預(yù)處理對(duì)大鼠腦出血后SVZ細(xì)胞遷移和分化的影響

關(guān)景霞　解燕春　張少鋒　袁振華　黃婷婷　盧祖能

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凝血酶預(yù)處理對(duì)大鼠腦出血后SVZ細(xì)胞遷移和分化的影響

關(guān)景霞解燕春張少鋒袁振華黃婷婷盧祖能

目的探討凝血酶預(yù)處理(thrombin preconditioning，TPC)對(duì)大鼠腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后側(cè)腦室下帶(subventricular zone，SVZ)細(xì)胞遷移和分化的影響。方法將90只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組：TPC組、ICH組、對(duì)照組。每組分為3、7、14、21、28 d亞組；應(yīng)用IV型膠原酶腦內(nèi)立體定向注射制作腦出血模型，應(yīng)用Brdu標(biāo)記新生的SVZ細(xì)胞；進(jìn)行腦片培養(yǎng)，應(yīng)用時(shí)間間隔顯微系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞在活體腦片上的遷移；為了評(píng)估遷移至損傷區(qū)的SVZ細(xì)胞是否具有與其他細(xì)胞形成突觸的能力，進(jìn)行Brdu和突觸蛋白Ⅰ免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色。結(jié)果在時(shí)間間隔顯微系統(tǒng)下觀察Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞向紋狀體遷移，動(dòng)態(tài)觀察12 h，TPC組3 d SVZ細(xì)胞遷移的速度是(4.23±0.25)μm/h，7 d的速度是(6.53±0.37)μm/h，14 d的速度是(8.23±0.47)μm/h，21 d的速度是(7.05±0.31)μm/h，28 d的速度是(5.29±0.20)μm/h，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)TPC組的遷移速度明顯快于腦出血組(P<0.01)。TPC組同側(cè)紋狀體Brdu和突觸蛋白Ⅰ雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞3 d明顯增加，14 d達(dá)高峰，持續(xù)至21 d，然后逐漸減少。腦出血組3 d未見(jiàn)Brdu和突觸蛋白Ⅰ雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，7 d可見(jiàn)少數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，14 d達(dá)高峰，然后逐漸下降，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞與腦出血組比較均明顯增加(P<0.01)。TPC使突觸蛋白I的表達(dá)出現(xiàn)時(shí)間更早，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。結(jié)論TPC能夠促進(jìn)腦出血后SVZ細(xì)胞的遷移和分化。

腦出血側(cè)腦室下帶凝血酶預(yù)處理

腦出血(Intracerebral haemorrhage, ICH)具有較高的發(fā)病率和病死率, 大約占所有腦卒中死亡的15%[1]。目前，盡管腦出血急性期的治療已經(jīng)逐漸走上規(guī)范化道路，但是對(duì)腦出血后造成的神經(jīng)功能缺失仍然缺乏有效的治療手段[2]。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷能引起內(nèi)源性的神經(jīng)再生，主要在側(cè)腦室下帶(subventricular zone, SVZ), 新生的細(xì)胞可以向損傷區(qū)域遷移[3-4]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)腦出血后存在內(nèi)源性神經(jīng)再生，但是腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確[5-6]。因此，探討腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)再生機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步增強(qiáng)這一過(guò)程是非常重要的。

凝血酶是一種血清絲氨酸蛋白酶，是凝血瀑布的重要成分，腦出血后立即產(chǎn)生。既往研究表明高濃度的凝血酶對(duì)腦組織具有損傷作用，低濃度的凝血酶具有保護(hù)作用[7-9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)凝血酶能夠破壞血腦屏障、引起腦水腫，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10-11]。但是預(yù)先使用小劑量的凝血酶能夠減輕腦出血導(dǎo)致的腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞的死亡[12-13]，這種現(xiàn)象被稱作凝血酶預(yù)處理(thrombin preconditioning，TPC)或凝血酶引起的腦耐受。TPC的機(jī)制尚不明確。我們的前期研究表明TPC能夠增強(qiáng)腦出血后的SVZ細(xì)胞的再生[6]，本研究主要進(jìn)一步探討TPC對(duì)腦出血后SVZ細(xì)胞遷移和分化能力的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

健康SD雄性大鼠90只，體重(250±20)g，隨機(jī)分為對(duì)照組、ICH組和TPC組，每組分為3、7、14、21、28 d亞組，每亞組各6只大鼠。

1.2動(dòng)物模型的制作

實(shí)驗(yàn)大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于立體定位儀上, 頭皮正中切開(kāi)，剪開(kāi)骨膜，暴露前囟，于顱骨背側(cè)前囟后0.2 mm，中線右側(cè)3 mm處鉆一直徑為2 mm的孔；用固定于立體定位儀上30號(hào)無(wú)菌針頭沿針孔垂直進(jìn)針，進(jìn)針深度為5.8 mm。對(duì)照組注射生理鹽水2 μL，ICH組注射溶有膠原酶0.4 U的生理鹽水2 μL。TPC各組首先在右側(cè)紋狀體注入1 U凝血酶，1 d后再制作右側(cè)紋狀體腦出血模型。每組6只大鼠在模型制作后3只進(jìn)行Brdu標(biāo)記，3只進(jìn)行Dil標(biāo)記，各組大鼠在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死。

1.3Dil在體標(biāo)記SVZ細(xì)胞

各組的動(dòng)物模型制作后在各個(gè)亞組時(shí)間點(diǎn)的前1 d(即第2、6、13、20、27 d)用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于立體定位儀上, 頭皮正中切開(kāi)，剪開(kāi)骨膜，暴露前囟，于顱骨背側(cè)前囟后1.0 mm，右側(cè)旁開(kāi)1.5 mm，硬腦膜下3.5 mm處，將2 g/L的熒光染料Dil 10 μL緩慢注入右側(cè)側(cè)腦室，留針5 min后緩慢退針，常規(guī)消毒，縫合皮膚。

1.4制作皮層紋狀體腦片進(jìn)行培養(yǎng)

各組大鼠在各亞組時(shí)間點(diǎn)斷頭處死，浸入75%酒精消毒，快速取出全腦放入預(yù)冷人工腦脊液中(成分mmol/L：NaCl 126，KCl 2.5，NaH2PO31.2，MgCl 1.3，葡萄糖11，NaC0325，CaCl24，試劑配制均用蒸餾水)。清除軟腦膜, 取前囟前1.3 mm 至前囟后2.7 mm之間的腦塊，置于組織切片機(jī)的載物臺(tái)上，以300 μm厚度單位切取腦片，放入預(yù)冷的人工腦脊液中漂洗，然后放入加有腦片培養(yǎng)液的六孔培養(yǎng)板中。腦片培養(yǎng)液組成：50%DMEM，25%HESS，25%馬血清，65 g/L D-葡萄糖，298 mg/L HEPES，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，25 μg/mL兩性霉素。腦片的培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為95%的空氣和5%飽和濕度的CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.5時(shí)間間隔成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)追蹤SVZ細(xì)胞

該檢測(cè)系統(tǒng)配有自動(dòng)化載物臺(tái)、熒光顯微鏡和時(shí)間間隔成像系統(tǒng)，自動(dòng)化載物臺(tái)提供最理想的活體細(xì)胞存活環(huán)境，適用于長(zhǎng)時(shí)間間隔法動(dòng)態(tài)追蹤活體細(xì)胞。將各個(gè)亞組腦片的培養(yǎng)皿放置于顯微鏡的自動(dòng)化載物臺(tái)上，顯微鏡觀察Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞的遷移，自動(dòng)拍照，觀察12 h，應(yīng)用metamorph通用軟件進(jìn)行綜合分析處理。

1.6BrdU在體標(biāo)記SVZ細(xì)胞

動(dòng)物模型制作后腹腔注射Brdu磷酸鹽緩沖液(50 mg/kg)，2次/d，直至在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠。

1.7免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色

各組大鼠在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)心臟進(jìn)行灌注，斷頭取全腦，以注入針道為中心，冠狀位切下組織塊，厚約4 mm，剩余部分棄去；組織塊放入4%多聚甲醛內(nèi)，后固定4 h，換入20%蔗糖溶液中過(guò)夜至組織塊沉底;標(biāo)本用恒溫冰凍切片機(jī)經(jīng)血腫中心作全腦連續(xù)冠狀位切片，片厚5 μm，切片放入37 ℃的鹽酸溶液中30 min，進(jìn)行DNA變性，再放入硼酸溶液中洗滌10 min，首先進(jìn)行親和素-生物素-堿性磷酸酶法染色，一抗為小鼠抗大鼠Brdu，二抗為生物素化的馬抗小鼠抗體，硝基四氮唑藍(lán)(NBT/BICP)顯色，沖洗后進(jìn)行親和素-生物素-過(guò)氧化物酶法染色，一抗為兔抗大鼠突觸蛋白Ⅰ抗體，二抗為生物素化的羊抗兔抗體，DAB顯色，進(jìn)行水洗、脫水、透明、封片。利用圖像分析系統(tǒng)，隨機(jī)觀察并計(jì)數(shù)10個(gè)不重復(fù)視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)行分析處理。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1時(shí)間間隔顯微成像系統(tǒng)下觀察SVZ細(xì)胞的遷移

為了動(dòng)態(tài)觀察SVZ細(xì)胞在活體組織上的遷移，進(jìn)行了Dil在體標(biāo)記SVZ細(xì)胞和腦片培養(yǎng)，然后在時(shí)間間隔顯微成像系統(tǒng)下動(dòng)態(tài)追蹤Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞在活體腦片上的遷移，連續(xù)觀察12 h，時(shí)間間隔顯微成像系統(tǒng)下可見(jiàn)Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞隨著時(shí)間逐漸向紋狀體進(jìn)行遷移(圖1)。腦出血后3 d的遷移速度相對(duì)較慢，14 d的遷移速度最快，然后逐漸減慢。TPC組3 d的遷移速度明顯快于腦出血組，7 d逐漸增快，14 d達(dá)高峰，21 d開(kāi)始逐漸減慢，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)TPC組的遷移速度明顯快于腦出血組(P<0.01)(表1)。

表　Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞在活體腦片上的遷移速度 (μm/h)

注：與ICH組比較，*P<0.01

圖1 腦出血組和TPC組14 d Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞向紋狀體的遷移A為腦出血組；B為T(mén)PC組。A和B圖中的箭頭指同一個(gè)Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞在觀察期間隨著時(shí)間向紋狀體遷移。LV= lateral ventricle (側(cè)腦室)

2.2Brdu和突觸蛋白Ⅰ免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色

為了明確遷移至損傷區(qū)的新生SVZ細(xì)胞是否具有與其他細(xì)胞形成突觸的能力，我們進(jìn)行了Brdu和突觸蛋白Ⅰ免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色(圖2～圖3)。腦出血后3 d紋狀體沒(méi)有明顯的Brdu和突觸蛋白Ⅰ雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，7 d可見(jiàn)少數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，14 d陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)高峰，21 d開(kāi)始下降。TPC組3 d可見(jiàn)明顯的Brdu和突觸蛋白Ⅰ雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，7 d陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增加，14 d達(dá)高峰，持續(xù)至21 d，28 d開(kāi)始下降，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)TPC組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較腦出血組明顯增加(P<0.01)，TPC使新生SVZ細(xì)胞突觸蛋白Ⅰ的表達(dá)出現(xiàn)時(shí)間更早，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。

圖2Brdu和突觸蛋白Ⅰ免疫雙標(biāo)染色的表達(dá)過(guò)程與腦出血組和對(duì)照組比較，*P<0.01；與對(duì)照組比較，#P<0.01，△P>0.05

圖3Brdu和突觸蛋白Ⅰ免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色Brdu免疫染色位于細(xì)胞核(藍(lán)色)，突觸蛋白Ⅰ免疫染色位于細(xì)胞漿(棕色)；箭頭指Brdu和突觸蛋白Ⅰ免疫雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞；(A～E): 腦出血組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Brdu和突觸蛋白Ⅰ免疫雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的分布，A為3 d; B為7 d; C為14 d; D為21 d; E為28 d；(a～e): TPC組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Brdu和突觸蛋白Ⅰ免疫雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的分布，a為3 d; b為7 d; c為14 d; d為21 d; e為28 d

3　討論

腦出血是一種較常見(jiàn)的致死性卒中亞型，幸存者常遺留明顯的神經(jīng)功能障礙[14]。內(nèi)源性神經(jīng)再生的發(fā)現(xiàn)給腦出血的治療帶來(lái)新的希望。腦內(nèi)兩個(gè)主要區(qū)域存在內(nèi)源性神經(jīng)再生，即側(cè)腦室下帶和海馬齒狀回。近年來(lái)的研究顯示腦缺血后可出現(xiàn)內(nèi)源性神經(jīng)再生，新生的SVZ細(xì)胞可向損傷區(qū)域遷移，并且可分化成有功能的神經(jīng)細(xì)胞并入損傷腦組織[15-16]。研究顯示腦出血后存在內(nèi)源性神經(jīng)再生[17-19]，但是腦出血后新生的細(xì)胞只有少數(shù)能夠存活，大部分細(xì)胞在短期內(nèi)死亡，不能與其他細(xì)胞建立突觸聯(lián)系，并入神經(jīng)傳導(dǎo)通路，達(dá)到改善神經(jīng)功能的目的，因此如何增強(qiáng)腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)再生對(duì)于改善功能至關(guān)重要。

我們的前期研究顯示腦出血后存在內(nèi)源性神經(jīng)再生，TPC能夠增強(qiáng)腦出血后的內(nèi)源性神經(jīng)再生[5-6]。為近一步觀察TPC對(duì)腦出血后SVZ細(xì)胞遷移的影響，本研究應(yīng)用Dil在體標(biāo)記SVZ細(xì)胞。Dil是一種熒光染料，可以滲入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，不在細(xì)胞間進(jìn)行擴(kuò)散，對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷作用。將進(jìn)行Dil標(biāo)記的活體腦片進(jìn)行培養(yǎng)，然后應(yīng)用時(shí)間間隔顯微成像系統(tǒng)。在活體腦片上動(dòng)態(tài)追蹤Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞，研究顯示Dil標(biāo)記的SVZ細(xì)胞隨著時(shí)間逐漸向紋狀體進(jìn)行遷移。TPC組的遷移速度明顯較腦出血組快，提示TPC可能上調(diào)某些因素，從而促進(jìn)SVZ細(xì)胞的遷移。

正常情況下SVZ細(xì)胞通過(guò)嘴側(cè)遷移流至嗅球，分化成中間神經(jīng)元。腦出血后新生的SVZ向損傷的紋狀體進(jìn)行遷移。近年來(lái)時(shí)間間隔顯微成像系統(tǒng)已成功地記錄了腦內(nèi)細(xì)胞的遷移[20]，但是既往大多數(shù)研究使用固定的組織切片，固定組織切片有一定局限性，不能顯示細(xì)胞遷移的真實(shí)情況。本研究提供了腦出血后SVZ細(xì)胞向損傷區(qū)域遷移的直接證據(jù)。但是腦片培養(yǎng)和體內(nèi)組織存在一定的區(qū)別。首先，腦片培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)的供給可能不充分；其次，在腦片上細(xì)胞的移動(dòng)可能受到部分限制；第三，腦片上沒(méi)有血流，這一點(diǎn)與體內(nèi)完全不同。所有這些因素可能會(huì)影響細(xì)胞的遷移速度。

遷移至損傷區(qū)域的SVZ細(xì)胞是否能夠分化成有功能的神經(jīng)細(xì)胞，與其他神經(jīng)細(xì)胞建立突觸聯(lián)系，整合至神經(jīng)環(huán)路，這對(duì)于改善神經(jīng)功能至關(guān)重要。本研究顯示腦出血后3 d，紋狀體沒(méi)有明顯的Brdu和突觸蛋白Ⅰ雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，7 d可見(jiàn)少數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，14 d陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)高峰，21 d開(kāi)始下降。TPC組3 d時(shí)可見(jiàn)明顯的Brdu和突觸蛋白Ⅰ雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，14 d達(dá)高峰，一直持續(xù)至21 d，然后開(kāi)始下降，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)TPC的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較腦出血組明顯增加，說(shuō)明TPC能夠促進(jìn)突觸蛋白Ⅰ的表達(dá)， TPC使新生SVZ細(xì)胞突觸蛋白Ⅰ表達(dá)時(shí)間出現(xiàn)的更早，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)。突觸蛋白Ⅰ是突觸前蛋白，調(diào)節(jié)突觸囊泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，突觸蛋白Ⅰ對(duì)于突觸的功能非常重要。本研究表明遷移至損傷區(qū)域的SVZ細(xì)胞具有形成突觸的能力，TPC對(duì)其有增強(qiáng)促進(jìn)作用。

本研究顯示TPC能夠增強(qiáng)腦出血后SVZ細(xì)胞遷移和分化能力，但其機(jī)制尚不明確。高濃度的凝血酶對(duì)腦組織有損傷作用，低濃度的凝血酶對(duì)腦組織有保護(hù)作用。凝血酶可激活許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑。證據(jù)顯示凝血酶能夠激活神經(jīng)再生[21]、血管再生[22]和神經(jīng)可塑性[23]，能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化。此外，凝血酶能夠增強(qiáng)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)生長(zhǎng)因子的合成和分泌，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞的增生[24]，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌[25]。TPC增強(qiáng)腦出血后內(nèi)源性神經(jīng)再生的準(zhǔn)確機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，對(duì)其機(jī)制的理解有助于進(jìn)一步改善損傷部位新生神經(jīng)元的存活和分化。

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(2016-01-06收稿2016-05-16修回)

The Effect of thrombin preconditioning on migration and differentiation of subventricular zone cells after intracerebral hemorrhage in rats

GuanJingxia,XieYanchun,ZhangShaofeng,etal.

DepartmentofNeurology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060

ObjectiveTo investigate the effect of thrombin preconditioning (TPC) on the migration and differentiation of subventricular zone (SVZ) cells in rats after intracerebral hemorrhage (ICH).Methods90 Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups (ICH, TPC and control group). Rats of each group were randomly divided into 5 subgroups (3 d, 7 d, 14 d, 21 d, 28 d subgroup). ICH was caused by intrastrial stereotactic administration of collagenase type IV. Brdu was used to label newborn SVZ cells. To dynamically observe the migration of SVZ cells at living brain tissue, brain slices were cultured. Migration of Dil-labeled SVZ cells in living brain slice was traced by time-lapse microscopy. To assess whether SVZ cells migrating to injured striatum had the ability to form synapses with other cells, the brain slices from each group were double immunolabeled with Brdu and synapsinⅠ.ResultsMigration of Dil-labeled SVZ cells to the striatum in brain slices in each group was dynamically observed and imaged by time-lapse microscopy during a 12 hour period. The velocity of migration of Dil-labeled SVZ cells in the TPC group was 4.23±0.25 m/h in the 3-day group, 6.53±0.37 m/h in the 7-day group, 8.23±0.47 m/h in the 14-day group, 7.05±0.31 m/h in the 21-day group, and 5.29±0.20 m/h in the 28-day group respectively. The velocity of migration in the TPC group was faster than that in the ICH group with significant statistic difference (P<0.01).The numbers of Brdu and synapsin positive cells were markedly increased in the ipsilateral striatum at 3 days after TPC, peaked at 14 days (P<0.01), continued to 21 days, and then gradually decreased at 28 days. At 3 days after ICH, all of the Brdu-positive cells in the ipsilateral stratum were not synapsinⅠ-positive cells. At 7 days after ICH, the minority of Brdu-positive cells were synapsinⅠ-positive cells. Colocalization of Brdu with synapsinⅠ peaked at 14 days and then gradually decreased. There was significant statistic difference between the ICH group and TPC group at each time point (P<0.01). TPC made colocalization of Brdu and synapsinⅠ appear earlier and continue for a longer time compared to the ICH group.ConclusionOur results demonstrated TPC could promote the migration and differentiation of SVZ cells after ICH, which may provide a new idea for enhancing endogenous neurogenesis.

Intracerebral hemorrhageSubventricular zoneThrombin preconditioning

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)為81301010)

430060武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科[關(guān)景霞解燕春張少鋒袁振華黃婷婷盧祖能(通信作者)]

R743.34

A

1007-0478(2016)04-0232-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.04.004