產(chǎn)凝乳酶解淀粉芽孢桿菌的誘變選育

關(guān)明玲,李學(xué)朋,楊　敏,張忠明,張衛(wèi)兵,*,師希雄,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

?

產(chǎn)凝乳酶解淀粉芽孢桿菌的誘變選育

關(guān)明玲1,2,李學(xué)朋1,2,楊敏1,2,張忠明1,張衛(wèi)兵1,2,*,師希雄1,*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730070;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

為了獲得高產(chǎn)凝乳酶菌株,以產(chǎn)凝乳酶解淀粉芽孢桿菌為出發(fā)菌株,采用紫外線和硫酸二乙酯進(jìn)行誘變。誘變后篩選得了一個(gè)突變株L-6,凝乳活力為1419.7 SU/mL,比原始菌株提高了40.2%;水解活力降低了22.39%,凝乳活力與蛋白水解活力的比值為125.64,比出發(fā)菌株提高了81.32%。傳代實(shí)驗(yàn)表明,該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

解淀粉芽孢桿菌,凝乳酶,誘變

誘變育種是指利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群,促進(jìn)其突變頻率大幅度提高,然后設(shè)法采用簡便、快速和高效的篩選方法,從中挑選少數(shù)符合育種目的的突變株,以供生產(chǎn)實(shí)踐或科學(xué)實(shí)驗(yàn)之用[1-3]。微生物常用的誘變方法包括化學(xué)誘變、物理誘變、生物誘變和復(fù)合誘變[4-8]。紫外誘變是最為常用的一種物理誘變,DNA分子的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后形成嘧啶二聚體,二聚體出現(xiàn)會(huì)引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形,阻礙堿基間的正常配對(duì),從而有可能引起突變或死亡[9-11]。另外二聚體的形成,會(huì)妨礙雙鏈的解開,因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[12]。硫酸二乙酯是一種化學(xué)誘變劑,用其進(jìn)行誘變的特點(diǎn)是快速、安全和高效[13-14]。硫酸二乙酯與紫外誘變結(jié)合后具有協(xié)同效應(yīng),可以使菌種的突變率顯著增加,誘變效果更好,已成功地用于亞硝化單胞菌、產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌豆豉溶栓酶產(chǎn)生菌的誘變[15-17]。

本實(shí)驗(yàn)室前期成功地利用紫外線和硫酸二乙酯對(duì)產(chǎn)凝乳酶地衣桿菌進(jìn)行了誘變。另外對(duì)甘南牧區(qū)的產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌進(jìn)行篩選,得到一株產(chǎn)凝乳酶的解淀粉芽孢桿菌,其酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于地衣芽孢桿菌[18-19]。本研究以產(chǎn)凝乳酶解淀粉芽孢桿菌為出發(fā)菌株,進(jìn)行紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合處理,以期篩選凝乳活力較高而水解活力較低的菌株,為細(xì)菌凝乳酶的發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

表2　紫外誘變的初篩結(jié)果Table 2　The result of primary screening by UV

干酪素甘肅華羚生物科技有限公司,食品級(jí);脫脂奶粉完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司,食品級(jí);麩皮蘭州市安寧區(qū)桃海市場。硫酸二乙酯,蛋白胨,牛肉膏蘭州嘉特星化學(xué)試劑有限公司。

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備廠;HD-E806恒溫振蕩培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;H1850R冷凍高速離心機(jī)長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

酪蛋白培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng)基參考張衛(wèi)兵等的方法[18]進(jìn)行配制。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌懸液的制備將菌種在酪蛋白培養(yǎng)基上活化,然后接種于裝有20 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中,于37 ℃、170 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)15 h,吸取5 mL培養(yǎng)液加入裝有45 mL生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中,在振蕩器上振蕩20 min,將菌體充分打散后得到菌懸液[18]。

1.2.2紫外線誘變處理參考張衛(wèi)兵[18]等的方法進(jìn)行紫外線誘變,照射時(shí)間分別設(shè)定為0、30、60、120、180 s,誘變后計(jì)算致死率和正突變率。

致死率(%)=處理前每毫升活菌數(shù)-處理后每毫升活菌數(shù)/處理前每毫升活菌數(shù)×100

1.2.3硫酸二乙酯誘變處理參考張衛(wèi)兵等的方法進(jìn)行硫酸二乙酯誘變[18],處理時(shí)間分別設(shè)定為0、40、50、60、70、80、90 min,誘變后計(jì)算致死率和正突變率。

1.2.4突變菌株的篩選參考張衛(wèi)兵[18]等的方法進(jìn)行突變菌株的篩選。將突變株活化后,接種于裝液量為20 mL/50 mL的三角瓶中,然后將三角瓶固定于搖床上,37 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后,將發(fā)酵液8000 r/min離心5 min,得到粗酶液,通過測定酶活篩選菌株。

1.2.5突變株的遺傳穩(wěn)定性將篩選出的菌株連續(xù)傳代8次,通過測定酶活力確定菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6酶活的測定凝乳酶活力的測定采用Arima法[18],蛋白水解活力的測定采用Folin酚試劑法[18]。

1.3數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析。

2　結(jié)果與分析

2.1紫外線誘變的結(jié)果

菌株經(jīng)紫外線照射不同時(shí)間后,不同處理時(shí)間下致死率和正突變率結(jié)果見表1。

由表1可看出,菌株在紫外線處理時(shí),隨照射時(shí)間的增加,致死率逐漸增大。照射60 s時(shí)致死率達(dá)到79.5%;照射120 s時(shí),菌體致死率達(dá)到95.3%;照射180 s時(shí),菌體全部死亡。這一變化趨勢與地衣芽孢桿菌的紫外誘變基本相同。紫外處理時(shí),正突變率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,照射60 s時(shí)正突變率最高,可達(dá)13.36%。致死率和正突變率的變化趨勢與前期實(shí)驗(yàn)中對(duì)地衣芽孢桿菌誘變時(shí)基本相同,但最高正變率略低[18]。綜合考慮,在本實(shí)驗(yàn)中選擇60 s作為紫外線誘變的最佳處理時(shí)間。

表1　紫外線對(duì)菌株的誘變效果Table 1　The effect of UV treatment on the strains

2.2紫外誘變的初篩和復(fù)篩結(jié)果

菌株誘變后,涂布于分離平板上培養(yǎng),待長出菌落后測定凝乳圈直徑和菌落直徑,部分菌株的測定結(jié)果見表2。

由表2可以看出經(jīng)過紫外誘變后,菌株的凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的有Z-1、Z-3、Z-4、Z-6、Z-7、Z-10,其中菌株Z-1的增加幅度最大,達(dá)8.0%。

選擇凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的菌株,發(fā)酵后測定凝乳活力和蛋白水解力,結(jié)果見表3。

表3　紫外誘變的復(fù)篩結(jié)果Table 3　The result of secondary screening by UV

由表3可以看出,凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的幾株菌的凝乳活力均比出發(fā)菌株有所提高,其中Z-1凝乳活力提高最大,達(dá)到了23.2%。與出發(fā)菌株的水解活力相比,Z-1、Z-4、Z-7的水解活力都有所降低,其中Z-4水解活力降低最大,達(dá)到了23.9%,Z-1水解活力降低也較大,達(dá)到了23.3%。從凝乳活力與蛋白水解活力的比值來看,Z-3和Z-10菌株的酶活比值減小,其余菌株的酶活比值都有所提高,其中Z-1的增幅最大,比出發(fā)菌株提高了60.6%。

表5　硫酸二乙酯誘變菌株的初篩結(jié)果Table 5　The result of primary screening by diethyl sulfate

表7　突變株DES-6不同代次的凝乳酶活力(SU/mL)Table 7　Milk-clotting activity of mutant DES-6 for different generation(SU/mL)

2.3硫酸二乙酯對(duì)菌株的誘變效應(yīng)

以Z-1為出發(fā)菌株,采用硫酸二乙酯誘變后,不同處理時(shí)間下致死率和正突變率的結(jié)果見表4。

表4　DES的誘變對(duì)菌株的影響Table 4　The effect of diethyl sulfate treatment on the strains

由表4可以看出,當(dāng)處理時(shí)間從40 min增加到90 min時(shí),菌體致死率逐漸增大,當(dāng)處理70 min時(shí)菌體的致死率為78.65%,處理90 min時(shí),菌體致死率接近90%。正突變率隨著處理時(shí)間的延長先增大后減小,處理70 min時(shí)正突變率最高(16.59%)。致死率和正突變率的變化趨勢與前期實(shí)驗(yàn)中對(duì)地衣芽孢桿菌誘變時(shí)基本相同,說明兩株細(xì)菌對(duì)硫酸二乙酯的敏感度接近[18]。綜合考慮,在本實(shí)驗(yàn)中選擇60 min為硫酸二乙酯誘變的最佳處理時(shí)間。

2.4硫酸二乙酯誘變的初篩及復(fù)篩結(jié)果

菌株經(jīng)硫酸二乙酯誘變后,涂布于分離平板上培養(yǎng),待長出菌落后測定凝乳圈直徑、菌落直徑,部分菌株的測定結(jié)果見表5。

由表5可以看出,突變株L-1、L-3、L-4、L-8、L-9和L-10的凝乳圈直徑與菌落直徑比值減小,其余菌株凝乳圈直徑與菌落直徑比值都小幅度增大,L-6的增大幅度最大,比出發(fā)菌株增大2.01%。

將凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的菌株發(fā)酵后測定凝乳活力和蛋白水解力,結(jié)果見表6。

從表6中的測定結(jié)果來看,凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的幾株菌的凝乳活力均比出發(fā)菌株有所提高,其中菌株L-2、L-6的凝乳活力比出發(fā)菌株增大較多,分別比原菌株提高了8.9%和13.9%;菌株的水解活力變化不大,其中L-7水解活力反而比出發(fā)菌株增大了9.9%;從凝乳活力與蛋白水解活力的比來看,4株菌的酶活比都有所提高,其中L-6的增幅最大,比出發(fā)菌株提高了13.11%。突變株L-6凝乳活力比原始菌株提高了40.2%,水解活力降低了22.39%,凝乳活力與蛋白水解活力的比值提高了81.32%。

表6　硫酸二乙酯誘變菌株的復(fù)篩結(jié)果Table 6　The result of secondary screening by diethyl sulfate

2.5突變株的遺傳穩(wěn)定性

將突變株L-6連續(xù)傳代8次,測定每代菌株的凝乳活力,每個(gè)代次三個(gè)平行,測定結(jié)果分別見表7。

由表7可以看出,傳代后菌株的酶活穩(wěn)定在1417.2～1428.7 SU/mL范圍內(nèi),說明不同傳代次數(shù)菌株的凝乳酶活力差異不顯著,因而突變株L-6具有穩(wěn)定的遺傳性。

3　結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)確定了解淀粉芽孢桿菌紫外線誘變最佳處理時(shí)間為60 s,硫酸二乙酯誘變的最佳處理時(shí)間為60 min。紫外誘變后,經(jīng)篩選得到的突變株Z-1凝乳活力提高了23.2%,水解活力降低了23.3%,凝乳活力與蛋白水解活力的比值比出發(fā)菌株提高了60.6%。

以Z-1為出發(fā)菌株,進(jìn)行硫酸二乙酯誘變后,篩選得到的突變株L-6凝乳活力比原始菌株提高了40.2%,水解活力降低了22.39%,凝乳活力與蛋白水解活力的比值提高了81.32%。其凝乳活力穩(wěn)定在1417.2～1428.7 SU/mL,菌株的遺傳性穩(wěn)定性良好。

[1]徐偉.微波誘變?nèi)樗岣弋a(chǎn)菌選育及淀粉廢水發(fā)酵制乳酸工藝研究[D].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué),2009.

[2]孟甜,李玉鋒.現(xiàn)代工業(yè)微生物育種技術(shù)研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)儀器,2009(7):3-6.

[3]章名春.工業(yè)微生物誘變育種[M].北京:科學(xué)出版社,1984:50-52.

[4]周俊清,林親錄,趙謀明.產(chǎn)高效凝乳酶菌株獲得方法的探討[J].食品科學(xué),2005,26(3):253-256.

[5]王明強(qiáng),張惟廣.發(fā)酵法生產(chǎn)凝乳酶的概述[J].四川食品與發(fā)酵,2008,44(2):21-24.

[6]趙輝,藺善喜,王葳,等.低高級(jí)醇啤酒酵母的選育及中試發(fā)酵[J].食品工業(yè)科技,2011,32(10):242-244.

[7]程明,崔承彬,李長偉,等.化學(xué)誘變技術(shù)在微生物育種研究中的應(yīng)用[J].國際藥學(xué)研究雜志,2009,36(6):412-417.

[8]陳志剛,巴吐爾,羅紅霞,等.硫酸二乙酯誘變選育弱后酸化保加利亞乳桿菌[J].食品研究與開發(fā),2009,30(6):52-55.

[9]邵淑娟.產(chǎn)疑乳酶霉菌菌種的誘變選育及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D].長春:吉林大學(xué),2011.

[10]謝維.果膠高效降解菌株的紫外誘變選育、生物特性及其生物脫膠應(yīng)用研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[11]溫?fù)碥?馮剛麗,鄢東,等.紫外線與硫酸二乙酯復(fù)合誘變選育酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株[J].釀酒科技,2011(5):50-52.

[12]廖亮.凝乳酶高產(chǎn)菌株的選育及其發(fā)酵條件、酶學(xué)活性的相關(guān)研究[D].北京:北京化工大學(xué),2010.

[13]施巧琴,吳松剛.工業(yè)微生物育種學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2013:69-71

[14]許建平,管江志,陳衛(wèi)良,等.枯草桿菌 B826的化學(xué)誘變及篩選研究[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,24(6):595-596.

[15]王艷,李大平,劉世貴.紫外和硫酸二乙酯誘變五株亞硝化單胞菌的硝化活力比較[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào),2003,40(1):181-183.

[16]李忠英,肖楊娟,羅躍中,等.UV與DES復(fù)合誘變選育高產(chǎn)脂肪酶菌株[J].氨基酸和生物資源,2011,33(3):6-9.

[17]袁軍,李國良,沈榕強(qiáng),等.豆豉溶栓酶產(chǎn)生菌Bacillus subtilisLD-8547 的誘變選育[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,34(6):1251-1255.

[18]張衛(wèi)兵,梁琪,喬海軍,等.紫外線和硫酸二乙酯誘變高產(chǎn)凝乳酶地衣芽孢桿菌的研究[J].食品工業(yè)科技2012,33(5):174-176.

[19]張衛(wèi)兵,甘伯中,梁琪,等.一株產(chǎn)凝乳酶解淀粉芽孢桿菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)[J].食品工業(yè)科技,2012,33(7):172-176,180.

Study on mutation breeding ofBacillusamyloliquefaciensproducing milk-clotting enzyme

GUAN Ming-ling1,2,LI Xue-peng1,2,YANG min2,3,ZHANG Zhong-ming1,ZHANG Wei-bing1,2,*,SHI Xi-xong1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Gansu provincial functional dairy engineering laboratory,Lanzhou 730070,China;3.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

To obtain an industrial strain with high milk-clotting activity,Bacillusamyloliquefaciensproducing milk-clotting enzyme was mutagenized with ultraviolet and diethyl sulfate. On the basis of multiple mutation,mutant DES-6 was screened. The milk-clotting activity of L-6 reached 1419.7 SU/mL,which was 40.2% higher than that of the parent strain,while the proteolytic activity was reduced by 22.39%. The ratio of milk-clotting activity to proteolytic activity reached 125.64,which was 81.32% higher than that of the parent strain. The pass-generation test indicated that DES-6 had good genetic stability.

Bacillusamyloliquefaciens;milk-clotting enzyme;mutation

2015-04-09

關(guān)明玲(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：乳品加工，E-mail:270154787@qq.com。

張衛(wèi)兵(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品微生物，E-mail:zhangwb@gsau.edu.cn。

師希雄(1977-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工，E-mail:shixx@gsau.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560442)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100903)；甘肅省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(GNCX-2014-31)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0156-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.025