大腸桿菌生產(chǎn)異戊二烯的代謝工程研究進(jìn)展

郭靜，曹玉錦，咸漠，劉會(huì)洲

1 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 2661012 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

綜 述

大腸桿菌生產(chǎn)異戊二烯的代謝工程研究進(jìn)展

郭靜1，2，曹玉錦1，咸漠1，劉會(huì)洲1

1 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101
2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

郭靜， 曹玉錦， 咸漠， 等. 大腸桿菌生產(chǎn)異戊二烯的代謝工程研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào)， 2016， 32（8）: 1026-1037.

Guo J， Cao YJ， Xian M， et al. Advances in metabolic engineering of Escherichia coli for isoprene biosynthesis. Chin J Biotech， 2016， 32（8）: 1026-1037.

異戊二烯作為一種重要的化工原料，主要用于合成橡膠。此外，還廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥或化工中間體、食品、粘合劑及航空燃料等領(lǐng)域。利用微生物法生產(chǎn)異戊二烯因具有環(huán)境友好、利用廉價(jià)的可再生原料、可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)勢(shì)而成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。這里介紹了大腸桿菌生產(chǎn)異戊二烯的代謝途徑及關(guān)鍵酶，從代謝工程的角度出發(fā)綜述了目前為提高大腸桿菌異戊二烯產(chǎn)量所應(yīng)用到的方法和策略，并對(duì)今后的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

異戊二烯，合成橡膠，大腸桿菌，代謝工程

隨著世界經(jīng)濟(jì)和汽車行業(yè)的迅猛發(fā)展，全球橡膠需求量不斷攀升。目前我國(guó)已經(jīng)成為世界上最大的橡膠消費(fèi)國(guó)，天然橡膠和合成橡膠的消費(fèi)量均位居世界第一［1］。根據(jù)美國(guó)行業(yè)研究機(jī)構(gòu)弗里多尼亞集團(tuán) （Freedonia） 2015年發(fā)布的預(yù)測(cè)報(bào)告，中國(guó)對(duì)橡膠制品的需求量預(yù)計(jì)將以每年8.8%的速率增長(zhǎng)，到2017年將達(dá)到7 400億元人民幣。輪胎行業(yè)仍將是最大的橡膠產(chǎn)品部門。天然橡膠的供應(yīng)受社會(huì)環(huán)境，地理位置和氣候條件等多種因素影響，其價(jià)格走勢(shì)很難把握，對(duì)下游生產(chǎn)成本影響很大。異戊二烯 （2-甲基-1，3-丁二烯） 橡膠作為一種合成橡膠，在供應(yīng)上比較穩(wěn)定，價(jià)格也有規(guī)律可循，而且聚異戊二烯橡膠的綜合性能優(yōu)異，最接近天然橡膠。因此，輪胎、制鞋等行業(yè)對(duì)異戊二烯橡膠有著強(qiáng)烈的需求。

異戊二烯是聚異戊二烯橡膠的重要單體，其成本占總生產(chǎn)成本的 70%以上。因此，能否提供價(jià)格低廉、供應(yīng)穩(wěn)定的異戊二烯單體對(duì)橡膠行業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。目前，異戊二烯的制備主要有石油基原料異戊烷、異戊烯脫氫法、化學(xué)合成法 （包括丙烯二聚法、乙炔-丙酮法、異丁烯-甲醛法） 和裂解 C5餾分萃取蒸餾法等［2-3］。然而，隨著化石資源的日益枯竭和價(jià)格的不斷攀升，原料供給問題必然成為制約異戊二烯生產(chǎn)的重要瓶頸。另外，化學(xué)法制備異戊二烯的過程中普遍存在能耗高、工藝復(fù)雜、對(duì)設(shè)備要求高、環(huán)境污染嚴(yán)重和產(chǎn)物收率低等問題，制約著異戊二烯工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展［4-5］。因此，尋找可持續(xù)的異戊二烯生產(chǎn)方式是今后異戊二烯工業(yè)生產(chǎn)的重要發(fā)展趨勢(shì)。

與傳統(tǒng)化學(xué)法相比，以生物轉(zhuǎn)化和生物催化為核心的微生物發(fā)酵法具有環(huán)境友好、利用廉價(jià)的可再生原料和可持續(xù)發(fā)展等優(yōu)勢(shì)。因此，微生物合成成為異戊二烯制備領(lǐng)域的重要研究方向。這篇文章介紹了微生物法生產(chǎn)異戊二烯的代謝途徑和關(guān)鍵酶，并綜述了大腸桿菌生產(chǎn)異戊二烯的研究進(jìn)展，總結(jié)了影響異戊二烯產(chǎn)量的關(guān)鍵酶及改造方式，指導(dǎo)碳代謝流向目標(biāo)產(chǎn)物異戊二烯，為構(gòu)建異戊二烯高產(chǎn)工程菌株提供參考。

1　微生物產(chǎn)異戊二烯的代謝途徑及關(guān)鍵酶

類異戊二烯化合物生物合成的前體物質(zhì)是異戊烯基焦磷酸 （IPP） 和其異構(gòu)體 3，3-二甲基烯丙基焦磷酸 （DMAPP）。自然界中合成這兩種前體物質(zhì)的代謝途徑有兩種 （圖1）［6］：一種是甲羥戊酸 （MVA） 代謝途徑，主要存在于原核細(xì)胞、藻類及高等植物的葉綠體中；另一種是4-磷酸甲基赤藻糖醇 （MEP） 代謝途徑，主要存在于真核細(xì)胞、古細(xì)菌和高等植物的胞液中［6-10］。

1.1M EP代謝途徑及關(guān)鍵酶

圖1　類異戊二烯生物合成途徑(MVA途徑和MEP途徑)Fig. 1 Biosynthetic pathway of isoprenoids （MVA pathway and MEP pathway）.

上世紀(jì)90年代初，人們才從細(xì)菌和植物中發(fā)現(xiàn)了MEP代謝途徑［11-12］。直到2001年，MEP途徑中的基因才被完全鑒定出來［8］。雖然 MVA途徑和MEP途徑都起始于中心碳代謝中間體，但不同于MVA途徑 （以乙酰輔酶A為起始物），MEP途徑的起始反應(yīng)物是丙酮酸和 3-磷酸甘油醛，二者縮合生成 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸（DXP），這一步反應(yīng)由DXP合成酶 （DXS） 催化完成，也是MEP途徑的第一個(gè)限速酶。DXP在5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶 （DXR） 的催化下經(jīng)重排和還原生成MEP，DXR的催化活性需要NADPH和二價(jià)金屬離子 （M g2+，Mn2+，Co2+）作為輔因子，這是MEP途徑的第二個(gè)限速反應(yīng)。接下來，MEP與CMP在ispD酶催化下偶聯(lián)生成 4-（胞嘧啶-5'-磷酸）-2-C-甲基-D-赤藻糖醇（CDP-ME），C2的羥基被磷酸化，脫去CMP并生成 2-C-甲基-D-赤藻糖醇 2，4-環(huán)焦磷酸（MECDP），再還原成 1-羥基-2甲基-2-（E）-丁烯基-4-焦磷酸，最后經(jīng)一步反應(yīng)生成 IPP和DMAPP。MEP轉(zhuǎn)化為IPP和DMAPP經(jīng)過了5步反應(yīng)，依次由ispD、ispE、ispF、ispG和ispH酶催化完成。目前對(duì)大腸桿菌MEP途徑的研究發(fā)現(xiàn)，該途徑存在嚴(yán)格的內(nèi)源調(diào)控機(jī)制，可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄中、轉(zhuǎn)錄后、翻譯后、前體物質(zhì)的生成與消耗、變構(gòu)調(diào)節(jié)、代謝反饋和前饋等不同水平上，然而其調(diào)控機(jī)理尚不清楚。

1.2MVA代謝途徑及關(guān)鍵酶

在MVA途徑中，起始反應(yīng)物乙酰輔酶A在乙酰輔酶A硫解酶 （AACT） 和HMG-CoA合成酶 （HMGS） 的催化下縮合生成 β-羥基-β甲基戊二酰輔酶A （HMG-CoA）。接著，HMG-CoA 在HMG-CoA還原酶 （HMGR） 的作用下生成甲羥戊酸 （MVA）［13］，至此為 MVA上游途徑（MVA upper pathway）。MVA經(jīng)焦磷酸化和脫羧作用形成IPP，經(jīng)異構(gòu)化轉(zhuǎn)化為DMAPP，至此為MVA下游代謝途徑 （MVA lower pathway），共4步反應(yīng)，需要甲羥戊酸激酶 （MK）、磷酸甲羥戊酸激酶 （PMK）、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶（MVD） 和異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶 （IDI） 的催化完成。

1.3異戊二烯合成酶

異戊二烯合成酶 （EC 4.2.3.27） 能催化DMAPP轉(zhuǎn)化為異戊二烯。1957年，Sanadze第一次發(fā)現(xiàn)植物釋放異戊二烯［14］，然而關(guān)于異戊二烯合成酶的研究相對(duì)較晚。2001年，M iller等首次從楊樹 （Populus alba×Populus tremula）中分離到異戊二烯合成酶 （ispS） 并在大腸桿菌中表達(dá)［15］。2005年Sasaki等從P. alba分離到異戊二烯合成酶 （PaIspS） 并進(jìn)行了酶學(xué)特征研究，結(jié)果表明其特異性底物為DMAPP［16］。接著，Sharkey等從葛根kudzu vine （Pueraria montana）中分離了異戊二烯合成酶基因［17］。最近，Ilmén等從甘薯 Ipomoea batatas、芒果 Mangifera indica和杜英Elaeocarpus photiniifolius中分離到 3種新的異戊二烯合成酶基因，它們與無?；礠uercus petraea ispS的序列相似度分別為55%、65%和 60%［18］。分別將這 3種新的 ispS以及楊樹 （P. alba） 和葛根 （P. montana） 的ispS在大腸桿菌中過表達(dá)，通過測(cè)定異戊二烯的產(chǎn)量對(duì)不同來源ispS的催化效率進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明甘薯ispS催化活性最高。

2　微生物法合成異戊二烯的代謝改造策略

大腸桿菌具有合成異戊二烯前體物質(zhì)DMAPP的MEP代謝途徑，但是自身缺少異戊二烯合成酶，不能在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生異戊二烯。因此，需要利用代謝工程手段對(duì)微生物的代謝途徑進(jìn)行改造，以提高異戊二烯的生物轉(zhuǎn)化效率。大腸桿菌不僅是第一個(gè)被改造生產(chǎn)異戊二烯的微生物，而且是當(dāng)下異戊二烯產(chǎn)量最高的工程菌株［19］。其他微生物 （包括釀酒酵母、泛菌、解脂耶氏酵母、里氏木霉以及鏈霉菌等） 也都進(jìn)行了異戊二烯生物合成途徑的代謝工程研究［20-22］，但其異戊二烯產(chǎn)量都低于工程大腸桿菌。因此，本文著重介紹和總結(jié)了大腸桿菌異戊二烯合成途徑的代謝改造策略。

2.1大腸桿菌異源表達(dá)異戊二烯合成酶

自然界中有些微生物可以合成異戊二烯［23-24］，其中枯草芽孢桿菌為異戊二烯產(chǎn)量最高的天然菌［25-26］，但是目前還沒有從微生物中分離到異戊二烯合成酶基因，人們獲得的ispS全部來源于植物。因此，對(duì)大腸桿菌異戊二烯合成途徑的第一個(gè)改造策略就是將植物來源的ispS在大腸桿菌中過表達(dá)。M iller等首次將楊樹 ispS在大腸桿菌中過表達(dá)，異戊二烯產(chǎn)量提高了 1.85倍［15］。由于天然的植物異戊二烯合成酶 cDNA序列密碼子偏好性與大腸桿菌有差異，為了使其在大腸桿菌中高效表達(dá)，蘇思正等按照大腸桿菌偏好密碼子進(jìn)行優(yōu)化后利用化學(xué)方法合成，并且去掉編碼信號(hào)肽部分的氨基酸的核苷酸序列，該重組異戊二烯合成酶能夠催化異戊二烯的合成，重組菌的異戊二烯產(chǎn)量可達(dá)到60 μg/L［27］。但僅僅過表達(dá)異源異戊二烯合成酶的大腸桿菌異戊二烯產(chǎn)量還是很低。為了進(jìn)一步提高異戊二烯的產(chǎn)量，需要用其他代謝工程手段對(duì)大腸桿菌進(jìn)行改造。

2.2大腸桿菌MEP代謝途徑改造策略

在大腸桿菌MEP途徑中，催化前兩步反應(yīng)的DXS和DXR是關(guān)鍵限速酶，DXS和DXR的高效表達(dá)可以提高類異戊二烯的產(chǎn)量［28-31］。Zhao等將來自大腸桿菌自身的DXS、DXR和來自黑楊Populus nigra的ispS在大腸桿菌中過表達(dá)，異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到160 mg/L［32］。而異源表達(dá)枯草芽孢桿菌MEP途徑中的關(guān)鍵酶DXS和DXR使異戊二烯產(chǎn)量進(jìn)一步提高到314 mg/L，提高了兩倍。另一方面，代謝中IPP和DMAPP在異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶的作用下相互轉(zhuǎn)化，而DMAPP在ispS的催化作用下生成異戊二烯。因此，過表達(dá)異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶可以提高異戊二烯的產(chǎn)量［22-33］。杰能科 （Genencor） 的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)DXS、IDI和葛根ispS的工程大腸桿菌異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到300 mg/L，相比于只過表達(dá)了ispS基因的大腸桿菌，異戊二烯產(chǎn)量提高了5-12倍［22］。本課題組劉敏和楊建明等將來自大腸桿菌的異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶基因（IDI） 和來自枯草芽孢桿菌的異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶基因 （FNI） 構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，并在大腸桿菌中異源過量表達(dá)［34］。研究發(fā)現(xiàn)，來自枯草芽孢桿菌 FNI具有更高的催化活性，異戊二烯的產(chǎn)量由0.80 mg/L提高到2.96 mg/L。由以上研究結(jié)果可以推測(cè)，大腸桿菌中表達(dá)異源基因有利于提高酶的催化活性，其原因可能是提高了酶自身的催化活性，也可能是避免了MEP途徑的內(nèi)源調(diào)控機(jī)制。

2.3大腸桿菌MVA代謝途徑改造策略

從理論計(jì)算結(jié)果來看，以葡萄糖為底物時(shí)MEP途徑的異戊二烯產(chǎn)率 （30.2%） 要高于MVA途徑 （25.2%）［19］，但是由于MEP途徑研究較晚，代謝中相關(guān)酶的功能及其調(diào)控機(jī)制研究不透徹使得整個(gè)途徑催化效率不高［35］。盡管上述研究取得了一些進(jìn)展，但是由于內(nèi)源MEP代謝途徑的調(diào)控機(jī)制限制了異戊二烯的最終產(chǎn)量。為了避免大腸桿菌自身MEP途徑的內(nèi)源調(diào)控機(jī)制限制，研究者開辟了新的途徑，在大腸桿菌中異源表達(dá)部分或完整的MVA途徑，提高細(xì)胞內(nèi)萜烯前體物質(zhì) （DMAPP） 的濃度，進(jìn)而提高類異戊二烯的產(chǎn)量。2003年，Martin等首次在大腸桿菌中過表達(dá)了釀酒酵母的 MVA途徑和紫穗槐-4，11-二烯合酶提高了萜類物質(zhì)青蒿酸的產(chǎn)量［36］。Pitera等在研究中發(fā)現(xiàn)，雖然在大腸桿菌中異源表達(dá) MVA途徑可以提高萜類物質(zhì)的產(chǎn)量，但是細(xì)胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物HMG-CoA的大量積累會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過調(diào)節(jié)HMGR的表達(dá)量可以解決代謝途徑中的瓶頸限制，提高上游途徑的MVA產(chǎn)量［37］。Anthony等發(fā)現(xiàn)MK是大腸桿菌MVA途徑中的限速酶，使用強(qiáng)啟動(dòng)子和高拷貝的質(zhì)粒提高M(jìn)K的表達(dá)量，萜類物質(zhì)青蒿酸的產(chǎn)量提高了 7倍［38］。隨后，定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析也表明 MVA下游途徑中的MK和PMK是代謝瓶頸［39］。M a等對(duì)含有整個(gè)釀酒酵母 MVA途徑的工程大腸桿菌進(jìn)行了優(yōu)化，通過選擇合適酶活性質(zhì)的HMGR和提高細(xì)胞內(nèi)還原當(dāng)量，萜類物質(zhì)青蒿酸的產(chǎn)量提高了120%［40］。另一方面，細(xì)胞內(nèi)異戊二烯前體物質(zhì)IPP和DMAPP的過量積累會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。這主要是由于下游的異戊二烯合成酶催化活性不高所造成的，為了減少或避免中間代謝產(chǎn)物濃度過高的毒性作用，必須提高異戊二烯合成酶的催化效率。有文獻(xiàn)指出，利用蛋白工程手段可以提高異戊二烯合成酶的催化活性，但目前尚無詳細(xì)的研究報(bào)道［4］。由以上研究報(bào)道可以看出，盡管在大腸桿菌中構(gòu)建MVA代謝途徑比其自身MEP途徑更有效地合成了類異戊二烯化合物，但整個(gè)代謝途徑涉及多個(gè)編碼基因的表達(dá)，使用了多個(gè)重組質(zhì)粒的表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)完整的代謝通路構(gòu)建，這就涉及到不同表達(dá)模塊在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控。馮凡等基于蛋白質(zhì)預(yù)算理論的指導(dǎo)，通過優(yōu)化質(zhì)?？截悢?shù)和稀有密碼子來調(diào)控系統(tǒng)內(nèi)關(guān)鍵限速酶編碼基因的表達(dá)量，在搖瓶發(fā)酵水平上使異戊二烯產(chǎn)量比對(duì)照菌株提高了73%，達(dá)到了761.1 mg/L［41］。此外，異源基因來源不同表達(dá)效率也不同。Yoon等評(píng)價(jià)了不同微生物來源 （包括肺炎鏈球菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌及釀酒酵母） 的MVA上下游途徑基因在大腸桿菌中表達(dá)后的生物轉(zhuǎn)化效率，其中糞腸球菌的上游MVA途徑和肺炎鏈球菌的MVA下游途徑轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高［42］。本課題組楊建明等在大腸桿菌中構(gòu)建了完整的釀酒酵母MVA途徑，同時(shí)過表達(dá)了白楊ispS，在發(fā)酵罐水平48 h發(fā)酵后異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到532 mg/L［43］。雖然比利用MEP途徑的產(chǎn)量有所提高，但是離工業(yè)化還相差甚遠(yuǎn)。造成目標(biāo)產(chǎn)量低的原因可能是MVA途徑中存在限速步驟。因此，楊建明等將釀酒酵母MVA下游基因和ispS基因在大腸桿菌中過表達(dá)，考察了添加外源 MVA對(duì)該菌株異戊二烯產(chǎn)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異戊二烯產(chǎn)量隨著加入MVA濃度的增加而增加，說明MVA下游途徑具有很高的轉(zhuǎn)化效率。然而異源表達(dá)釀酒酵母MVA上游途徑僅產(chǎn)生了低濃度的MVA。以上研究表明，MVA上游途徑是整個(gè)MVA途徑的限速步驟。為了優(yōu)化MVA代謝途徑，將來自糞腸球菌和釀酒酵母的 MVA上游途徑的轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)來自糞腸球菌的MVA上游途徑轉(zhuǎn)化效率較高，其產(chǎn)生的MVA濃度比釀酒酵母MVA上游途徑提高了50倍［44］，這與Yoon等的研究結(jié)果相一致。此外，本課題組還發(fā)現(xiàn)表達(dá)宿主的選擇對(duì)異戊二烯的產(chǎn)量也有影響，同等條件下，BL21 starTM（DE3） 的異戊二烯產(chǎn)量最高，其次是BL21 （DE3），JM 109 （DE3） 產(chǎn)量最低。因此，在大腸桿菌BL21 starTM（DE3） 中過表達(dá)糞腸球菌MVA上游途徑、釀酒酵母的MVA下游途徑以及白楊ispS，經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h后異戊二烯產(chǎn)量進(jìn)一步提高到1 091 mg/L。在發(fā)酵罐水平經(jīng)48 h的誘導(dǎo)培養(yǎng)，異戊二烯累積濃度達(dá)到6.3 g/L，從葡萄糖到異戊二烯的轉(zhuǎn)化效率為7%，達(dá)到理論轉(zhuǎn)化率的28%。

杰能科公司和美國(guó)固特異輪胎與橡膠公司（Goodyear Tire & Rubber Company） 在異戊二烯的生物合成中做了大量工作［4］。他們?cè)诖竽c桿菌中過表達(dá)了來自糞腸球菌的mvaS和mvaE基因（MVA上游途徑基因） 和來自釀酒酵母的MK、PMK、MVD和IDI基因 （MVA下游途徑基因），以及來自葛根的異戊二烯合成酶基因，該工程菌株的異戊二烯產(chǎn)量比MEP途徑工程菌株提高了3倍，40 h的發(fā)酵培養(yǎng)可以產(chǎn)生20 g/L的異戊二烯［45］。在此基礎(chǔ)上，他們過表達(dá)了對(duì)下游產(chǎn)物法尼烯基焦磷酸 （FPP） 反饋抑制作用不敏感的馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶 MK和楊樹的 ispS。在批次發(fā)酵中，該工程菌株的異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到35 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化為異戊二烯的產(chǎn)率為5.2%，該菌株比只表達(dá)了ispS基因的工程大腸桿菌異戊二烯產(chǎn)量提高了73倍，而相比于含有MEP途徑的工程菌株，異戊二烯產(chǎn)量提高了10-20倍。雖然研究表明糞腸球菌MVA上游途徑轉(zhuǎn)化效率最高，但是將其基因整合到大腸桿菌染色體上之后 MVA途徑的轉(zhuǎn)化效率受到了下游途徑的限制。

2.4中心碳代謝流改造策略

MVA途徑反應(yīng)的起始物是乙酰輔酶A，經(jīng)兩步反應(yīng)使3分子的乙酰輔酶A縮合成HMG-CoA。而在微生物代謝過程中還存在其他消耗乙酰輔酶A的代謝支路，減少這些途徑對(duì)乙酰輔酶A的消耗，保證細(xì)胞內(nèi)足夠的乙酰輔酶A供給是提高M(jìn)VA途徑轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一。另一方面，減少其他途徑的碳源消耗，為MVA途徑提供更多的還原力，也是提高M(jìn)VA途徑轉(zhuǎn)化效率的重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶 （pgl） 可以提高戊糖磷酸途徑的效率，促進(jìn)NADPH的生成，從而提供給糞腸球菌HMGR更多的還原力。將 pgl和密碼子優(yōu)化的ispS、完整的MVA途徑以及馬氏甲烷八疊球菌甲羥戊酸激酶 MK在大腸桿菌中過表達(dá)，經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化后，該工程菌株異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到了79 g/L，轉(zhuǎn)化率為10.2%［5］。在此基礎(chǔ)上，將檸檬酸合成酶基因 gltA表達(dá)下調(diào)，敲除磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶pgl并過表達(dá)磷酸轉(zhuǎn)酮酶pkl基因，從而提高中心碳源代謝流中木酮糖-5-磷酸轉(zhuǎn)化為甘油醛-3-磷酸的效率，為MVA途徑提供更多的前體物質(zhì)，提高異戊二烯產(chǎn)量［19］。在這個(gè)策略中，pkl起到了關(guān)鍵作用，將鶉雞腸球菌的pkl基因在含有MVA途徑的大腸桿菌中過表達(dá)，同時(shí)過表達(dá)密碼子優(yōu)化后的白楊 ispS，異戊二烯產(chǎn)量達(dá)到123.6 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到16.3%，是目前報(bào)道的異戊二烯最高產(chǎn)量。表 1對(duì)目前大腸桿菌生產(chǎn)異戊二烯的代謝改造策略及其產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率進(jìn)行了總結(jié)。

2.5下游異戊烯基磷酸鹽的反饋抑制調(diào)控策略

以IPP和DMAPP為起始物，在MEP和MVA途徑中還存在著下游異戊烯基磷酸鹽代謝途徑 （圖 2）［49］。根據(jù)微生物體內(nèi)異戊烯轉(zhuǎn)移酶的不同而產(chǎn)生不同的異戊烯基磷酸鹽。相比于異戊烯轉(zhuǎn)移酶，異戊二烯合成酶IspS的Km（DMAPP）較高，微生物代謝產(chǎn)生的大量 IPP和 DMAPP將更傾向于作為下游異戊烯基磷酸鹽合成的前體物質(zhì)，從而對(duì)異戊二烯的合成途徑產(chǎn)生反饋抑制作用。為了降低異戊烯基磷酸鹽的積累，將單萜和半萜合成酶與ispS在含有MVA途徑的工程大腸桿菌內(nèi)共表達(dá)可以提高異戊二烯的產(chǎn)量，該策略已經(jīng)應(yīng)用于目前異戊二烯產(chǎn)量最高的工程菌株中［19］。

表1　大腸桿菌代謝工程改造策略及其異戊二烯產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率Tab le 1 M etabolic engineering of Escherichia coli and their isop rene p roduction and yield

圖2　下游異戊烯基磷酸鹽代謝途徑Fig. 2 Downstream prenyl phosphate metabolism.

3　總結(jié)與展望

縱觀國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，盡管微生物法生產(chǎn)異戊二烯的研究取得了一定的進(jìn)展，但微生物生產(chǎn)異戊二烯的代謝工程技術(shù)中仍有許多工作有待進(jìn)一步研究。異戊二烯的生物合成代謝途徑和調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，大腸桿菌自身MEP途徑的內(nèi)源調(diào)控機(jī)制限制了異戊二烯的產(chǎn)量。雖然目前已經(jīng)將完整的外源 MVA代謝途徑在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，但由于所需的編碼酶基因較多，只通過一個(gè)載體的表達(dá)系統(tǒng)很難將整個(gè)代謝通路完全構(gòu)建成功，需要使用多個(gè)重組質(zhì)粒完成整個(gè)MVA代謝途徑的構(gòu)建，這其中就涉及到多個(gè)表達(dá)模塊在細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控。過表達(dá)代謝系統(tǒng)中某一個(gè)或幾個(gè)酶不僅無法使目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量明顯提高，還很可能造成細(xì)胞毒性作用。只有使整個(gè)系統(tǒng)內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)處于相對(duì)平衡狀態(tài)，異戊二烯的產(chǎn)量才會(huì)得到提高。另一方面，雖然本文并未涉及發(fā)酵控制方面的研究，但是就整個(gè)生物轉(zhuǎn)化過程而言，發(fā)酵控制點(diǎn)的研究和菌株的代謝改造同樣對(duì)轉(zhuǎn)化效率有很大的影響。應(yīng)根據(jù)微生物的代謝特性，對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行代謝調(diào)控，合理地設(shè)計(jì)發(fā)酵工藝，增加異戊二烯代謝途徑的代謝流分配，使底物最大程度地轉(zhuǎn)化為異戊二烯，減少代謝過程中碳源以其他途徑的損耗 （如降低CO2的排放等）。

REFERENCES

［1］ Wang QF， Yu Y， Zhang HB， et al. Analysis of prospects for developing isoprene rubber in China. Sino-Global Energy， 2011， 16（8）: 68-71 （in Chinese）.

王啟飛， 于洋， 張紅兵， 等. 我國(guó)發(fā)展異戊二烯橡膠前景分析. 中外能源， 2011， 16（8）: 68-71.

［2］ Yue P. Production technology and market analysis of isoprene. Ref Chem Ind， 2006， 17（2）: 3-5 （in Chinese）.

岳鵬. 異戊二烯的生產(chǎn)技術(shù)及市場(chǎng)分析. 煉油與化工， 2006， 17（2）: 3-5.

［3］ Zhang HF， Sheng YN， Fu Y， et al. Preparation and application of isoprene. Technol Dev Chem Ind，2011， 40（10）: 35-41 （in Chinese）.

張慧芳， 盛永寧， 付燕， 等. 異戊二烯的制備及其應(yīng)用. 化工技術(shù)與開發(fā)， 2011， 40（10）: 35-41.

［4］ Whited GM， Feher FJ， Benko DA， et al. Development of a gas-phase bioprocess for isoprene-monomer production using metabolic pathway engineering. Ind Biotechnol， 2010， 6（3）: 152-163.

［5］ Beck ZQ， Cervin MA， Nielsen AT， et al. Compositions and methods of PGL for the increased production of isoprene: US， 8455236 B2. 2013-06-04.

［6］ Zurbriggen A， Kirst H， Melis A. Isoprene production via the mevalonic acid pathway in Escherichia coli （Bacteria）. Bioenerg Res， 2012，5（4）: 814-828.

［7］ Kuzuyama T. Mevalonate and nonmevalonate pathways for the biosynthesis of isoprene units. Biosci Biotechnol Biochem， 2002， 66（8）: 1619-1627.

［8］ Rodríguez-Concepción M， Boronat A. Elucidation of the methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria and plastids. A metabolic m ilestone achieved through genom ics. Plant Physiol， 2002， 130（3）: 1079-1089.

［9］ Rohmer M. Mevalonate-independent methylerythritol phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis. Elucidation and distribution. Pure Appl Chem，2003， 75（2/3）: 375-388.

［10］ Eisenreich W， Bacher A， Arigoni D， et al. Biosynthesis of isoprenoids via the non-mevalonate pathway. Cell Mol Life Sci， 2004， 61（12）: 1401-1426.

［11］ Rohmer M， Knani M， Simonin P， et al. Isoprenoid biosynthesis in bacteria: a novel pathway for the early steps leading to isopentenyl diphosphate. Biochem J， 1993， 295（Pt 2）: 517-524.

［12］ Schwarz KM. Terpen-biosynthese in Ginkgo biloba: eine Uberraschende geschichte. Zurich，Sw itzerland: Eidgenossischen Technischen Hochschule， 1994.

［13］ Kalita R， Patar L， Shasany AK， et al. Molecular cloning， characterization and expression analysis of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene from Centella asiatica L. Mol Biol Rep， 2015，42（9）: 1431-1439.

［14］ Sanadze JA. Em ission of organic matters by leaves of Robinia pseudoacacia L. Soobshch Akad Nauk Gruz SSR， 1957， 19: 83-86.

［15］ M iller B， Oschinski C， Zimmer W. First isolation of an isoprene synthase gene from poplar and successful expression of the gene in Escherichia coli. Planta， 2001， 213（3）: 483-487.

［16］ Sasaki K， Ohara K， Yazaki K. Gene expression and characterization of isoprene synthase from Populus alba. FEBS Lett， 2005， 579（11）: 2514-2518.

［17］ Sharkey TD， Yeh S， W iberley AE， et al. Evolution of the isoprene biosynthetic pathway in kudzu. Plant Physiol， 2005， 137（2）: 700-712.

［18］ Ilmén M， Oja M， Huuskonen A， et al. Identification of novel isoprene synthases through genome mining and expression in Escherichia coli. Metab Eng， 2015， 31: 153-162.

［19］ Beck ZQ， Eliot AC， Peres CM， et al. Utilization of phosphoketolase in the production of mevalonate，isoprenoid precursors， and isoprene: US，20130089906. 2013-04-11.

［20］ Hong SY， Zurbriggen AS， Melis A. Isoprene hydrocarbons production upon heterologous transformation of Saccharomyces cerevisiae. J Appl M icrobiol， 2012， 113（1）: 52-65.

［21］ Hayashi Y， Harada M， Takaoka S， et al. Isoprene synthase and gene encoding the same， and method for producing isoprene monomer: US，20140113344. 2014-04-24.

［22］ Calabria AR， Cervin MA， Chotani GK， et al. Compositions and methods for producing isoprene free of C5 hydrocarbons under decoupling conditions and/or safe operating ranges: US，20140155660. 2014-06-05.

［23］ Berenguer JA， Calderon V， Herce MD， et al. Spoilage of a bakery product by isoprene-producing molds. Rev Agroquim Technol A liment， 1991， 31: 580-583.

［24］ Kuzma J， Nemecek-Marshall M， Pollock WH， et al. Bacteria produce the volatile hydrocarbon isoprene. Curr M icrobiol， 1995， 30（2）: 97-103.

［25］ Julsing MK， Rijpkema M， Woerdenbag HJ， et al. Functional analysis of genes involved in the biosynthesis of isoprene in Bacillus subtilis. Appl M icrobiol Biotechnol， 2007， 75（6）: 1377-1384.

［26］ Sivy TL， Shirk MC， Fall R. Isoprene synthase activity parallels fluctuations of isoprene release during grow th of Bacillus subtilis. Biochem Biophys Res Commun， 2002， 294（1）: 71-75.

［27］ Su SZ， Liu JZ， Yang JM， et al. Expression of isoprene synthase in Escherichia coli for isoprene production. Chin J Bioprocess Eng， 2011， 9（3）: 6-10 （in Chinese）.

蘇思正， 劉建忠， 楊建明， 等. 異戊二烯合成酶（IspS） 在大腸桿菌中的表達(dá)及其產(chǎn)異戊二烯的研究. 生物加工過程， 2011， 9（3）: 6-10.

［28］ A lbrecht M， M isawa N， Sandmann G. Metabolic engineering of the terpenoid biosynthetic pathway of Escherichia coli for production of the carotenoids β-carotene and zeaxanthin. Biotechnol Lett， 1999， 21（9）: 791-795.

［29］ Harker M， Bram ley PM. Expression of prokaryotic 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatases in Escherichia coli increases carotenoid and ubiquinone biosynthesis. FEBS Lett， 1999， 448（1）: 115-119.

［30］ Wang CW， Oh MK， Liao JC. Engineered isoprenoid pathway enhances astaxanthin production in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng，1999， 62（2）: 235-241.

［31］ Rodríguez-Villalón A， Pérez-Gil J. Rodríguez-Concepción M. Carotenoid accumulation in bacteria w ith enhanced supply of isoprenoid precursors by upregulation of exogenous or endogenous pathways. J Biotechnol， 2008， 135（1）: 78-84.

［32］ Zhao YR， Yang JM， Qin B， et al. Biosynthesis of isoprene in Escherichia coli via methylerythritol phosphate （MEP） pathway. Appl M icrobiol Biotechnol， 2011， 90（6）: 1915-1922.

［33］ Bott RR， Cervin MA， Kellis Jr. JT， et al. Isoprene synthase variants for improved m icrobial production of isoprene: US， 8173410. 2012-05-08.

［34］ Liu M， Liu JZ， Feng HR， et al. Expression of isopentenyl diphosphate isomerase and confirmation of its catalytic effect. J Wuhan Univ Sci Technol， 2013， 36（3）: 214-218 （in Chinese）.

劉敏， 劉建忠， 馮紅茹， 等. 異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶的表達(dá)及其催化功能驗(yàn)證. 武漢科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 36（3）: 214-218.

［35］ Steinbüchel A. Production of rubber-like polymers by m icroorganisms. Curr Opin M icrobiol， 2003，6（3）: 261-270.

［36］ M artin VJJ， Pitera DJ， W ithers ST， et al. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat Biotechnol，2003， 21（7）: 796-802.

［37］ Pitera DJ， Paddon CJ， Newman JD， et al. Balancing a heterologous mevalonate pathway for improved isoprenoid production in Escherichia coli. Metab Eng， 2007， 9（2）: 193-207.

［38］ Anthony JR， Anthony LC， Now roozi F， et al. Optimization of the mevalonate-based isoprenoidbiosynthetic pathway in Escherichia coli for production of the anti-malarial drug precursor amorpha-4， 11-diene. Metab Eng， 2009， 11（1）: 13-19.

［39］ Redding-Johanson AM， Batth TS， Chan R， et al. Targeted proteom ics for metabolic pathway optimization: application to terpene production. Metab Eng， 2011， 13（2）: 194-203.

［40］ Ma SM， Garcia DE， Redding-Johanson AM， et al. Optim ization of a heterologous mevalonate pathway through the use of variant HMG-CoA reductases. M etab Eng， 2011， 13（5）: 588-597.

［41］ Feng F， Xu Y， Tao Y， et al. Improving isoprene production by engineered heterologous mevalonate pathway in Escherichia coli. Chin J Biotech， 2015，31（7）: 1073-1081 （in Chinese）.

馮凡， 許楊， 陶勇， 等. 提高大腸桿菌通過 MVA途徑合成異戊二烯. 生物工程學(xué)報(bào)， 2015， 31（7）: 1073-1081.

［42］ Yoon SH， Lee SH， Das A， et al. Combinatorial expression of bacterial whole mevalonate pathway for the production of β-carotene in E. coli. J Biotechnol， 2009， 140（3/4）: 218-226.

［43］ Yang JM， Zhao G， Sun YZ， et al. Bio-isoprene production using exogenous MVA pathway and isoprene synthase in Escherichia coli. Bioresour Technol， 2012， 104: 642-647.

［44］ Yang JM， Xian M， Su SZ， et al. Enhancing production of bio-isoprene using hybrid MVA pathway and isoprene synthase in E. coli. PLoS ONE， 2012， 7（4）: e33509.

［45］ Cervin MA， Whited GM， Chotani GK， et al. Compositions and methods for producing isoprene: US， 20090203102 A1. 2009-08-13.

［46］ Liu CL， Fan LH， Liu L， et al. Combinational biosynthesis of isoprene by engineering the MEP pathway in Escherichia coli. Process Biochem，2014， 49（12）: 2078-2085.

［47］ Chotani GK， Nielsen A， Sanford KJ. Reduction of carbon dioxide em ission during isoprene production by fermentation: US， 20100167370 A1. 2010-07-01.

［48］ Beck ZQ， Calabria AR， M iller MC， et al. Increased isoprene production using mevalonate kinase and isoprene synthase: US， 20100184178 A1. 2010-07-22.

［49］ Vickers CE， Sabri S. Isoprene. Adv Biochem Eng Biotechnol， 2015， 148: 289-317.

（本文責(zé)編 郝麗芳）

Advances in metabolic engineering of Escherichia coli for isoprene biosynthesis

Jing Guo1,2, Yujin Cao1, Mo Xian1, and Huizhou Liu1

1 CAS Key Laboratory of Biobased Materials， Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology， Chinese Academy of Sciences， Qingdao 266101， Shandong， China

2 University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China

As an important industrial chemical， isoprene is mainly used as a precursor for synthetic rubbers. In addition， it also has wide applications in the field of pharmaceutical and chemical intermediates， food， adhesives and aviation fuel. Compared with conventional petrochemical routes， production of isoprene in microbial systems has been the research focus considering environment friendly and sustainable development features. This article summarizes the metabolic pathwaysand key enzymes of isoprene biosynthesis， review s current methods and strategies in improving isoprene production of Escherichia coli， and also gives some basic ideas and expectation.

December 9， 2015； Accepted: February 3， 2016

Huizhou Liu. Tel: +86-532-80662766； Fax: +86-532-80662765； E-mail: liuhuizhou@qibebt.ac.cn

isoprene， synthetic rubber， Escherichia coli， metabolic engineering

Supported by: National Natural Science Foundation of China （No. 21572242）， Taishan Scholars Climbing Program of Shandong （No. TSPD20150210）.

國(guó)家自然科學(xué)基金 （No. 21572242），泰山學(xué)者攀登計(jì)劃 （No. TSPD20150210） 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-07 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160307.1412.005.html